專利名稱：牽牛子離體胚軸植株再生的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，特別適用于牽牛子離體胚軸植株再生的方法。
背景技術(shù)：
牽牛子系旋花科植物裂葉牽牛iPharbitis nil L.)或圓葉牽牛ipharbitispurpurea L.)的成熟種子。牽牛子始載于名醫(yī)別錄，又名黑丑、白丑。具有瀉水通便消痰滌飲殺蟲攻積的功效，用于治療水腫脹滿、二便不通、痰飲積聚氣逆喘咳、蟲積腹痛及蛔蟲、絳蟲病等?，F(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)亦多見有關(guān)牽牛子的報(bào)道，如在利用鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的分子模型篩選針對(duì)老年癡呆癥的天然藥物時(shí)，發(fā)現(xiàn)牽牛子粗提物具有明顯激活鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的作用，并有藥理試驗(yàn)證明它能明顯改善記憶，目前市場(chǎng)的需求量很大且在年年增加。牽牛為I年生纏繞性草本植物，秋末果實(shí)成熟、果殼未開裂時(shí)采割植株，曬干，打下種子。目前入藥的牽牛子來(lái)自野生種和栽培種的都有，野生種因生長(zhǎng)分散，采收種子非常不容易，總體品質(zhì)也較差；種植牽牛存在著種子質(zhì)量差異大、保存期短、發(fā)芽率低、發(fā)芽時(shí)間差別大、幼苗生長(zhǎng)緩慢等問(wèn)題；采用扦插、分株、貯根等方法繁殖牽牛子種苗，常常因?yàn)楦腥静『?、真菌和?xì)菌等，造成病毒長(zhǎng)期累積而導(dǎo)致牽牛子產(chǎn)量及效力降低；另外，種子采收每年只有一次，產(chǎn)量有限，很難滿足實(shí)際需求。應(yīng)用植物組織培養(yǎng)方法生產(chǎn)藥用植物是一個(gè)理想的選擇，這種方法通過(guò)培養(yǎng)植物的離體器官、組織或細(xì)胞產(chǎn)生完整植株，組織培養(yǎng)中的細(xì)胞生長(zhǎng)速度要比植物正常生長(zhǎng)速度快，接近于分生組織的生長(zhǎng)速度，亦可以將各種初級(jí)化合物，轉(zhuǎn)化成醫(yī)藥上更有效的化合物，并且具有不受地區(qū)、季節(jié)與氣候限制，便于工廠化生產(chǎn)等優(yōu)勢(shì)。植物的組織，甚至單個(gè)細(xì)胞都具有再生能力，因此利用組織培養(yǎng)手段快速繁殖藥用植物種苗，或者利用組織培養(yǎng)或細(xì)胞培養(yǎng)手段直接生產(chǎn)藥物便隨之日益發(fā)展。植物組織培養(yǎng)技術(shù)中，激素或生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)離體培養(yǎng)組織的分化起著重要的作用，激素的種類、相對(duì)濃度和絕對(duì)濃度直接影響根和芽再生，培養(yǎng)組織內(nèi)的激素水平與再生過(guò)程關(guān)系密切，另外，由于同一植物的不同部位的再生能力差異很 大，不同器官的組織培養(yǎng)需要不同的方法和培養(yǎng)基配比，因此，不同的植物或器官對(duì)組織培養(yǎng)的方法有不同的要求。到目前為止，有關(guān)牽牛子的組織培養(yǎng)技術(shù)或方法還未見有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于利用組織培養(yǎng)技術(shù)，提供一種用于牽牛子離體胚軸植株再生的方法。本發(fā)明采用圓葉牽牛的種子一牽牛子，通過(guò)組織培養(yǎng)的方法，取其無(wú)菌苗的胚軸離體培養(yǎng)獲得牽牛子再生植株，技術(shù)方案由“建立無(wú)菌苗培養(yǎng)體系一胚軸誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽一繼代增殖培養(yǎng)得到分化芽一培養(yǎng)生根苗一練苗移栽獲得再生植株”五個(gè)環(huán)節(jié)組成，無(wú)菌苗由圓葉牽牛種子經(jīng)過(guò)處理接種于MS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得，使用O. 1%氯化汞溶液進(jìn)行種子表面消毒的時(shí)間控制為IOmin ;無(wú)菌苗胚軸誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽所用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+1. O 2. Omg/1 ΒΑ+0.1 O. 2mg/l AA+3%蔗糖+0. 