專利名稱：一種基于als靶酶的抗除草劑油菜定向選育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到一種抗除草劑油菜的選育方法，具體涉及油菜材料的選擇、種子EMS處理方法和除草劑選擇壓下抗性性狀的定向篩選，屬于植物性狀選育方法。
背景技術(shù)：
農(nóng)田雜草嚴重影響油菜產(chǎn)量和品質(zhì)，已成為油菜生產(chǎn)主要生物災(zāi)害之一，推廣應(yīng)用抗除草劑油菜品種，使用化學除草劑進行雜草防治，不僅快速、有效，而且經(jīng)濟實用。與傳統(tǒng)油菜相比，抗除草劑油菜具有農(nóng)事操作簡便、高效，種植者只需在苗期噴施I 2次除草劑就能有效殺滅田間雜草，與人工鋤草相比可節(jié)省勞動力，降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟收益。上世紀九十年代以來，北美的加拿大、美國等已大規(guī)模商業(yè)化種植抗除草劑油菜，取得了較好的經(jīng)劑效益。然而，我國抗除草劑油菜至今尚未獲準商業(yè)化種植，主要有兩個原因:(1)抗除草劑油菜一般為轉(zhuǎn)基因作物，進入商業(yè)化生產(chǎn)必須要經(jīng)過嚴格的安全性評價。(2)迄今為止，國內(nèi)油菜抗除草劑基因主要來自國外，抗性基因受國際知識產(chǎn)權(quán)保護，一旦商業(yè)化種植，需要交納昂貴的專利費，這將大幅度提高油菜生產(chǎn)成本，違背了種植抗除草劑作物的初衷。2004年，我們在油菜和大豆多年輪作的試驗田中發(fā)現(xiàn)了自然突變的抗咪唑啉酮類除草劑的油菜新種質(zhì)M9，經(jīng)多年試驗鑒定，該突變體抗性性狀穩(wěn)定、抗性效應(yīng)明顯，抗咪唑啉酮類除草劑咪唑乙煙酸的濃度是咪唑乙煙酸有效殺草濃度的2倍以上，具有實用價值。遺傳研究表明，該突變體的抗性為顯性性狀，由I對核基因控制，抗性基因在F2和BC1群體中遵循孟德爾遺傳規(guī)律，應(yīng)用雜交、回交等常規(guī)育種方法就可將抗性基因?qū)肽繕似贩N，為選育具有自主知識產(chǎn)權(quán)且不受轉(zhuǎn)基因油菜環(huán)境釋放條件限制的抗除草劑油菜品種奠定了基礎(chǔ)。咪唑啉酮類除草劑是美國氰胺公司在20世紀80年代初期開發(fā)成功的一類廣譜、高活性除草劑，是目前應(yīng)用最廣泛的除草劑之一，其殺草譜廣(包括禾本科和闊葉雜草)、用量低、對哺乳動物低毒和對環(huán)境友好。這類除草劑既可作`土壤處理劑也可莖葉噴施，除草效率高、使用方便深得廣大用戶歡迎。研究表明，乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase,ALS)是咪唑啉酮類除草劑的靶酶，咪唑啉酮類除草劑通過與ALS形成復合物阻斷底物進入酶活性位點通路，抑制ALS活性，導致支鏈氨基酸合成受阻，使植物組織失綠、黃化，最后逐漸死亡。但咪唑啉酮類除草劑為長殘留性除草劑，具有土壤殘留期長和后茬敏感作物的安全性問題。此類除草劑為弱酸性特性，在土壤中既有中性態(tài)，又有陰離子態(tài)，其殘留期是典型的PH依賴型。因土壤pH值不同，其吸咐、淋溶、分解及殘留差異較大。在高pH 土壤中，陰離子態(tài)比例較大，降解迅速，隨著土壤PH降低，中性態(tài)增多，被吸附量相應(yīng)增加，降解緩慢，殘留期延長?；谏鲜鲈蛟擃惓輨﹥H能在一熟季地區(qū)使用，是我國東北大豆產(chǎn)區(qū)的大豆專用除草劑，在長江流域多熟季地區(qū)未能登記發(fā)放。