一種制備細菌生物膜抑制劑的方法
【專利摘要】一種利用天然成分復(fù)配制備細菌生物膜天然抑制劑的方法，其特征步驟為：將干牛蒡葉充分粉碎。加入水，進行復(fù)合酶酶解，得到牛蒡葉水提液，濃縮得到濃縮物a。然后向酶解過的牛蒡葉渣中，加入乙醇溶液，超聲微波協(xié)同萃取，過濾，濃縮得提取物b。將濃縮物a和b合并，分散在水中，上柱進行柱層析，進行梯度洗脫，得到乙醇洗脫物，將乙醇洗脫物與茶多酚復(fù)配，即為細菌生物膜天然抑制劑。本發(fā)明利用超聲微波協(xié)同萃取技術(shù)與生物酶技術(shù)進行提取，大大縮短了提取時間，提高了提取率，再采用柱層析技術(shù)進行純化，得到了抑制生物膜活性較強的牛蒡葉組分，再與茶多酚進行復(fù)配，得到了抑制生物膜活性強的天然抑制劑。
【專利說明】一種制備細菌生物膜抑制劑的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物領(lǐng)域，本發(fā)明涉及以天然組分復(fù)配制備細菌生物膜天然抑制劑的方法，包括利用超聲微波協(xié)同萃取技術(shù)、酶技術(shù)與柱層析技術(shù)制備生物膜天然抑制劑的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]據(jù)統(tǒng)計，我國牛蒡產(chǎn)量大，如牛蒡根在徐州地區(qū)的畝產(chǎn)達1500Kg，葉子約為每畝1000Kgo牛蒡葉基本全部廢棄，造成了嚴重的資源浪費，而且容易污染環(huán)境。而牛蒡葉中含有的有效成分具有抗菌能力。因此對牛蒡葉中的多酚成分進行開發(fā)利用，既可以綜合利用廢棄資源，又可以制備大量的活性成分，具有重要的經(jīng)濟、社會意義。
[0003]在食品等行業(yè)，細菌生物膜是一個頑固的污染源，造成食品變質(zhì)，而且是公共健康問題的起因。而且，生物膜細菌對抗生素和殺菌消毒劑的耐藥性比浮游的非生物膜細菌強10-1000倍，傳統(tǒng) 的清洗和消毒療法對生物膜的控制效率很低。因此，尋找與制備細菌生物膜抑制劑對提高食品安全水平、保障公民健康具有重要意義。
[0004]目前，關(guān)于生物膜抑制劑的研究才剛起步。有研究表明，多酚成分具有較強的生物膜抑制活性，牛蒡葉富含多酚成分，是一種能夠抑制生物膜的良好資源。然而關(guān)于牛蒡葉中生物膜抑制劑的研究較少，采用超聲微波輔助提取及柱層析技術(shù)從牛蒡葉中分離制備生物膜抑制劑的研究未見報道。本發(fā)明首先采用新技術(shù)制備生物膜抑制劑，然后與能夠抑制細菌生物膜的茶多酚復(fù)配，前期研究表明兩者具有協(xié)同增效作用，兩者混合復(fù)配后得到一種活性更強的細菌生物膜抑制劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種制備細菌生物膜抑制劑的方法，以牛蒡加工的副產(chǎn)物牛蒡葉為原料，分離制備得到乙醇組分，再與茶多酚復(fù)配，得到細菌生物膜天然抑制劑。這種方法能夠充分利用牛蒡葉資源，并且能夠提供高效的細菌生物膜天然抑制劑，為牛蒡的綜合利用與深加工提供了新的方法。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案:提供一種制備細菌生物膜抑制劑的方法，包括如下步驟:
[0007](I)將干牛蒡葉粉碎，過篩，干牛蒡葉粉碎至50-200目以下，將牛蒡葉粉末與溶劑混合，以水為溶劑，牛蒡葉粉末與溶劑的質(zhì)量比為1: 5-1: 100。加入復(fù)合酶進行酶解，復(fù)合酶由纖維素酶和蛋白酶組成，纖維素酶與蛋白酶的質(zhì)量比為1: 0.5-1: 5，復(fù)合酶的添加量為0.l-100mg/g(牛蒡葉)，酶解完成后過濾，得到牛蒡葉水提液，30-90°C減壓濃縮至無溶劑，得到濃縮物a。所得牛蒡葉殘渣待用。
