專利名稱：殼聚糖納米粒、防治甜菜夜蛾的生物農(nóng)藥制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)用殺蟲劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種生物農(nóng)藥制劑及其制備方法，特別一種殼聚糖納米粒、含有雙鏈核糖核酸的防治甜菜夜蛾的生物農(nóng)藥制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
甜菜夜蛾(Spodoptera exigua (Hubner)),又名白菜褐夜蛾，玉米葉夜蛾，屬鱗翅目夜蛾科，是一種世界性的多食性、暴食性害蟲。甜菜夜蛾除為害糧食作物外，還危害蔬菜、棉、麻、煙草、苜蓿及多種雜草，寄主植物達(dá)170種。其中危害最嚴(yán)重的有甘藍(lán)、甜菜、白菜、大蔥、莧菜、芹菜、花椰菜等。目前，我國20余個(gè)省、市、自治區(qū)都有甜菜夜蛾的發(fā)生危害。甜菜夜蛾在我國華北地區(qū)的危害期為7-9月的高溫季節(jié)，一般可造成作物減產(chǎn)15%左右，嚴(yán)重者可減產(chǎn)40%，更有甚者達(dá)80%以上。1999年甜菜夜蛾在我國黃淮部分地區(qū)大面積發(fā)生，僅山東省發(fā)生面積就達(dá)100萬hm2以上，造成直接經(jīng)濟(jì)損失70多億人民幣。近年來，防治甜菜夜蛾的措·施主要包括:加強(qiáng)預(yù)測，為大面積適時(shí)防治提供依據(jù)；農(nóng)業(yè)防治，清潔田園，破壞甜菜夜·蛾生存環(huán)境；誘殺成蟲，干擾或者減少甜菜夜蛾成熟雄蟲與雌蟲完成交配，壓低下一代害蟲蟲口密度，可達(dá)到減輕其發(fā)生危害的目標(biāo)；生物防治，大力推廣應(yīng)用生物制劑，如性誘劑和甜菜夜蛾核型多角體病毒；保護(hù)和利用天敵，充分發(fā)揮田間自然生態(tài)的控制作用，如白僵菌、綠僵菌、姬蜂等；藥劑防治，田間噴施茚蟲威、甲氧蟲酰肼、擬除蟲菊酯類藥物可防治甜菜夜蛾病情的蔓延。目前對甜菜夜蛾的防治主要以化學(xué)藥物控制為主，但是連續(xù)噴施化學(xué)藥物致使抗性問題越來越突出，同時(shí)化學(xué)藥物的殘留問題不僅影響環(huán)境，并且引發(fā)嚴(yán)重食品安全問題。所以，研究高效、綠色、環(huán)保、可持續(xù)發(fā)展農(nóng)藥制劑已是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中非常重要的研究課題。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是指外源或者內(nèi)源的雙鏈RNA特異性地引起基因沉默的現(xiàn)象，目前被廣泛用于鱗翅目害蟲基因功能研究。如:Z.-X.Yang等用微注射的方法導(dǎo)入cadherin基因的dsRNA，導(dǎo)致該蟲的死亡率和性別比率增加，并且幼蟲期出現(xiàn)滯育現(xiàn)象。通過飼喂的方法，導(dǎo)入甜菜夜蛾細(xì)胞色素P450 (CYP6BG1)基因的dsRNA，致使該蟲對除蟲菊脂類農(nóng)藥的抗性降低。此外，通過將蟲體浸泡在dsRNA溶液中引發(fā)基因沉默也是實(shí)驗(yàn)室常用的有效手段。RNA干擾技術(shù)在鱗翅目害蟲防治方面取得的突破性進(jìn)展為甜菜夜蛾的防治奠定了理論基礎(chǔ)，提供了一種新的甜菜夜蛾防治策略，開辟了作物保護(hù)新局面。雖然基因沉默技術(shù)開啟了甜菜夜蛾防治的新篇章，該技術(shù)手段對甜菜夜蛾的殺滅作用已被證明，但是目前大量的嘗試僅限于實(shí)驗(yàn)室范圍，還未實(shí)現(xiàn)實(shí)際操作應(yīng)用，基于RNAi的生物農(nóng)藥制劑還未見報(bào)道。限制該技術(shù)廣泛應(yīng)用的因素主要是:(一)沒有開發(fā)出能增強(qiáng)dsRNA有效成分穩(wěn)定性、維持其殺蟲效果、適合規(guī)模化應(yīng)用的成熟穩(wěn)定的先進(jìn)農(nóng)藥制劑；(二)沒有探究出簡單便捷、具可操作性的規(guī)?；a(chǎn)工藝。先進(jìn)農(nóng)藥制劑的標(biāo)志是高效、環(huán)境友好和控釋。高效取決于有效成分本身和它在劑型中的微粒尺寸，尺寸越小，表面積越大，效率就越高。