因此，以抗咪唑啉酮類除草劑油菜新種質(zhì)M9選育或轉(zhuǎn)育的油菜抗性品種，不能在我國冬油菜主產(chǎn)區(qū)推廣應(yīng)用，極大地限制了油菜抗咪唑啉酮性狀的應(yīng)用價值。事實上以ALS為靶酶研制開發(fā)的除草劑目前已有五大類，即磺酰脲類(SU)、咪唑啉酮類(頂1)、磺酰胺類(SCT)、嘧啶水楊酸類(PTB)和三唑嘧啶類(TP)，生產(chǎn)上登記發(fā)放的除草劑品種更是不計其數(shù)。由于ALS除草劑具有選擇性強、殺草譜廣、使用劑量低、對哺乳動物毒性小等優(yōu)點，自上世紀80年代早期開發(fā)出來后便得到了廣泛應(yīng)用。但與此同時由于大量連續(xù)使用這類除草劑，使得抗該類除草劑的抗性生物型雜草數(shù)量急劇增加，目前已超過三氮苯類除草劑，成為抗性雜草最為嚴重的一類除草劑。據(jù)不完全統(tǒng)計，全球30多個國家發(fā)現(xiàn)抗乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制劑類除草劑的雜草生物型有98種，其中雙子葉雜草68種，單子葉雜草30種。研究表明抗ALS抑制劑類除草劑的雜草生物型中絕大多數(shù)是由靶標位點改變產(chǎn)生的，由5個必需氨基酸中的一個氨基酸被取代所致。122位(以模式植物擬南芥氨基酸位置計算，下同)丙氨酸被纈氨酸所取代，對咪唑啉酮類除草劑產(chǎn)生抗性。197位脯氨酸被組氨酸、或蘇氨酸、精氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、丙氨酸、或谷氨酰胺所取代，對磺酰脲類除草劑產(chǎn)生很強的抗性，有些位點也會對三唑嘧啶類除草劑產(chǎn)生交互抗性。205位丙氨酸被纈氨酸所取代，對各類ALS靶酶除草劑都具有一定程度的廣譜抗性。574位色氨酸被亮氨酸所取代，對磺酰脲類、咪唑啉酮類和三唑嘧啶類除草劑都具有很強的交互抗性。653位絲氨酸被蘇氨酸或天門冬酰胺所取代，對咪唑啉酮類除草劑具有很強的抗性。上述5個必需氨基酸有3個氨基酸(122位丙氨酸，197位脯氨酸，和205位丙氨酸)位于乙酰乳酸合成酶的氨基端，另2個(574位色氨酸和653位絲氨酸)位于酶的羧基端,這5個氨基酸在絕大多數(shù)已知植物的乙酰乳酸合成酶序列中的位置相當恒定。另外在ALS基因保守功能域以外的其它區(qū)域發(fā)生堿基突變也將產(chǎn)生不同方式的ALS抗性，如569位色氨酸被亮氨酸所取代，對磺酰脲類和咪唑啉酮類除草劑產(chǎn)生抗性。591位色氨酸被亮氨酸所取代，對所有的ALS除草劑產(chǎn)生很強的廣譜抗性。在高等植物中不論是雜草還是作物ALS基因有其共同點，都存在五個不連續(xù)的保守功能域，在這些保守功能域上發(fā)生點突變將導致基于靶位改變的ALS抗性(任雪玲，吳超，楊華錚，基因點突變所引發(fā)的除草劑的抗性問題，化學通報2006年，第I期，9-15 ;張朝賢，倪漢文，魏守輝，黃紅娟，劉延，崔海蘭，隋標峰，張猛，郭峰，雜草抗藥性研究進展，中國農(nóng)業(yè)科學，2009年，42 (4):1274-128)。點突變抗性研究為培育抗性作物提供了理論基礎(chǔ)，利用植物ALS基因的高度保守性和靶標位點改變產(chǎn)生抗ALS抑制劑類除草劑的特性，為選育抗該類除草劑的作物品種提供了新途徑。據(jù)報道應(yīng)用甲基磺酸乙酯(EMS)誘變和組織培養(yǎng)育成抗咪唑啉酮類和抗磺酰脲類除草劑的玉米品種，用亞硝基脲乙酯誘變和小孢子培養(yǎng)育成抗咪唑啉酮類除草劑的油菜品種，用EMS誘變育成抗咪唑啉酮類除草劑的水稻品種，用疊 氮鈉和EMS誘變育成抗咪唑啉酮類除草劑的小麥品種(沈曉霞，倪長春編譯，咪唑啉酮類除草劑耐受性作物的過去、現(xiàn)狀和未來(上)，世界農(nóng)藥，2005年，27