[0008](2)在牛蒡葉殘渣中加入5% -90%的乙醇溶液作為溶劑，乙醇溶液與實驗開始時所用的牛蒡葉粉末的質(zhì)量比為1: 1-100: 1，進行超聲微波協(xié)同萃取，超聲波功率為
0.05-100KW，微波功率為0.1-2500KW，提取時間為0.2_1500min，過濾。將上清液30_90°C減壓濃縮至無溶劑，得到濃縮物b。[0009](3)將濃縮物a和b合并，分散于水中，合并后的濃縮物與水的質(zhì)量比為1:1-1: 50，得到懸液，上柱進行層析，層析柱的填料為大孔樹脂、聚酰胺樹脂或者離子交換樹脂，懸液與樹脂的質(zhì)量比為1: 2-1: 100，依次分別用不同濃度的乙醇溶液進行梯度洗脫，每個梯度洗脫的體積為1-10個柱體積(BV)，乙醇溶液中乙醇的質(zhì)量濃度為0-70%。分別收集洗脫液，得到不同濃度乙醇溶液的系列洗脫溶液。
[0010](4)將某些濃度的乙醇溶液的洗脫溶液合并，30_90°C減壓濃縮，20-100°C真空干燥或80-130°C噴霧干燥或0.5-200KW微波輔助干燥。得到乙醇溶液洗脫組分。
[0011](5)將得到的乙醇洗脫組分與純度為70% -99%的茶多酚混合，茶多酚與牛蒡葉乙醇洗脫物的質(zhì)量比為1: 2-1: 10，復(fù)配得到的即為細菌生物膜天然抑制劑。
[0012]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明利用超聲微波協(xié)同萃取技術(shù)與生物酶技術(shù)進行提取，大大縮短了提取時間，提高了提取率，再采用柱層析技術(shù)、梯度洗脫進行純化，得到了對細菌生物膜具有一定抑制活性的牛蒡葉柱層析組分。然后將牛蒡葉活性組分與具有生物膜抑制活性的茶多酚進行混合復(fù)配，兩者協(xié)同增效，得到活性很強的細菌生物膜抑制劑。本發(fā)明的細菌生物膜抑制劑對食源性致病菌生物膜的抑制能力強，測得所制備的生物膜抑制劑完全抑制金黃色葡萄球菌生物膜的最小濃度為0.1-0.25mg/mlo
【具體實施方式】
[0013]以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述，但本發(fā)明不局限于這些實例。
[0014]實施例1
[0015]取干牛蒡葉10g，將干牛蒡葉粉碎至200目以下，然后將牛蒡葉粉末與水混合，牛蒡葉粉末與水的質(zhì)量比為1: 20。加入復(fù)合酶進行酶解，纖維素酶與蛋白酶的質(zhì)量比為I: 1，復(fù)合酶的添加量為3mg/g(牛蒡葉)，酶解完成后過濾，得到牛蒡葉水提液，50°C減壓濃縮至無溶劑，得到濃縮物a。所得牛蒡葉殘渣待用。在牛蒡葉殘渣中加入15%的乙醇溶液作為溶劑，乙醇溶液與實驗開始時所用的牛蒡葉粉末的質(zhì)量比為2: 1，進行超聲微波協(xié)同萃取，超聲波功率為500w，微波功率為400w，提取時間為1.5min，過濾。將上清液50°C減壓濃縮至無溶劑，得到濃縮物b。將濃縮物a和b合并，分散于水中，合并后的濃縮物與水的比例為1: 6，得到懸液，上大孔樹脂柱進行層析，懸液與大孔樹脂的質(zhì)量比為1: 5，依次分別采用水、5%乙醇溶液、40%乙醇溶液進行梯度洗脫，水洗脫的體積為2BV，5%乙醇溶液的洗脫體積為1BV，40%乙醇溶液的洗脫體積為3BV，分別收集洗脫液。將40%乙醇溶液的洗脫液50°C減壓濃縮，60°C真空干燥，得到乙醇溶液洗脫組分。將得到的乙醇洗脫組分與純度為80%的茶多酚按照質(zhì)量比5: 2混合，即為細菌生物膜天然抑制劑。