水基化農(nóng)藥制劑如水劑、乳化劑、水乳劑、懸浮劑、懸乳劑等被認(rèn)為是環(huán)境友好劑型，其農(nóng)藥的微粒尺寸由納米到微米依次增大，但都不具有控釋作用。為了減小農(nóng)藥的尺寸和實(shí)現(xiàn)緩釋，文獻(xiàn)報(bào)到將農(nóng)藥制成納米晶粒，或者在納米粒外部用合成高分子涂敷，或?qū)⒁后w農(nóng)藥包括成微膠囊，以及用多入口旋渦混合器將聯(lián)苯菊酯制成納米顆粒，用海藻酸鈉和殼聚糖通過層層組裝將吡蟲啉包裹等，但這些方法煩瑣，并不簡單，不易進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。殼聚糖納米粒作為一種新型藥物載體，在醫(yī)學(xué)上已成為國內(nèi)外研究開發(fā)的熱點(diǎn)。鄔思輝(2009)等將殼聚糖制成納米粒負(fù)載胰島素，控制藥物釋放、延長藥物療效、降低藥物毒副作用，可以提高疏水性藥物對細(xì)胞膜的通透性和藥物穩(wěn)定性及改變給藥途徑，還可以加強(qiáng)制劑的祀向給藥能力。劉慧(2007)等研究殼聚糖納米粒的制備并檢測其性能,希望得到一種能在黏膜給藥體系應(yīng)用的藥物載體，從而實(shí)現(xiàn)抗菌藥物的持續(xù)釋放，達(dá)到長期療效的目標(biāo)。蘇丹(2007)等以殼聚糖納米粒為載體負(fù)載siRNA穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中的RNAi通路，為人類疾病發(fā)生機(jī)理、疾病基因治療靶點(diǎn)的鑒別以及新藥研發(fā)如小分子化合物和抗體類藥物的發(fā)現(xiàn)提供理論依據(jù)，但其研究僅適合醫(yī)學(xué)而不使用于農(nóng)藥研究。殼聚糖納米粒在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用已多有報(bào)道，但是在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用報(bào)道還不多見。林春梅(2009)等利用殼聚糖帶陽離子的特性，使其與帶陰離子的三聚磷酸鈉發(fā)生離于交聯(lián)，包裹部分阿維菌素顆粒后形成納米載藥顆粒。趙書言(2009)等用殼聚糖納米粒包埋尿素，使得尿素的釋放速度減慢，增強(qiáng)緩釋效果。馮博華(2009)等以蓖麻油酸鈉和殼聚糖為原料制備納米粒子包裹魚藤酮、印楝素植物源農(nóng)藥，避免了大量有機(jī)溶劑和助劑的使用。李敏(2011)等通過過氧化氫降解殼聚糖制備低聚物，以吡 蟲啉、毒死蜱為模型藥物，研究納米粒子的理化性質(zhì)及不同制備方法形成機(jī)理。張子勇(2012)等以殼聚糖和羧甲基殼聚糖為載體，制備印楝素納米粒子水分散液。盡管上述報(bào)道成功制備了農(nóng)藥殼聚糖納米粒制劑，但是其研發(fā)均處于探究階段，所制備的納米粒尺寸、粒徑分布、藥物負(fù)載率等理化指標(biāo)均不穩(wěn)定，未實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化水平，其次工藝煩瑣，不易實(shí)現(xiàn)規(guī)模生產(chǎn)，所以至今局限于實(shí)驗(yàn)室研究，并未見轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品制劑流通市場。此外，目前成功報(bào)道的農(nóng)藥殼聚糖制劑包埋的農(nóng)藥有效成分多為現(xiàn)存化學(xué)農(nóng)藥，分子量小，技術(shù)操作相對簡單。本發(fā)明基于上述現(xiàn)狀，發(fā)明出首例基于基因沉默技術(shù)的防治甜菜夜蛾的生物農(nóng)藥制劑，同時(shí)利用一種簡捷、規(guī)?；闹苽浞椒?，研制出適用于有效成分dsRNA大分子的殼聚糖納米粒助劑。本發(fā)明生物農(nóng)藥制劑不僅能高效防治甜菜夜蛾，而且能體外保持dsRNA穩(wěn)定性，增強(qiáng)其殺蟲效果。本發(fā)明制劑是一種高效、環(huán)境友好和控釋的先進(jìn)農(nóng)藥制劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種適用于生物農(nóng)藥制劑的有效成分siRNA的大分子的殼聚糖納米粒。實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下:一種殼聚糖納米粒，其由以下重量百分比的原料組成:殼聚糖0.5-5%、助溶劑1_10%、防凍劑0-5%、表面活性劑0.1_1%、乳化劑0.1-0.5%、緩沖液40-60%、余量為水。殼聚糖納米粒中的助溶劑用于增加殼聚糖的溶解性，優(yōu)選地，為聚乙二醇200、聚乙二醇400、乙醇、丙二醇中的一種或者幾種混合物。