(5):9-13 ;蘇少泉，非草甘膦除草劑抗性作物的新發(fā)展，農(nóng)藥，2009年，48 (12):859_863)。另外在向日葵、甜菜、棉花、大豆、番茄、煙草和油菜等作物中均發(fā)現(xiàn)抗咪唑啉酮除草劑的天然突變體，人們可以直接從由于核苷酸點突變而對除草劑產(chǎn)生抗性的生物體中篩選和培育抗性品種。生物學家普遍認為，雜草在其生長過程中如持續(xù)存在除草劑選擇性壓力，會誘發(fā)相關(guān)靶酶產(chǎn)生點突變，從而使雜草而產(chǎn)生抗性。因此，生產(chǎn)上預(yù)防雜草產(chǎn)生抗性的主要措施為降低除草劑選擇壓力，在農(nóng)作物生長過程中盡量避免過度依賴化學除草劑，同一地理區(qū)域，輪種不同作物，選擇具有不同作用靶位的除草劑輪流使用，都有利于降低選擇壓力，減少抗性雜草出現(xiàn)的可能性。相反在作物育種過程中則可以充分利用這種選擇壓力，加速抗除草劑品種的培育，而應(yīng)用化學誘變劑定點誘變相關(guān)靶酶產(chǎn)生點突變，再利用除草劑選擇壓力定向篩選突變位點，則可大大加速作物抗除草劑品種的選育進程(任雪玲，吳超，楊華錚，基因點突變所引發(fā)的除草劑的抗性問題，化學通報2006年，第I期，9-15)。本發(fā)明正是基于上述原理提出的一種培育抗ALS靶酶除草劑油菜的新方法。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題
本發(fā)明能夠彌補已有專利或技術(shù)的不足，提供了一種基于ALS靶酶的抗除草劑油菜定向選育方法。技術(shù)方案
一種基于ALS靶酶的抗除草劑油菜定向選育方法，包括步驟:
A、種子EMS處理:對所需進行誘變的油菜種子，用該種子的半致死濃度進行EMS誘變處
理；
B、誘變后代擴繁:誘變種子在隔離網(wǎng)室擴繁至M2代，收獲足夠進行大群體定向篩選的種子，低溫保存?zhèn)溆茫?br> C、除草劑壓力選擇:用以ALS靶酶開發(fā)的除草劑對M2代混合群體進行抗除草劑定向篩選，藥劑用量為該除草劑防治雜草的推薦使用濃度，并連續(xù)噴施2次，第I次在油菜3 4葉期進行，10天后再噴施第2次；
D、對EMS誘變M2代進行抗除草劑定向篩選:噴藥后不被除草劑殺死的植株為定向篩選到的以ALS為靶酶的抗除草劑油菜新材料；
E、抗性材料驗證鑒定:對篩選獲`得的以ALS為靶酶的抗除草劑油菜新材料單株，花期套袋自交，收獲自交種子，進行驗證鑒定:待油菜長至3-4葉期，再次噴施苯磺隆除草劑，藥劑用量為苯磺隆防治雜草的推薦使用濃度，有效劑量90ga.1./hm2,噴藥后不被除草劑殺死的植株即為定向篩選到的以ALS為靶酶的抗除草劑油菜新材料。上述方法具體應(yīng)用:
1)選擇雙低雜交油菜新品種寧雜15號父本N131；
2)用N131的EMS半至死濃度質(zhì)量比0.4%對油菜N131種籽進行EMS誘變處理；
3)對誘變后代在隔離網(wǎng)室擴繁至M2代，收獲M2種子低溫保存?zhèn)溆茫?br> 4)種植M2代油菜種子，種植M2代油菜種子，每平方尺留苗密度為50-70株。油菜苗長至3葉I心時噴施苯磺隆除草劑，藥劑用量為苯磺隆防治雜草的推薦使用濃度，有效劑量90ga.1./hm2,10天后再復噴I次；選擇處理油菜苗中存活下來、沒有藥害癥狀的單株，5_6葉期后將菜苗移至油菜育種大田，油菜開花時套袋自交，獲得自交種子；