[0016]實施例2
[0017]將干牛蒡葉粉碎至100目以下，將200g牛蒡葉粉末與水混合，牛蒡葉粉末與水的質(zhì)量比為1: 6。加入復(fù)合酶進行酶解，纖維素酶與蛋白酶的質(zhì)量比為1: 2，復(fù)合酶的添加量為lmg/g(牛蒡葉)，酶解完成后過濾，得到牛蒡葉水提液，65°C減壓濃縮至無溶劑，得到濃縮物a。在牛蒡葉殘渣中加入30%的乙醇溶液作為溶劑，乙醇溶液與實驗開始時所用的牛蒡葉粉末的質(zhì)量比為5: 1，進行超聲微波協(xié)同萃取，超聲波功率為500w，微波功率為600w，提取時間為7min，過濾。將上清液55°C減壓濃縮至無溶劑，得到濃縮物b。將濃縮物a和b合并，分散于水中，合并后的濃縮物與水的比例為1: 5，得到懸液，上聚酰胺樹脂柱進行層析，懸液與聚酰胺樹脂的質(zhì)量比為1: 10，依次分別采用水、10%乙醇溶液、30%乙醇溶液，60%乙醇溶液進行梯度洗脫，水洗脫的體積為2BV，10%乙醇溶液的洗脫體積為2BV，30%乙醇溶液的洗脫體積為3BV，60%乙醇溶液的洗脫體積為2BV。分別收集洗脫液，將30%乙醇溶液的洗脫液與60%乙醇溶液的洗脫液合并，65°C減壓濃縮，95°C噴霧干燥，得到乙醇溶液洗脫組分，將此洗脫組分與純度為90%的茶多酚混合，乙醇溶液洗脫組分與茶多酚的質(zhì)量比為5: 1，得到的復(fù)配物即為細菌生物膜抑制劑。
[0018]實施例3
[0019]取牛蒡葉lOOOg，粉碎至50目以下，將牛蒡葉粉末與30升水混合，加入50g復(fù)合酶進行酶解，纖維素酶與蛋白酶的質(zhì)量比為2: 1，酶解完成后過濾，得到牛蒡葉水提液，65°C減壓濃縮至無溶劑，得到濃縮物a。在牛蒡葉殘渣中加入5000ml40%的乙醇溶液作為溶劑，進行超聲微波協(xié)同萃取，超聲波功率為500w，微波功率為900w，提取時間為20min，過濾。將上清液60°C減壓濃縮至無溶劑，得到濃縮物b。將濃縮物a和b合并，分散于水中，合并后的濃縮物與水的比例為1: 9，得到懸液，上大孔樹脂柱進行層析，懸液與大孔樹脂的質(zhì)量比為1: 10，依次分別采用水、6%乙醇溶液、35%乙醇溶液進行梯度洗脫，水洗脫的體積為3BV，6%乙醇溶液的洗脫體積2BV，35%乙醇溶液的洗脫體積為4BV。分別收集洗脫液。將35%乙醇溶液的洗脫溶液60°C減壓濃縮，70°C真空干燥，得到乙醇溶液洗脫組分，將這些乙醇溶液洗脫組分與純度為95%的茶多酚混合，乙醇洗脫組分與茶多酚的質(zhì)量比為10: 1，即為細菌生物膜抑制劑。
[0020]實施例4
[0021]細菌生物膜抑制活性的測定方法:
[0022]主要采用結(jié) 晶紫染色法進行分析。分別加對數(shù)生長期的菌液(IOOul)及細菌生物膜天然抑制劑溶液(100ul/50ul)于24孔PVC板，加入一定毫升培養(yǎng)基，使之與菌液、抑制劑之和為1ml，同時留一排只加培養(yǎng)基作為空白對照組，再留一排加菌液和培養(yǎng)基、不加入藥物作為正對照組，培養(yǎng)24h。吸掉培養(yǎng)物，用無菌生理鹽水沖洗，然后甩干或者拍干，在室溫下風(fēng)干。然后加入0.5ml I %的結(jié)晶紫染色15min，棄去多余染液后，用去離子水沖洗2遍，加入95%的乙醇,放置5min,然后將溶液移至另一塊96孔板,酶標(biāo)儀570nm進行檢測。
[0023]抑制率計算方法:細菌生物膜天然抑制劑對細菌生物膜的抑制率=(加抑制劑之組的平均吸光度-空白對照組的平均吸光度)/(正對照組的平均吸光度-空白對照組的平均吸光度)