9%瓊脂；不定芽經(jīng)繼代增殖培養(yǎng)得到分化芽所用的增殖培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+1.0 2. O mg/1 BA + O.1 O. 2mg/l AA+ 3%蔗糖+ O. 9%瓊脂；分化芽培養(yǎng)生根苗所用的生根培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基+0. 3 O. 5mg/lNAA+ 3%蔗糖+0. 9%瓊脂；生根苗的根長(zhǎng)至Icm左右時(shí)進(jìn)行練苗移栽，培植成再生植株，技術(shù)方案的前4個(gè)環(huán)節(jié)在無(wú)菌條件下進(jìn)行，煉苗移栽培養(yǎng)基質(zhì)為滅菌草炭+珍珠巖=2:1。本發(fā)明的技術(shù)方案通過(guò)以下步驟完成
步驟1.建立無(wú)菌苗培養(yǎng)體系，獲得無(wú)菌苗種子處理是挑選成熟飽滿的圓葉牽牛種子，流水沖洗20min，放入75%乙醇中浸泡30s，取出，用無(wú)菌水沖洗3_5次，加入O.1 %氯化汞溶液中，進(jìn)行種子表面消毒，控制消毒時(shí)間lOmin，時(shí)間不足達(dá)不到消毒效果，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)影響種子發(fā)芽率，將消毒好的種子取出用無(wú)菌水沖洗4-5次后接種于MS固體培養(yǎng)基上，整個(gè)操作在超凈工作臺(tái)進(jìn)行，最后將接種后的MS固體培養(yǎng)基放入培養(yǎng)室，培養(yǎng)20 25d，獲得無(wú)菌苗。步驟2.胚軸誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽將步驟I中無(wú)菌苗的胚軸切成O. 3 O. 5cm大小的段兒，置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng) ，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+1.0 2. Omg/1 6-BA + O.1
O.2mg/l NAA+ 3%蔗糖+ O. 9%瓊脂，pH5. 8-6. O, 7 9d即產(chǎn)生黃綠色愈傷，15 20d分化出不定芽。步驟3.繼代增殖培養(yǎng)得到叢生芽將步驟2分化出的不定芽切分后置于增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，增殖培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+1. O 2. Omg/1 6-BA+0.1 O. 2mg/l NAA+3%蔗糖+0. 9%瓊脂，pH5. 8-6. O,培養(yǎng)13 17d分化成叢生芽，芽的增殖數(shù)量達(dá)到6_8個(gè)，此過(guò)程可重復(fù)操作，使其不斷增殖。步驟4.培養(yǎng)生根苗，獲得完整植株叢生芽經(jīng)培養(yǎng)長(zhǎng)至約2 3cm高時(shí)，將其分成單株，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，生根培養(yǎng)基為1/2MS + O. 3 O. 5mg/l NAA+ 3%蔗糖+ 0.9%瓊脂，pH5. 8-6.0，7d左右可分化出不定根，形成完整的牽牛子植株一生根苗，生根率達(dá)100%。以上4個(gè)步驟均在無(wú)菌條件下進(jìn)行，培養(yǎng)條件同為溫度25±2° C，光照時(shí)間12h/d，光照強(qiáng)度2000 3000Lux，夜間保持黑暗。步驟5.練苗移栽當(dāng)生根苗的根長(zhǎng)到Icm左右時(shí)將生根苗轉(zhuǎn)移到智能溫室，在自然光照下馴化3天，使生根苗逐漸適應(yīng)周圍環(huán)境，取出生根苗洗凈根部的附著物，用O. 1%的高錳酸鉀溶液浸苗消毒lmin，移入苗床進(jìn)行種苗培育，移栽基質(zhì)選用滅菌草炭加珍珠巖，二者比例為2:1，移栽期內(nèi)保持部分遮光和適當(dāng)?shù)臐穸?，長(zhǎng)出新根后，適當(dāng)增加光照，13 15d可至正常生長(zhǎng)，期間每周噴灑I次O. 1%多菌靈，最后移入土壤形成再生植株。本發(fā)明利用植物細(xì)胞的全能性和再生能力，選用牽牛子外植體接種到特制的培養(yǎng)基上，在無(wú)菌的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，產(chǎn)生愈傷組織、長(zhǎng)出不定芽、生出不定根、最終形成再生植株。