殼聚糖納米粒中的防凍劑用于保護(hù)制劑成分免于低溫造成的物理損害，優(yōu)選地，所述防凍劑為丙三醇、乙二醇、異丙醇、二甘醇中的一種或者幾種混合物。殼聚糖納米粒中的表面活性劑用于降低了溶液的表面張力，增強(qiáng)了制劑在植物或害蟲體表的潤濕、展布以及附著力，從而提高藥效。優(yōu)選地，所述表面活性劑為吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80中的一種或者幾種混合物。殼聚糖納米粒中的乳化劑用于提高膠溶、乳化、分散、交聯(lián)，優(yōu)選地，所述乳化劑為三聚磷酸鈉、農(nóng)乳400# (芐基二甲基酚聚氧乙烯醚)、農(nóng)乳500# (烷基苯磺酸鈣)、農(nóng)乳600#(苯乙基酚聚氧乙烯醚)、農(nóng)乳700# (烷基酚聚氧乙烯醚甲醛縮聚物)、農(nóng)乳1600# (苯乙基酚聚氧乙烯聚氧丙烯醚)、NP系列磷酸酯(壬基酚聚氧乙烯醚磷酸酯)、苯乙基聚氧乙烯醚硫酸銨鹽、烷基聯(lián)苯醚二磺酸鎂鹽中的一種或者幾種混合物。殼聚糖納米粒中的緩沖液用于制劑酸堿調(diào)節(jié)、增加助劑溶解性。優(yōu)選地，所述緩沖液為醋酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液或檸檬酸鹽緩沖液的一種或者幾種混合物。所述殼聚糖納米粒是有別于現(xiàn)存納米粒的可以包裹大分子的農(nóng)用納米粒，其粒徑為 100-600nm。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種防治鱗翅目害蟲甜菜夜蛾的生物農(nóng)藥制劑，該生物農(nóng)藥制劑可有效控制甜菜夜蛾，是可持續(xù)發(fā)展的綠色農(nóng)藥。
具體方案如下:一種防治甜菜夜蛾的生物農(nóng)藥制劑，其主要由以下重量百分比的成分組成:(A) 0.05-15%的有效成分:針對甜菜夜蛾高效致死靶基因設(shè)計(jì)合成siRNA，所述siRNA 為 15-50nt (更優(yōu)選為 17_25nt)的雙鏈 RNA、(B) 19.95-55%用于溶解有效成分雙鏈核糖核酸的溶劑、(C)上述30-80%殼聚糖納米粒。所述有效成分雙鏈核糖核酸，是，通過基因沉默機(jī)制殺滅有害昆蟲。優(yōu)選地，所述甜菜夜蛾高效致死靶基因?yàn)殁}粘蛋白基因、肌動蛋白基因、細(xì)胞色素P450基因、G-蛋白偶聯(lián)受體基因。更優(yōu)選地，所述siRNA為選自針對鈣粘蛋白基因的雙鏈核糖核酸為 SEQ ID N0.1 及 SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3 及 SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5 和SEQ ID N0.6 ;針對肌動蛋白基因的雙鏈核糖核酸為SEQ ID N0.7及SEQ ID N0.8、SEQ IDN0.9及SEQ ID N0.10中；針對細(xì)胞色素P450基因的雙鏈核糖核酸為SEQ ID N0.11和SEQID N0.12、SEQ ID N0.13 和 SEQ ID N0.14、SEQ ID N0.15 和 SEQ ID N0.16 ;和針對 G-蛋白偶聯(lián)受體基因的雙鏈核糖核酸為SEQ ID N0.17及SEQ ID N0.18、SEQ ID N0.19及SEQID N0.20、SEQ ID N0.21 及 SEQ ID N0.22、SEQ ID N0.23 和 SEQ ID N0.24、SEQ ID N0.25和 SEQ ID N0.26、SEQ ID N0.27 和 SEQ ID N0.28 中的一對或多對。所述有效成分雙鏈核糖核酸核苷酸數(shù)為15_50nt、分子量為8000-40000。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述siRNA的3’末端設(shè)有懸掛堿基。所述溶劑用于溶解有效成分雙鏈核糖核酸，優(yōu)選地，所述溶劑為甲醇、二甲亞砜、水、Tris緩沖液中一種或者幾種混合物。本發(fā)明的另一目的是提供了一種上述防治甜菜夜蛾的生物農(nóng)藥制劑的制備方法。具體技術(shù)方案如下:一種上述防治甜菜夜蛾的生物農(nóng)藥制劑的制備方法，包括以下步驟:
(A)溶解:稱取所述siRNA，(優(yōu)選在800_3000r/min的轉(zhuǎn)速下)溶于溶劑，(優(yōu)選攪拌5-60min)，使雙鏈核糖核酸充分溶解；(B)殼聚糖納米粒制備:I)準(zhǔn)確稱取殼聚糖、助溶劑和防凍劑，加入到緩沖液中，(優(yōu)選800_3000r/min)攪拌使其充分溶解，得溶液I ;2)將上述溶液(優(yōu)選以3000-10000rpm)離心(優(yōu)選10_60min)，取上清，加入表面活性劑，充分?jǐn)嚢?，混勻，得溶? ；3)將乳化劑用水溶解后(優(yōu)選以10_30ml/min的速度)加入步驟2)溶液2中，混勻后即得殼聚糖納米粒；(C)制劑制備:將步驟(A)中所得溶液與步驟(B)所述的殼聚糖納米粒均勻混合，后繼續(xù)攪拌即得均一穩(wěn)定的雙鏈核糖核酸生物農(nóng)藥制劑。按照上述方法制備的殼聚糖納米粒及生物農(nóng)藥制劑的粒徑分布、藥物負(fù)載率等理化指標(biāo)均比較穩(wěn)定，可進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化水平生產(chǎn)。與現(xiàn)存技術(shù)相比，本發(fā)明有以下創(chuàng)新點(diǎn):第一、本發(fā)明農(nóng)藥制劑的載體為殼聚糖納米粒，是有別于現(xiàn)存納米粒的可以包裹大分子的農(nóng)用納米粒。由于有效成分為雙鏈核糖核酸，平均分子量均在8000-40000之間，分子量大，在殼聚糖納米粒制備中需要更高的技術(shù)來符合大分子有效成分的包埋，所以本發(fā)明殼聚糖納米粒與現(xiàn)存包埋小分子化學(xué)農(nóng)藥的納米粒存在本質(zhì)區(qū)別。

第二、本發(fā)明為雙鏈核糖核酸的殼聚糖納米粒制劑，較以往專利中所涉雙鏈核糖核酸與陽離子化合物的簡單配伍物，更有利于提高有效成分穩(wěn)定性，保持更高的害蟲防治效果。第三、本發(fā)明是首例基于基因沉默技術(shù)的小菜蛾生物防治劑，在世界范圍內(nèi)屬首例劑型成熟的雙鏈核糖核酸農(nóng)藥?；谄涮厥鈿绾οx的機(jī)制，該制劑是一種環(huán)保、綠色、健康的生物農(nóng)藥制劑。第四、本發(fā)明具有一套成熟、簡便、工業(yè)化操作的工藝流程，所涉生產(chǎn)步驟規(guī)范、標(biāo)準(zhǔn)，生產(chǎn)出的納米粒生物農(nóng)藥制劑的理化性質(zhì)等指標(biāo)均為優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)，易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大規(guī)模操作，利用該制備方法可突破實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)模，實(shí)現(xiàn)農(nóng)藥納米制劑產(chǎn)品的市場化。
具體實(shí)施例方式下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明的方法進(jìn)行說明，但本發(fā)明并不限于此。實(shí)施例一本實(shí)施例特別提供了以甜菜夜蛾鈣粘蛋白基因雙鏈核糖核酸序列為有效成分的殼聚糖納米粒生物制劑的制備及其效果研究。(一)針對甜菜夜蛾鈣粘蛋白基因雙鏈核糖核酸原藥成分的設(shè)計(jì)和合成GeneBank 登錄號:HM116243.IS1-Cadherin_001:靶基因 TGATG AACTC ACATT CGAA正義鏈(5，-3，):5’UGAUG AACUC ACAUU CGAA dTdT3’ SEQ ID N0.1反義鏈(3，-5，):3’dTdT ACUAC UUGAG UGUAA GCUU5’ SEQ ID N0.2S1-Cadherin_002:ACTGC GTTTA GAAAA CTTT