5)抗性材料驗證鑒定:種植篩選獲得的自交種子，待油菜長至3-4葉期，再次噴施苯磺隆除草劑，藥劑用量為苯磺隆防治雜草的推薦使用濃度，有效劑量90ga.1./hm2,噴藥后不被除草劑殺死的植株即為定向篩選到的以ALS為靶酶的抗除草劑油菜新材料。有益效果
本發(fā)明通過上述方法，可大大提高獲得抗ALS靶酶除草劑油菜的選育效率，為抗除草油菜育種提供了新途徑、新方法。A:雖然EMS對植物后代的性狀誘變是隨機的，且機率很小。在高等植物中不論是雜草還是作物ALS基因有其共同點，都存在五個不連續(xù)的保守功能域，在這些保守功能域上發(fā)生點突變將導致基于靶位改變的ALS抗性(任雪玲，吳超，楊華錚，基因點突變所引發(fā)的除草劑的抗性問題，化學通報2006年，第I期，9-15 ;張朝賢，倪漢文，魏守輝，黃紅娟，劉延，崔海蘭，隋標峰，張猛，郭峰，雜草抗藥性研究進展，中國農(nóng)業(yè)科學，2009年，42 (4):1274-128)。點突變抗性研究為培育抗性作物提供了理論基礎(chǔ)，利用植物ALS基因的高度保守性和靶標位點改變產(chǎn)生抗ALS抑制劑類除草劑的特性，為選育抗該類除草劑的作物品種提供了新途徑。據(jù)報道應(yīng)用甲基磺酸乙酯(EMS)誘變和組織培養(yǎng)育成抗咪唑啉酮類和抗磺酰脲類除草劑的玉米品種，用亞硝基脲乙酯誘變和小孢子培養(yǎng)育成抗咪唑啉酮類除草劑的油菜品種，用EMS誘變育成抗咪唑啉酮類除草劑的水稻品種，用疊氮鈉和EMS誘變育成抗咪唑啉酮類除草劑的小麥品種(沈曉霞，倪長春編譯，咪唑啉酮類除草劑耐受性作物的過去、現(xiàn)狀和未來(上)，世界農(nóng)藥，2005年，27 (5):9-13 ;蘇少泉，非草甘膦除草劑抗性作物的新發(fā)展，農(nóng)藥，2009年，48 (12):859-863)。但本發(fā)明針對油菜種子籽粒小、繁殖系數(shù)高的特點，選擇在油菜幼苗期對誘變后代進行大群體定向篩選，直到獲得需要的抗性性狀為止，該方法簡便易行、高效實用，本方法將大大加快抗除草劑油菜的選育進程。B:試驗證明，本發(fā)明N131的EMS半至死濃度為質(zhì)量比0.4%處理油菜N131種籽，種植6000克M2種子(約100萬株苗)，處理菜苗中有5株存活，雖然生長變慢，但心葉青綠，沒有藥害癥狀。5-6葉期后將菜苗移至油菜育種大田，獲得自交種子，經(jīng)抗性驗證鑒定，共獲得4個抗性株系。C:油菜種子籽粒較小，千粒重一般為4克左右，而繁殖系數(shù)高達1000多倍，一個6 X 50m的隔離大棚可保純擴繁30 50公斤種子，籽?？倲?shù)高達800 1200多萬粒，足夠進行大群體定向篩選。在油菜3 4葉期進行除草劑抗性篩選，由于菜苗較小，且2次噴藥，可在較高密度下進行篩選。如每年用I 2畝地進行定向篩選，每平方尺留苗密度為60株，I年可定向篩選36 72萬苗，如連續(xù)進行5年或5平方尺土地？則可定向篩選的誘變苗可達到180 360萬株，這樣大群體的定向篩選可大大增加獲得突變性狀的概率，是選育抗除草劑油菜切實可行的方法。
具體實施例方式實施例:抗磺酰脲類除草劑苯磺隆油菜的選育。A:EMS濃度梯度試驗:2007年秋，選擇雙低雜交油菜新品種寧雜15號父本N131為材料(浦惠明等，甘藍型油菜(B.napus)油蔬兩用新品種寧雜15號的選育，江蘇農(nóng)業(yè)學報，2010，26 (6):1432 1434)，用 pH 為 7.0,0.1M 的磷酸緩沖液配制 0.2%、0.4%、0.6%、0.8% 和1.0%共5個濃度的EMS溶液，以清水為對照，進行EMS濃度梯度試驗。