該發(fā)明技術(shù)使?fàn)颗Ｗ拥姆敝尺_(dá)到如下效果(1)繁殖速度快不受種子發(fā)芽率的影響，選用優(yōu)良母株的外植體，經(jīng)離體培養(yǎng)，一年能繁殖幾萬(wàn)到十幾萬(wàn)株新的優(yōu)良個(gè)體；(2)脫毒本技術(shù)是防止真菌、細(xì)菌、特別是病毒對(duì)牽牛子危害的一項(xiàng)最有效、最快捷、最實(shí)用的方法；(3)輔助育種本技術(shù)可將誘變和篩選出的優(yōu)良品種快速繁殖，提高選擇效率，培育出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病、抗逆性強(qiáng)的新品種；(4)組培苗性狀一致本技術(shù)繁殖的牽牛子能夠保持后代植株的一致性和整齊度，便于工廠化生產(chǎn)的管理，這點(diǎn)對(duì)于藥用植物尤為重要；(5)不受季節(jié)限制本技術(shù)采用人工可控條件，室內(nèi)培養(yǎng)，可以周年生產(chǎn)；(6)節(jié)省土地和資源本方法可在室內(nèi)集中實(shí)施，立體分層生產(chǎn)，集中管理，最大限度地節(jié)省土地、人力等資源。另外，該技術(shù)建立了牽牛子分子育種的受體系統(tǒng)，為以后牽牛子開展轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)受體的培養(yǎng)、開展分子育種目的性狀基因的供體總DNA片段導(dǎo)入、分離目的基因和構(gòu)建重組分子等技術(shù)的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)材料和技術(shù)支持。


圖1為無(wú)菌苗；
圖2為胚軸愈傷及不定芽；
圖3為叢生苗；
圖4為生根苗。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1.
步驟1.建立無(wú)菌苗培養(yǎng)體系，獲得無(wú)菌苗挑選成熟飽滿的圓葉牽牛種子，流水沖洗20min,放入75%乙醇中浸泡30s，取出，用無(wú)菌水沖洗4次，加入O.1 %氯化汞溶液中，進(jìn)行種子表面消毒，控制時(shí)間lOmin，將消毒好的種子取出用無(wú)菌水沖洗4次后接種于MS固體培養(yǎng)基上，整個(gè)操作在超凈工作臺(tái)進(jìn)行，最后將接種后的MS固體培養(yǎng)放入培養(yǎng)室，培養(yǎng)時(shí)間25d，獲得無(wú)菌苗，見圖1。步驟2.胚軸誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽將步驟I中無(wú)菌苗的胚軸切成O. 3 O. 5cm大小，置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+1.0 mg/1 6-BA + O. lmg/1 NAA+ 3%蔗糖+ 0.9%瓊脂，？?jī)?cè).8-6.0，9(1即產(chǎn)生黃綠色愈傷，20d分化出不定芽，見圖2。步驟3.繼代增殖培養(yǎng)將步驟2分化出的不定芽切分后置增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，增殖培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+1. Omg/1 6-BA + O. lmg/1 NAA+ 3%蔗糖+ O. 9%瓊脂，pH5. 8-6. O，培養(yǎng)17d分化成叢生芽，見圖3，芽的增殖數(shù)量為7個(gè)。步驟4.培養(yǎng)生根苗選2 3cm高的叢生芽，將其分成單株，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，生根培養(yǎng)基為1/2MS+0. 3mg/l NAA+3%蔗糖+0. 9%瓊脂，pH5. 8-6. 0，8d即分化出不定根，形成完整的牽牛子植株一生根苗，生根率100%，見圖4。以上4個(gè)步驟均在無(wú)菌條件下進(jìn)行，培養(yǎng)條件同為溫度25±2° C，光照時(shí)間12h/d，光照強(qiáng)度2000 3000Lux，夜間保持黑暗。步驟5.練苗移栽當(dāng)生根苗的根長(zhǎng)到Icm左右時(shí)將生根苗轉(zhuǎn)移到智能溫室，在自然光照下馴化3天，使生根苗逐漸適應(yīng)周圍環(huán)境，取出生根苗洗凈根部的附著物，用O. 1%的高錳酸鉀溶液浸苗消毒lmin，移入苗床進(jìn)行種苗培育，移栽基質(zhì)選用滅菌草炭加珍珠巖，二者比例為2:1，移栽期內(nèi)保持部分遮光和適當(dāng)?shù)臐穸龋L(zhǎng)出新根后，適當(dāng)增加光照，15d可至正常生長(zhǎng)，期間每周噴灑I次O. 1%多菌靈，最后移入土壤形成再生植株。實(shí)施例2.