[0024]抑制率達到100%的最小抑制劑濃度即為抑制細菌生物膜的最小濃度。
[0025]測定得出，本發(fā)明的細菌生物膜抑制劑對金黃色葡萄球菌生物膜的最小抑制濃度為 0.1-0.25mg/ml。
【權(quán)利要求】
1.一種制備細菌生物膜抑制劑的方法，其特征步驟為: (1)將干牛蒡葉粉碎，過篩；將牛蒡葉粉末與水混合，加入復(fù)合酶進行酶解，過濾，得到牛蒡葉水提液，濃縮至無溶劑，得到濃縮物a。所得牛蒡葉殘渣待用。 (2)在牛蒡葉殘渣中加入乙醇溶液作為溶劑，超聲微波協(xié)同萃取，過濾。將上清液濃縮至無溶劑，得到濃縮物b。 (3)將濃縮物a和b合并，分散于水中，得到懸液，上柱進行層析，依次分別采用不同濃度的乙醇溶液進行梯度洗脫，分別收集洗脫液，得到系列洗脫溶液。 (4)將某些梯度的乙醇溶液洗脫液濃縮，干燥，得到乙醇溶液洗脫組分。 (5)將得到的乙醇洗脫組分與茶多酚混合復(fù)配，即為細菌生物膜天然抑制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備細菌生物膜抑制劑的方法，其特征是步驟(1)條件為:干牛蒡葉粉碎至50-200目以下，牛蒡葉粉末與溶劑的質(zhì)量比為1: 5-1: 100。在牛蒡葉與水的混合物 中，加入纖維素酶、蛋白酶組成的復(fù)合酶進行酶解，纖維素酶與蛋白酶的質(zhì)量比為I: 0.5-1: 5，復(fù)合酶的添加量為0.l-100mg/g(牛蒡葉)，30-90°C減壓濃縮。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備細菌生物膜抑制劑的方法，其特征是步驟(2)超聲微波協(xié)同萃取，其條件為:在步驟⑴得到的牛蒡葉殘渣中加入溶劑，溶劑是質(zhì)量分數(shù)為5% -90%的乙醇溶液，乙醇溶液與實驗開始時所用的牛蒡葉粉末的質(zhì)量比為1: 1-100: 1，并進行超聲微波協(xié)同萃取。超聲波功率為0.05-100KW，微波功率為0.1-2500KW，提取時間為 0.2-1500min，30-90°C減壓濃縮。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備細菌生物膜抑制劑的方法，其特征是步驟(3)條件為:層析柱填料為大孔樹脂或聚酰胺樹脂或離子交換樹脂，合并后的濃縮物與水的質(zhì)量比為1: 1-1: 50，懸液與樹脂的質(zhì)量比為1: 2-1: 100，洗脫用的乙醇溶液質(zhì)量濃度為0-70%,分2-5個梯度進行洗脫，每個梯度洗脫的體積為1-10個柱體積(BV)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備細菌生物膜抑制劑的方法，其特征是步驟(4)條件為:30-90 V減壓濃縮，20-100 °C真空干燥或80-130 V噴霧干燥或0.5-200Kw微波輔助干燥。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備細菌生物膜抑制劑的方法，其特征是步驟(5)條件為:茶多酚的純度為70-99%，茶多酚與牛蒡葉乙醇洗脫物的質(zhì)量比為1: 2-1: 10。
【文檔編號】A01N65/12GK103960299SQ201310040028
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年2月1日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月1日
【發(fā)明者】婁在祥, 王洪新, 李雅芹 申請人:江南大學(xué)