正義鏈(5，-3，):5’ACUGC GUUUA GAAAA CUUU dTdT3’ SEQ ID N0.3反義鏈(3，-5，):3’dTdT UGACG CAAAU CUUUU GAAA5’ SEQ ID N0.4S1-Cadherin_003:CGAAG CCCTT TCAAC GACC正義鏈(5，-3，): 5，CGAAG CCCUU UCAAC GACC dTdT3，SEQ ID N0.5反義鏈(3，-5，):3’dTdT GCUUC GGGAA AGUUG CUGG5’ SEQ ID N0.6上述序列的3’末端設(shè)有dTdT的懸掛堿基。按照上述序列設(shè)計(jì)和合成雙鏈核糖核酸并冷凍干燥成原藥粉末。(二)0.05%雙鏈核糖核酸生物農(nóng)藥制劑的制備I有效成分溶解:分別稱取500mg上述雙鏈核糖核酸，溶于199.5g水中，800r/min攪拌使其充分溶解；2殼聚糖納米粒制備以聚乙二醇200做助溶劑、丙三醇做防凍劑、吐溫20做表面活性劑、三聚磷酸鈉做乳化劑、磷酸鹽緩沖液做緩沖液制備殼聚糖納米粒。其中殼聚糖、助溶劑、防凍劑、表面活性齊U、乳化劑、緩沖液重量百分比為分別5%、10%、5%、1%、0.5%,60%制備殼聚糖納米粒，余量為水。(I)稱取殼聚糖40g、聚乙二醇20080g、丙三醇40g，溶于480g磷酸鹽緩沖液，800r/min轉(zhuǎn)速下攪拌12h，使殼聚糖充分溶解；(2)將步驟(I)所得溶液在3000r/min下離心IOmin,取上清,加入8g吐溫20,充分?jǐn)嚢杌旌暇鶆颍?3)稱取4g三聚磷酸鈉溶于156g水中，充分?jǐn)嚢?，然后與步驟(2)所得溶液混合均勻，即得殼聚糖納米粒，粒徑100_600nm。3制劑制備:將步驟I中有效成分溶液與步驟2所得殼聚糖納米粒溶液均勻混合，即得。按照上述方法制備的殼聚糖納米粒及生物農(nóng)藥制劑的粒徑分布、藥物負(fù)載率等理化指標(biāo)均比較穩(wěn)定，可進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化水平生產(chǎn)。(三)0.05%雙鏈核糖核酸生物農(nóng)藥制劑的防治效果將0.05%生物農(nóng)藥制劑稀釋至100mg/L，均勻噴施在接有甜菜夜蛾幼蟲的甘藍(lán)盆栽上，每盆噴施5ml，每處理重復(fù)三次，72h后統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)蛻皮未盡癥狀或者統(tǒng)計(jì)死亡率。結(jié)果如下表所示。表針對甜菜夜蛾鈣粘蛋白基因設(shè)計(jì)合成的雙鏈核糖核酸為有效成分的生物制劑對甜菜夜蛾的防治效果
權(quán)利要求
1.一種殼聚糖納米粒，其特征是，其由以下重量百分比的原料組成: 殼聚糖0.5-5%、助溶劑1_10%、防凍劑0-5%、表面活性劑0.1-1%、乳化劑0.1-0.5%、緩沖液40-60%、余量為水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼聚糖納米粒，其特征是，所述助溶劑為聚乙二醇200、聚乙二醇400、乙醇、丙二醇中的一種或者幾種混合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼聚糖納米粒，其特征是，所述防凍劑為丙三醇、乙二醇、異丙醇、二甘醇中的一種或者幾種混合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼聚糖納米粒，其特征是，所述表面活性劑為吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80中的一種或者幾種混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的殼聚糖納米粒，其特征是，所述乳化劑為三聚磷酸鈉、芐基二甲基酚聚氧乙烯醚、烷基苯磺酸鈣、苯乙基酚聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚甲醛縮聚物、苯乙基酚聚氧乙烯聚氧丙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚磷酸酯、苯乙基聚氧乙烯醚硫酸銨鹽、烷基聯(lián)苯醚二磺酸鎂鹽中的一種或者幾種混合物；所述緩沖液為醋酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液或檸檬酸鹽緩沖液的一種或者幾種混合物。