步驟1.建立無(wú)菌苗培養(yǎng)體系，獲得無(wú)菌苗挑選成熟飽滿的圓葉牽牛種子，流水沖洗20min,放入75%乙醇中浸泡30s，取出，用無(wú)菌水沖洗5次，加入O.1 %氯化汞溶液中，進(jìn)行種子表面消毒，控制時(shí)間lOmin，將消毒好的種子取出用無(wú)菌水沖洗4-5次后接種于MS固體培養(yǎng)基上，整個(gè)操作在超凈工作臺(tái)進(jìn)行，最后將接種后的MS固體培養(yǎng)放入培養(yǎng)室，培養(yǎng)時(shí)間20d，獲得無(wú)菌苗。步驟2.胚軸誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽將步驟I中無(wú)菌苗的胚軸切成O. 3 O. 5cm大小，置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+2. O mg/1 6-BA + O. 2mg/l NAA+ 3%蔗糖+ O. 9%瓊脂，ρΗ5· 8-6. O, 7d即產(chǎn)生黃綠色愈傷，15d分化出不定芽。步驟3.繼代增殖培養(yǎng)將步驟2分化出的不定芽切分后置增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，增殖培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+2. Omg/1 6-BA + O. 2mg/l NAA+ 3%蔗糖+ O. 9%瓊脂，pH5. 8-6. 0，培養(yǎng)14d分化成叢生芽，增殖倍數(shù)為8。步驟4.培養(yǎng)生根苗選2 3cm高的叢生芽，將其分成單株，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，生根培養(yǎng)基為1/2MS+0. 5mg/l NAA+3%蔗糖+0. 9%瓊脂，pH5. 8-6. 0，6d即分化出不定根，形成完整的牽牛子植株一生根苗，生根率100%。以上4個(gè)步驟均在無(wú)菌條件下進(jìn)行，培養(yǎng)條件同為溫度25±2° C，光照時(shí)間12h/d，光照強(qiáng)度2000 3000Lux，夜間保持黑暗。步驟5.練苗移栽當(dāng)生根苗的根長(zhǎng)到Icm左右時(shí)將生根苗轉(zhuǎn)移到智能溫室，在自然光照下馴化3天，使生根苗逐漸適應(yīng)周圍環(huán)境，取出生根苗洗凈根部的附著物，用O. 1%的高錳酸鉀溶液浸苗消毒lmin，移入苗床進(jìn)行種苗培育，移栽基質(zhì)選用滅菌草炭加珍珠巖，二者比例為2:1，移栽期內(nèi)保持部分遮光和適當(dāng)?shù)臐穸?，長(zhǎng)出新根后，適當(dāng)增加光照，13d可至正常生長(zhǎng)，期間每周噴灑I次O. 1%多菌靈，最后移入土壤形成再生植株。實(shí)施例3.
步驟1.建立無(wú)菌苗培養(yǎng)體系，獲得無(wú)菌苗挑選成熟飽滿的圓葉牽牛種子，流水沖洗20min，放入75%乙醇中浸泡30s，取出，用無(wú)菌水沖洗3次，加入O.1 %氯化汞溶液中，進(jìn)行種子表面消毒，控制時(shí)間lOmin，`將消毒好的種子取出用無(wú)菌水沖洗4-5次后接種于MS固體培養(yǎng)基上，整個(gè)操作在超凈工作`臺(tái)進(jìn)行，最后將接種后的MS固體培養(yǎng)放入培養(yǎng)室，培養(yǎng)時(shí)間23d，獲得無(wú)菌苗。步驟2.胚軸誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽將步驟I中無(wú)菌苗的胚軸切成O. 3 O. 5cm大小，置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+1. 5 mg/1 6-BA + O. 15mg/l NAA+ 3%蔗糖+ O. 9%瓊脂，ρΗ5· 8-6. 0，8d即產(chǎn)生黃綠色愈傷，17d分化出不定芽。步驟3.繼代增殖培養(yǎng)將步驟2分化出的不定芽切分后置增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，增殖培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+1.5mg/l 6-BA + O. 15mg/l NAA+ 3%蔗糖+ O. 9%瓊脂，pH5. 8-6. O，培養(yǎng)15d分化成叢生芽，增殖倍數(shù)為6。步驟4.培養(yǎng)生根苗選2 3cm高的叢生芽，將其分成單株，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，生根培養(yǎng)基為1/2MS + O. 4mg/l NAA+ 3%蔗糖+ 0.9%瓊脂，pH5. 8-6. O，7d即分化出不定根，形成完整的牽牛子植株一生根苗，生根率100%。以上4個(gè)步驟均在無(wú)菌條件下進(jìn)行，培養(yǎng)條件同為溫度25±2° C，光照時(shí)間12h/d，光照強(qiáng)度2000 3000Lux，夜間保持黑暗。步驟5.練苗移栽當(dāng)生根苗的根長(zhǎng)到Icm左右時(shí)將生根苗轉(zhuǎn)移到智能溫室，在自然光照下馴化3天，使生根苗逐漸適應(yīng)周圍環(huán)境，取出生根苗洗凈根部的附著物，用O. 1%的高錳酸鉀溶液浸苗消毒lmin，移入苗床進(jìn)行種苗培育，移栽基質(zhì)選用滅菌草炭加珍珠巖，二者比例為2:1，移栽期內(nèi)保持部分遮光和適當(dāng)?shù)臐穸?，長(zhǎng)出新根后，適當(dāng)增加光照，14d可至正常生長(zhǎng)，期間每周噴灑I 次O. 1%多菌靈，最后移入土壤形成再生植株。
