一種利用牛蒡葉制備霉菌抑制劑的方法
【專利摘要】一種利用牛蒡葉制備霉菌抑制劑的方法，其特征步驟為：將干牛蒡葉充分粉碎。加入水，進(jìn)行復(fù)合酶酶解，得到牛蒡葉水提液，濃縮得到濃縮物a。然后向酶解過的牛蒡葉渣中，加入乙醇溶液，超聲微波協(xié)同萃取，過濾，濃縮得提取物b。將濃縮物a和b合并，分散在水中，上大孔樹脂柱層析，溶劑洗脫，所得乙醇洗脫物即為霉菌天然抑制劑。本發(fā)明利用超聲微波協(xié)同萃取技術(shù)與生物酶技術(shù)進(jìn)行提取，大大縮短了提取時間，提高了提取率，再采用柱層析技術(shù)進(jìn)行純化，得到了活性較強(qiáng)的霉菌天然抑制劑。
【專利說明】一種利用牛蒡葉制備霉菌抑制劑的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物領(lǐng)域，本發(fā)明涉及以牛蒡葉為原料制備霉菌天然抑制劑的方法，特別是利用超聲微波協(xié)同萃取技術(shù)、酶技術(shù)與柱層析技術(shù)制備霉菌天然抑制劑的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]據(jù)統(tǒng)計，我國牛蒡產(chǎn)量大，如牛蒡根在徐州地區(qū)的畝產(chǎn)達(dá)1500Kg，葉子約為每畝1000Kgo牛蒡葉基本全部廢棄，造成了嚴(yán)重的資源浪費，而且容易污染環(huán)境。而牛蒡葉中含有的有效成分具有抗菌能力。因此對牛蒡葉中的多酚成分進(jìn)行開發(fā)利用，既可以綜合利用廢棄資源，又可以制備大量的霉菌抑制活性成分，具有重要的經(jīng)濟(jì)、社會意義。
[0003]目前，食品加工、儲藏等領(lǐng)域所用的霉菌抑制劑，絕大部分都是人工合成的，食用過多時會引起許多危害人體健康的問題。隨著人們生活水平的快速提高，人們對于合成的添加劑越來越不信任，而對于綠色、天然的添加劑表現(xiàn)出越來越多的興趣，人們對于霉菌天然抑制劑的需求日益增長。與此同時，愈來愈多的學(xué)者開始關(guān)注并研究天然成分，包括各種天然成分的制備及抗霉菌活性的評價。眾多研究表明，許多多酚成分具有較強(qiáng)的霉菌抑制活性，牛蒡葉富含 多酚成分，是一種能夠抑制霉菌的良好資源。然而關(guān)于牛蒡葉中霉菌抑制劑的研究較少，采用超聲微波輔助提取及柱層析技術(shù)從牛蒡葉中分離制備霉菌抑制劑的研究未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種利用牛蒡葉制備霉菌抑制劑的方法，以牛蒡加工的副產(chǎn)物牛蒡葉為原料，分離制備霉菌天然抑制劑。這種方法能夠充分利用牛蒡葉資源，并且能夠提供高效的霉菌天然抑制劑，為牛蒡的綜合利用與深加工提供了新的方法。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案:提供一種利用牛蒡葉制備霉菌抑制劑的方法，包括如下步驟:
[0006](I)將干牛蒡葉粉碎，過篩，干牛蒡葉粉碎至50-200目以下，將牛蒡葉粉末與溶劑混合，以水為溶劑，牛蒡葉粉末與溶劑的質(zhì)量比為1: 5-1: 100。加入復(fù)合酶進(jìn)行酶解，復(fù)合酶由纖維素酶和蛋白酶組成，纖維素酶與蛋白酶的質(zhì)量比為1: 0.5-1: 5，復(fù)合酶的添加量為0.l-100mg/g(牛蒡葉)，酶解完成后過濾，得到牛蒡葉水提液，30-90°C減壓濃縮至無溶劑，得到濃縮物a。所得牛蒡葉殘渣待用。
[0007](2)在牛蒡葉殘渣中加入5% -90%的乙醇溶液作為溶劑，乙醇溶液與實驗開始時所用的牛蒡葉粉末的質(zhì)量比為1: 1-100: 1，進(jìn)行超聲微波協(xié)同萃取，超聲波功率為
0.05-100KW，微波功率為0.1-2500KW，提取時間為0.2_1500min，過濾。將上清液30_90°C減壓濃縮至無溶劑，得到濃縮物b。
