專利名稱：一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的方法。
背景技術(shù)：
隨著養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，我國蛋白飼料短缺、人畜爭糧的矛盾日益突出。利用微生物對秸桿、玉米芯進行生物轉(zhuǎn)化，以此生產(chǎn)高蛋白菌體飼料已成為人們解決上述問題的重要手段之一。然而，由于單菌種存在酶系不全的缺陷，因此按照傳統(tǒng)方法無法大規(guī)模降解秸桿、玉米芯中的纖維素、半纖維素以及木質(zhì)素。為解決上述問題，目前通常采用多菌種混合發(fā)酵的方法生產(chǎn)蛋白飼料。如CN102178034B公開的一種生產(chǎn)高蛋白飼料的方法，就是利用枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、酵母菌和米曲霉多菌種進行混合發(fā)酵的。其具體方法包括以下步驟①將枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、酵母菌和米曲霉分別用平板培養(yǎng)基在33-36°C條件下培養(yǎng)48-72小時；②將枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、酵母菌和米曲霉分別進行擴大培養(yǎng)；③將擴大培養(yǎng)的菌株按照一定的比例混合后加入相應(yīng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到復(fù)合菌液；④將玉米漿加入相應(yīng)的水解酶，發(fā)酵；⑤在發(fā)酵后的混合液中加入營養(yǎng)液、復(fù)合菌液，通氣、發(fā)酵；⑥所得玉米漿發(fā)酵液噴在麩皮或豆柏上，攪拌、烘干由此制得高蛋白飼料。從上述方案可以看出，多菌種混合發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的工藝方法步驟繁瑣，制備成本高。為簡化生產(chǎn)工藝，也有人采用熱帶假絲酵母、產(chǎn)朊假絲酵母或黑曲霉進行單一菌種發(fā)酵，但效果最好的黑曲霉，其產(chǎn)品中粗蛋白質(zhì)量分數(shù)僅能達到22%。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)高品質(zhì)蛋白飼料的方法，該方法步驟簡單、成本低廉。為實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種蛋白飼料的生產(chǎn)方法:該方法以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YPH499-sptl5_20為發(fā)酵菌種，接入種子培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，得到種子培養(yǎng)液；然后將此種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基，在25-35°C下，180-220r/min振蕩發(fā)酵24-72h，固液分離，收集固體，得到所述蛋白飼料；所述釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) YPH499-sptl5_20,其保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號是CGMCC N0.7194，保藏日期是2013年I月23日；本發(fā)明所述釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)YPH499-sptl5_20 的構(gòu)建方法如下:克隆單倍體釀酒酵母BY4742基因組的起始轉(zhuǎn)錄因子sptl5，得到正確的轉(zhuǎn)錄因子sptl5基因，以其為模板進行突變。通過改進的易錯PCR條件來獲得較高的突變率，獲得轉(zhuǎn)錄因子sptl5基因突變庫，利用穿梭質(zhì)粒pYX212構(gòu)建的T載體簡單高效地轉(zhuǎn)化突變庫在不能以木糖為唯一碳源發(fā)酵的釀酒酵母YPH499中表達，獲得能夠利用纖維素水解液的重組釀酒酵母 YPH44-sptl5-20。所述發(fā)酵培養(yǎng)基，其配方以質(zhì)量體積比濃度計為:尿素0.05-0.15%，硫銨0.05-0.15%, KH2PO40.12-0.2%, MgSO4.7Η200.04-0.06%，酵母膏 0.05-0.15%，其余為玉米芯水解液；該配方的優(yōu)選組成為:尿素0.1%，硫銨0.1%，KH2PO40.16%，MgSO4.7Η200.05%，酵母膏0.1%，其余為玉米芯水解液；該發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值范圍為3-11 ；所述玉米芯水解液，其制備方法如下:將玉米芯粉碎后烘干至恒重，得到玉米芯顆粒；將上述玉米芯顆粒加入到質(zhì)量體積比濃度為1-3%的無機酸水溶液中，于100-120°c下水解0.5-1.5h ;所述玉米芯顆粒與無機酸水溶液的質(zhì)量體比為1: 10-20。上述制備方法所采用的無機酸可以選擇HC1、H2SO4, H3PO4中任意一種；其中，優(yōu)選HCl。上述生產(chǎn)方法所采用的發(fā)酵培養(yǎng)基，其pH值優(yōu)選5-7。上述生產(chǎn)方法所采用的種子培養(yǎng)基，其可選配方以質(zhì)量體積比濃度計為:木糖4-6%,尿素 0.2-0.4%,硫銨 0.1-0.2%, KH2PO40.05-0.15%, MgSO4.7Η200.04-0.06%,酵母膏0.05-0.15%，其余為水。