權(quán)利要求
1.牽牛子離體胚軸植株再生的方法，其特征在于本方法由“建立無(wú)菌苗培養(yǎng)體系一胚軸誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽一繼代增殖培養(yǎng)得到分化芽一培養(yǎng)生根苗一練苗移栽獲得再生植株”5個(gè)環(huán)節(jié)組成，無(wú)菌苗由圓葉牽牛種子經(jīng)過(guò)處理接種于MS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得；無(wú)菌苗胚軸誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽所用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+1. O 2. Omg/1 ΒΑ+0.1 O. 2mg/lAA+3%蔗糖+0. 9%瓊脂；不定芽經(jīng)繼代增殖培養(yǎng)得到分化芽所用的增殖培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+1. O 2. Omg/1 ΒΑ+0.1 O. 2mg/l AA+3%蔗糖+0. 9%瓊脂；分化芽培養(yǎng)生根苗所用的生根培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基+0. 3 O. 5mg/l NAA+3%蔗糖+0. 9%瓊脂。
2.如權(quán)利要求1所述的牽牛子離體胚軸植株再生的方法，其特征在于種子處理是將成熟飽滿的圓葉牽牛種子，流水沖洗20min，放入75%乙醇中浸泡30s，取出，用無(wú)菌水沖洗3-5次，加入O. 1%氯化汞溶液中，進(jìn)行種子表面消毒，控制消毒時(shí)間lOmin，消毒好的種子取出用無(wú)菌水沖洗4-5次后接種于MS固體培養(yǎng)基上，放入培養(yǎng)室。
3.如權(quán)利要求1所述的牽牛子離體胚軸植株再生的方法，其特征在于建立無(wú)菌苗培養(yǎng)體系、胚軸誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽、繼代增殖培養(yǎng)得到分化芽和培養(yǎng)生根苗4個(gè)環(huán)節(jié)均無(wú)菌條件下進(jìn)行，培養(yǎng)條件同為溫度25±2° C，光照時(shí)間12h/d，光照強(qiáng)度2000 3000Lux，夜間保持黑暗。
4.如權(quán)利要求1所述的牽牛子離體胚軸植株再生的方法，其特征在于無(wú)菌苗培養(yǎng)時(shí)間為20 25d，胚軸誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽時(shí)間為15 20d，繼代增殖培養(yǎng)時(shí)間為13 17d，培養(yǎng)生根苗時(shí)間為7d，生根率為100%，練苗移栽時(shí)間為13 15d。
5.如權(quán)利要求1所述的牽牛子離體胚軸植株再生的方法，其特征在于練苗移栽是在生根苗的根長(zhǎng)到Icm左右時(shí)轉(zhuǎn)移到智能溫室，在自然光照下馴化3天，取出生根苗洗凈根部附著物，用O. 1%的高錳酸鉀溶液浸苗消毒lmin，移入移栽基質(zhì)，每周噴灑I次O. 1%多菌靈，最后移入土壤形成再生植株。
全文摘要
牽牛子離體胚軸植株再生的方法由“建立無(wú)菌苗培養(yǎng)體系—胚軸誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽—繼代增殖培養(yǎng)得到分化芽—培養(yǎng)生根苗—練苗移栽獲得再生植株”5個(gè)環(huán)節(jié)組成，選用圓葉牽牛子外植體接種到特制的培養(yǎng)基上，在無(wú)菌的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，形成再生植株，該方法繁殖速度快，成苗性狀一致，不受季節(jié)限制，并可防止真菌、細(xì)菌、特別是病毒對(duì)牽牛子危害。
文檔編號(hào)A01G31/00GK103053429SQ201310045458
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2013年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月6日
發(fā)明者馬杰, 鄧祖麗穎, 田云芳, 蔣素華, 王默霏, 崔波 申請(qǐng)人:鄭州師范學(xué)院