[0008](3)將濃縮物a和b合并，分散于水中，合并后的濃縮物與水的質(zhì)量比為1: 1-1: 50，得到懸液，上大孔樹脂柱進(jìn)行層析，懸液與大孔樹脂的質(zhì)量比為1:2-1: 100，依次分別采用水和乙醇溶液進(jìn)行洗脫，水洗脫的體積為1-10個柱體積(BV)，乙醇溶液的洗脫體積為1-10BV，乙醇溶液中乙醇的質(zhì)量濃度為5% -60%。分別收集洗脫液，得到水洗脫溶液和乙醇溶液洗脫溶液。
[0009](4)將乙醇溶液洗脫溶液30_90°C減壓濃縮，20-100°C真空干燥或80_130°C噴霧干燥或0.5-200KW微波輔助干燥。得到乙醇溶液洗脫組分，即為天然霉菌抑制劑。
[0010]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明利用超聲微波協(xié)同萃取技術(shù)與生物酶技術(shù)進(jìn)行提取，大大縮短了提取時間，提高了提取率，再采用柱層析技術(shù)進(jìn)行純化，得到了活性較強(qiáng)的霉菌天然抑制劑。對水果青霉病菌等霉菌的抑制能力較強(qiáng)，測得所制備的霉菌抑制劑抑制青霉病菌的MIC為0.5-lmg/ml。
【具體實施方式】
[0011]以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)-步的詳細(xì)描述，但本發(fā)明不局限于這些實例。
[0012]實施例1
[0013]取干牛蒡葉5g，將干牛蒡葉粉碎至100目以下，然后將牛蒡葉粉末與水混合，牛蒡葉粉末與水的質(zhì)量比為1: 10。加入復(fù)合酶進(jìn)行酶解，纖維素酶與蛋白酶的質(zhì)量比為I: 1，復(fù)合酶的添加量為lrng/g(牛蒡葉)，酶解完成后過濾，得到牛蒡葉水提液，50°C減壓濃縮至無溶劑，得到濃縮物a。所得牛蒡葉殘渣待用。
[0014]在牛蒡葉殘渣中加入10%的乙醇溶液作為溶劑，乙醇溶液與實驗開始時所用的牛蒡葉粉末的質(zhì)量比為2: 1，進(jìn)行超聲微波協(xié)同萃取，超聲波功率為500w，微波功率為200w，提取時間為lmin，過濾。將上清液50°C減壓濃縮至無溶劑，得到濃縮物b。將濃縮物a和b合并，分散于水中，合并后的濃縮物與水的比例為1: 6，得到懸液，上大孔樹脂柱進(jìn)行層析，懸液與大孔樹脂 的質(zhì)量比為1: 5，依次分別采用水和20%乙醇溶液進(jìn)行洗脫，水洗脫的體積為2BV，乙醇溶液的洗脫體積為3BV，分別收集洗脫液。將乙醇溶液洗脫溶液50°C減壓濃縮，60°C真空干燥，得到乙醇溶液洗脫組分，即為天然霉菌抑制劑。
[0015]實施例2
[0016]將干牛蒡葉粉碎至50目以下，將100g牛蒡葉粉末與水混合，牛蒡葉粉末與水的質(zhì)量比為1: 5。加入復(fù)合酶進(jìn)行酶解，纖維素酶與蛋白酶的質(zhì)量比為1: 2，復(fù)合酶的添加量為0.5mg/g(牛蒡葉)，酶解完成后過濾，得到牛蒡葉水提液，60°C減壓濃縮至無溶劑，得到濃縮物a。在牛蒡葉殘渣中加入20%的乙醇溶液作為溶劑，乙醇溶液與實驗開始時所用的牛蒡葉粉末的質(zhì)量比為10: 1，進(jìn)行超聲微波協(xié)同萃取，超聲波功率為lKw，微波功率為IKw,提取時間為8min，過濾。將上清液55°C減壓濃縮至無溶劑，得到濃縮物b。將濃縮物a和b合并，分散于水中，合并后的濃縮物與水的比例為1: 5，得到懸液，上大孔樹脂柱進(jìn)行層析，懸液與大孔樹脂的質(zhì)量比為1: 3，依次分別采用水和30%乙醇溶液進(jìn)行洗脫，水洗脫的體積為4BV，乙醇溶液的洗脫體積為5BV，分別收集洗脫液，得到水洗脫溶液和乙醇溶液洗脫溶液。將乙醇溶液洗脫溶液65°C減壓濃縮，950C噴霧干燥，得到乙醇溶液洗脫組分，即為天然霉菌抑制劑。
[0017]實施例3