6.一種防治甜菜夜蛾的生物農(nóng)藥制劑，其特征是，其主要由以下重量百分比的成分組成: (A)0.05-15%的有效成分:針對甜菜夜蛾高效致死靶基因設(shè)計(jì)合成siRNA，所述siRNA為15-50nt的雙鏈核糖核酸、(B)19.95-55% 溶劑、 (C)30-80%權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的殼聚糖納米粒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的防治甜菜夜蛾的生物農(nóng)藥制劑，其特征是，所述甜菜夜蛾高效致死靶基因?yàn)殁}粘蛋白基因、肌動蛋白基因、細(xì)胞色素P450基因、G-蛋白偶聯(lián)受體基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的防治甜菜夜蛾的生物農(nóng)藥制劑，其特征是，所述siRNA為選自針對鈣粘蛋白基因的雙鏈核糖核酸為SEQ ID N0.1及SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3及SEQ IDN0.4、SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6 ;針對肌動蛋白基因的雙鏈核糖核酸為SEQ ID N0.7及SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.9及SEQ ID N0.10中；針對細(xì)胞色素P450基因的雙鏈核糖核酸為 SEQ ID N0.11 和 SEQ ID N0.12、SEQ ID N0.13 和 SEQ ID N0.14、SEQ ID N0.15 和 SEQID N0.16 ;和針對G-蛋白偶聯(lián)受體基因的雙鏈核糖核酸為SEQ ID N0.17及SEQ ID N0.18、SEQ ID N0.19 及 SEQ ID N0.20、SEQ ID N0.21 及 SEQ ID N0.22、SEQ ID N0.23 和 SEQ IDN0.24、SEQ ID N0.25 和 SEQ ID N0.26、SEQ ID N0.27 和 SEQ ID N0.28 中的一對或多對。
9.根據(jù)權(quán)利要求6-8任一項(xiàng)所述的防治甜菜夜蛾的生物農(nóng)藥制劑，其特征是，所述溶劑為甲醇、二甲亞砜、水、Tris緩沖液中一種或者幾種混合物。
10.一種權(quán)利要求6-9任一項(xiàng)所述的防治甜菜夜蛾的生物農(nóng)藥制劑的制備方法，其特征是，包括以下步驟: (A)溶解:稱取所述siRNA，溶于溶劑，攪拌，使所述siRNA充分溶解，得溶液； (B)殼聚糖納米粒制備: 1)稱取所述殼聚糖、助溶劑和防凍劑，加入到緩沖液中，攪拌使其充分溶解，得溶液I; 2)將溶液I離心，取上清，加入表面活性劑，充分?jǐn)嚢?，混勻，得溶?； 3)將乳化劑用水溶解后加入溶液2中，混勻即得殼聚糖納米粒；(C)制劑制備:將步驟(A)中所得溶液與步驟(B)所得的殼聚糖納米?；旌暇鶆颍吹盟龇乐翁鸩艘苟甑?生物農(nóng)藥制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種由以下重量百分比的原料組成的殼聚糖納米粒殼聚糖0.5-5%、助溶劑1-10%、防凍劑0-5%、表面活性劑0.1-1%、乳化劑0.1-0.5%、緩沖液40-60%、余量為水。還提供了一種防治甜菜夜蛾的生物農(nóng)藥制劑及其制備方法，其主要由以下重量百分比的成分組成(A)0.05-15%的有效成分:針對甜菜夜蛾高效致死靶基因設(shè)計(jì)合成siRNA，所述siRNA為15-50nt的雙鏈RNA、(B)19.95-55%溶劑、(C)30-80%所述的殼聚糖納米粒。所述殼聚糖納米粒使生物農(nóng)藥制劑的穩(wěn)定性、防治甜菜夜蛾效果更好。
文檔編號A01N25/04GK103109797SQ201310060939
公開日2013年5月22日 申請日期2013年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月26日
發(fā)明者張必良 申請人:廣州市銳博生物科技有限公司