試驗種子先用清水浸泡12h，吸水紙吸干種子表面水分，進行EMS浸種處理，處理8h后將種子用流水沖洗4h，處理好的種子整齊排列于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿100粒，重復3次，置于人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)，25度光照發(fā)芽，3天后統(tǒng)計發(fā)芽率。隨著EMS濃度增加種子發(fā)率相應(yīng)下降，其中0.4%EMS濃度處理的發(fā)芽率為53.13%，接近半至死濃度，確明N131的EMS半至死濃度為質(zhì)量比0.4%(表 I)。表I 油菜種子在EMS不同濃度(質(zhì)量比)處理下的發(fā)芽率
權(quán)利要求
1.一種基于ALS靶酶的抗除草劑油菜定向選育方法，包括步驟: A、種子EMS處理:對所需進行誘變的油菜種子，用該種子的半致死濃度進行EMS誘變處理； B、誘變后代擴繁:誘變種子在隔離網(wǎng)室擴繁至M2代，收獲足夠進行大群體定向篩選的種子，低溫保存?zhèn)溆茫? C、除草劑壓力選擇:用以ALS靶酶開發(fā)的除草劑對M2代混合群體進行抗除草劑定向篩選，藥劑用量為該除草劑防治雜草的推薦使用濃度，并連續(xù)噴施2次，第I次在油菜3 4葉期進行，10天后再噴施第2次； D、對EMS誘變M2代進行抗除草劑定向篩選:噴藥后不被除草劑殺死的植株為定向篩選到的以ALS為靶酶的抗除草劑油菜新材料； E、抗性材料驗證鑒定:對篩選獲得的以ALS為靶酶的抗除草劑油菜新材料單株，花期套袋自交，收獲自交種子，進行驗證鑒定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于: 1)選擇雙低雜交油菜新品種寧雜15號父本N131； 2)用N131的EMS半至死濃度質(zhì)量比0.4%對油菜N131種籽進行EMS誘變處理； 3)對誘變后代在 隔離網(wǎng)室擴繁至M2代，收獲M2種子低溫保存?zhèn)溆茫? 4)種植M2代油菜種子，油菜苗長至3葉I心時噴施苯磺隆除草劑，藥劑用量為苯磺隆防治雜草的推薦使用濃度，有效劑量90ga.1./hm2,10天后再復噴I次；選擇處理油菜苗中存活下來、沒有藥害癥狀的單株，5-6葉期后將菜苗移至油菜育種大田，油菜開花時套袋自交，獲得自交種子； 5)抗性材料驗證鑒定:種植篩選獲得的自交種子，待油菜長至3-4葉期，再次噴施苯磺隆除草劑，藥劑用量為苯磺隆防治雜草的推薦使用濃度，有效劑量90ga.1./hm2,噴藥后不被除草劑殺死的植株即為定向篩選到的以ALS為靶酶的抗除草劑油菜新材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于: 種植M2代油菜種子，每平方尺留苗密度為50-70株。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種基于ALS靶酶的抗除草劑油菜定向選育方法，屬于植物性狀選育方法。選擇油菜生產(chǎn)或油菜育種需要的材料，將種子進行EMS處理，誘變種子經(jīng)隔離擴繁至M2代，在以ALS為靶酶的除草劑選擇壓下，大群體定向篩選抗除草劑突變性狀。為了提高獲得突變性狀的機率，定向篩選可連續(xù)多年或同年多點或多年多點進行，直至篩選到所需的突變材料。
文檔編號A01C1/00GK103070068SQ20131005464
公開日2013年5月1日 申請日期2013年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月21日
發(fā)明者浦惠明, 胡茂龍, 高建芹, 龍衛(wèi)華, 張潔夫, 陳松, 陳鋒, 付三雄, 周曉嬰, 戚存扣 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學院