[0018]取牛蒡葉lOOOg，粉碎至200目以下，將牛蒡葉粉末與40升水混合，加入20g復(fù)合酶進(jìn)行酶解，纖維素酶與蛋白酶的質(zhì)量比為2: 1，酶解完成后過濾，得到牛蒡葉水提液，65°C減壓濃縮至無溶劑，得到濃縮物a。在牛蒡葉殘渣中加入4000ml35%的乙醇溶液作為溶劑，進(jìn)行超聲微波協(xié)同萃取，超聲波功率為lKw，微波功率為2Kw，提取時間為20min，過濾。將上清液60°C減壓濃縮至無溶劑，得到濃縮物b。將濃縮物a和b合并，分散于水中，合并后的濃縮物與水的比例為1: 9，得到懸液，上大孔樹脂柱進(jìn)行層析，懸液與大孔樹脂的質(zhì)量比為1: 10，依次分別采用水和30%乙醇溶液進(jìn)行洗脫，水洗脫的體積為3BV，乙醇溶液的洗脫體積5BV。分別收集洗脫液。將乙醇溶液洗脫溶液65°C減壓濃縮，70°C真空干燥， 得到乙醇溶液洗脫組分，即為天然霉菌抑制劑。
【權(quán)利要求】
1.一種利用牛蒡葉制備霉菌抑制劑的方法，其特征步驟為: (1)將干牛蒡葉粉碎，過篩；將牛蒡葉粉末與溶劑混合。以水為溶劑，加入復(fù)合酶進(jìn)行酶解，過濾，得到牛蒡葉水提液，濃縮至無溶劑，得到濃縮物a。所得牛蒡葉殘渣待用。 (2)在牛蒡葉殘渣中加入乙醇溶液作為溶劑，超聲微波協(xié)同萃取，過濾。將上清液濃縮至無溶劑，得到濃縮物b。 (3)將濃縮物a和b合并，分散于水中，得到懸液，上大孔樹脂柱進(jìn)行層析，依次分別采用水和乙醇溶液進(jìn)行洗脫，分別收集洗脫液，得到水洗脫溶液和乙醇溶液洗脫溶液。 (4)將乙醇溶液洗脫溶液濃縮，干燥，得到乙醇溶液洗脫組分，即為天然霉菌抑制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用牛蒡葉制備霉菌抑制劑的方法，其特征是步驟(1)條件為:干牛蒡葉粉碎至50-200目以下，牛蒡葉粉末與溶劑的質(zhì)量比為1: 5-1: 100。在牛蒡葉與水的混合物中，加入纖維素酶、蛋白酶組成的復(fù)合酶進(jìn)行酶解，纖維素酶與蛋白酶的質(zhì)量比為I: 0.5-1: 5，復(fù)合酶的添加量為0.l-100mg/g(牛蒡葉)，30-90°C減壓濃縮。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用牛蒡葉制備霉菌抑制劑的方法，其特征是步驟(2)超聲微波協(xié)同萃取，其條件為:在步驟(1)得到的牛蒡葉殘渣中加入溶劑，溶劑是質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5% -90%的乙醇溶液，乙醇溶液與實驗開始時所用的牛蒡葉粉末的質(zhì)量比為1: 1-100: 1，并進(jìn)行超聲微波協(xié)同萃取。超聲波功率為0.05-100KW，微波功率為0.1-2500KW，提取時間為 0.2-1500min，30-90°C減壓濃縮。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用牛蒡葉制備霉菌抑制劑的方法，其特征是步驟(3)條件為:層析柱填料為大孔樹脂，合并后的濃縮物與水的質(zhì)量比為1: 1-1: 50，懸液與大孔樹脂的質(zhì)量比為1: 2-1: 100，水洗脫的體積為1-10個柱體積(BV)，乙醇溶液的洗脫體積為1-10BV，乙醇溶液中乙醇的質(zhì)量濃度為5% -60%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用牛蒡葉制備霉菌抑制劑的方法，其特征是步驟(4)條件為:30-90 V減壓濃縮，20-100 °C真空干燥或80-130 V噴霧干燥或0.5-200Kw微波輔助干燥。
【文檔編號】A01P3/00GK103960300SQ201310040029
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年2月1日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月1日
【發(fā)明者】婁在祥, 王洪新, 李雅芹 申請人:江南大學(xué)