該配方的優(yōu)選組成為:木糖5%，尿素0.3%，硫銨0.15%,KH2PO40.1%，MgSO4.7Η200.05%，酵母膏 0.1%，其余為水。上述生產(chǎn)方法所得種子培養(yǎng)液，其活菌濃度范圍是5X 107-2X 108cfu/mL，優(yōu)選lX108cfu/mL。該活菌濃度下的種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基后，菌株繁殖迅速，成活率高。接種時，可以選擇8-12%的接種量，優(yōu)選10%。本發(fā)明以廉價易得的玉米芯為原料，采用單一菌種發(fā)酵法制備蛋白飼料，步驟簡單、成本低廉，所得產(chǎn)品蛋白含量高。采用本發(fā)明提供的水解條件，能夠很好地將玉米芯顆粒中的半纖維素降解為木糖、將纖維素部分降解為葡萄糖，所得木糖、葡萄糖總產(chǎn)率高達4.2g/g玉米芯。采用本發(fā)明提供的釀酒酵母YPH499-sptl5-20，能夠高效地利用玉米芯水解液中的木糖和葡萄糖，利用率分別高達85%以上。所得發(fā)酵液中，固形物含量高達8.5-8.7g/L ;經(jīng)固液分離所得固體可直接作為蛋白飼料，其中粗蛋白含量高達38%以上，遠高于通常蛋白飼料中20%的粗蛋白含量，具有良好的經(jīng)濟效益和推廣前景。
具體實施例方式下面用具體實施例來進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但并不以任何方式意味著對本發(fā)明進行限制。下列實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。下列實施例中所采用的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) YPH499_spt 15-20,其保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號是CGMCC N0.7194，保藏日期是2013年I月23日。實施例1制備玉米芯水解液:將一定量的玉米芯粉碎成顆粒，過40目篩，烘干至恒重，得到玉米芯顆粒2kg ;將該玉米芯顆粒加入到20L質(zhì)量體積比濃度為1%的H2SO4水溶液中，于100°C下水解0.5h，得到玉米芯水解液備用。制備種子培養(yǎng)基:分別稱取木糖400g，尿素20g，硫銨10g，KH2P045g,MgSO4.7H204g，酵母膏5g，加水至10L，按照常規(guī)方法配制成種子培養(yǎng)基備用。制備發(fā)酵培養(yǎng)基:分別稱取尿素5g，硫銨5g，KH2P0412g，MgSO4.7Η2048，酵母膏5g，添加上述玉米芯水解液至10L，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至3-5，按照常規(guī)方法配制成發(fā)酵培養(yǎng)基備用。發(fā)酵制備蛋白飼料:步驟一、將釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) YPH499-sptl5_20 接入上述種子培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)至其中活菌的濃度為5X107cfu/mL，得到種子培養(yǎng)液；步驟二、將上述種子培養(yǎng)液以8%的接種量轉(zhuǎn)接于上述發(fā)酵培養(yǎng)基，在25°C下，180r/min振蕩發(fā)酵24h，固液分離，收集固體得到所述蛋白飼料85g，經(jīng)微量凱氏定氮法測定其中粗蛋白的質(zhì)量含量為38%。實施例2制備玉米芯水解液:將一定量的玉米芯粉碎成顆粒，過40目篩，烘干至恒重，得到玉米芯顆粒2kg ;將該玉米芯顆粒加入到40L質(zhì)量體積比濃度為3%的H3PO4水溶液中，于120°C下水解1.5h，得到玉米芯水解液備用。制備種子培養(yǎng)基:分別稱取木糖600g，尿素40g，硫銨20g，KH2P0415g,MgSO4.7H206g，酵母膏15g，加水至10L，按照常規(guī)方法配制成種子培養(yǎng)基備用。制備發(fā)酵培養(yǎng)基:分別稱取尿素15g，硫銨15g，KH2P0420g, MgSO4.7H206g，酵母膏15g，添加上述玉米芯水解液至10L，用Ca(OH)2調(diào)節(jié)pH至7-11，按照常規(guī)方法配制成發(fā)酵
培養(yǎng)基備用。發(fā)酵制備蛋白飼料:步驟一、將釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) YPH499-sptl5_20 接入上述種子培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)至其中活菌的濃度為2X108cfu/mL，得到種子培養(yǎng)液；步驟二、將上述種子培養(yǎng)液以12%的接種量轉(zhuǎn)接于上述發(fā)酵培養(yǎng)基，在35°C下，220r/min振蕩發(fā)酵72h，固液分離，收集固體得到所述蛋白飼料86g，經(jīng)微量凱氏定氮法測定其中粗蛋白的質(zhì)量含量為39%。實施例3制備玉米芯水解液:將一定量的玉米芯粉碎成顆粒，過40目篩，烘干至恒重，得到玉米芯顆粒2kg ;將該玉米芯顆粒加入到30L質(zhì)量體積比濃度為2%的HCl水溶液中，于110°C下水解lh，得到玉米芯水解液備用。制備種子培養(yǎng)基:分別稱取木糖500g，尿素30g，硫銨15g，KH2PO4IOg,MgSO4.7H205g，酵母膏10g，加水至10L，按照常規(guī)方法配制成種子培養(yǎng)基備用。制備發(fā)酵培養(yǎng)基:分別稱取尿素10g，硫銨10g，KH2P0416g, MgSO4.7H205g，酵母膏10g，加玉米芯水解液至10L，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至5-7，按照常規(guī)方法配制成發(fā)酵培養(yǎng)基備用。發(fā)酵制備蛋白飼料:步驟一、將釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) YPH499-sptl5_20 接入上述種子培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)至其中活菌的濃度為lX108cfu/mL，得到種子培養(yǎng)液；步驟二、將上述種子培養(yǎng)液以10%的接種量轉(zhuǎn)接于上述發(fā)酵培養(yǎng)基，在30°C下，200r/min振蕩發(fā)酵36h，固液分離，收集固體得到所述蛋白飼料87g，經(jīng)微量凱氏定氮法測定其中粗蛋白的質(zhì)量含量為41%。
權(quán)利要求
1.一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的方法，其特征在于:將釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)YPH499- sptl5_20接入種子培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，得到種子培養(yǎng)液，然后轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基，在25-35°C下，180-220 r/min振蕩發(fā)酵24_72h，固液分離，收集固體得到所述蛋白飼料； 所述釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YPH499_ sptl5_20,其保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號是CGMCC N0.7194，保藏日期是2013年月23日； 所述發(fā)酵培養(yǎng)基，其配方以質(zhì)量體積比濃度計為:尿素0.05-0.15%，硫銨0.05-0.15%，KH2PO4 0.12-0.2%, MgSO4*7H20 0.04-0.06%，酵母膏 0.05-0.15%，其余為玉米芯水解液，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的PH值為3-11 ； 所述玉米芯水解液，其制備方法是將玉米芯粉碎后烘干至恒重，得到玉米芯顆粒；將此玉米芯顆粒加入到質(zhì)量體積比濃度為1-3%的無機酸水溶液中，于100-120°C下水解0.5-1.5h ;所述玉米芯顆粒與無機酸水溶液的質(zhì)量體積比為1:10-20。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述微生物發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的方法，其特征在于:所述無機酸是HCl、H2SO4'H3PO4 中任意一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述微生物發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的方法，其特征在于:所述發(fā)酵培養(yǎng)基，其pH值為5-7。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述微生物發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的方法，其特征在于所述種子培養(yǎng)基，其配方以質(zhì)量體積比濃度計為:木糖4-6%，尿素0.2-0.4%，硫銨0.1-0.2%，KH2PO40.05-0.15%, MgSO4.7Η20 0.04-0.06%，酵母膏 0.05-0.15%，其余為水。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述微生物發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的方法，其特征在于:所述種子培養(yǎng)液，其活菌濃度為5 X IO7 -2 X IO8 cfu/mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述微生物發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的方法，其特征在于:將所述種子培養(yǎng)液以8-12%的接種量接種于所述發(fā)酵培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的方法，該方法以釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)YPH499-spt15-20為發(fā)酵菌種，采用以玉米芯水解液為主要成分的發(fā)酵培養(yǎng)基，在25-35℃下，180-220r/min振蕩發(fā)酵24-72h，固液分離，收集固體得到所述蛋白飼料。本發(fā)明所述方法能夠制備出高品質(zhì)的蛋白飼料，并且具有步驟簡單、成本低廉的優(yōu)勢。
文檔編號A23K1/00GK103082083SQ20131005572
公開日2013年5月8日 申請日期2013年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月21日
發(fā)明者劉紅梅, 劉愷, 劉金, 崔哲 申請人:河北大學