專利名稱：一種提高黃孢原毛平革菌降解性能的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及一種提高黃孢原毛平革菌降解性能的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
黃孢原毛平革菌{Phanerochaete chrysosporium)是一類絲狀擔(dān)子菌白腐真菌，含有一套優(yōu)秀的木質(zhì)素分解系統(tǒng)。這套優(yōu)秀的木質(zhì)素分解系統(tǒng)由系列胞外過(guò)氧化物酶組成，典型的酶系如木質(zhì)素過(guò)氧化物酶和錳過(guò)氧化物酶。這些胞外過(guò)氧化物酶對(duì)底物的氧化具有高度非特異性的特點(diǎn)，可以降解多種有機(jī)物，包括天然高聚物、還原性化合物、氧化性化合物、有毒化合物等。因此黃孢原毛平革菌在許多生物科技領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用價(jià)值，如危險(xiǎn)廢棄物的處理、污染土地的生物修復(fù)、生物燃料的制備、生物制漿和生物漂白等。液態(tài)沉浸式培養(yǎng)是絲狀真菌生長(zhǎng)和生產(chǎn)胞外酶的一種最經(jīng)濟(jì)的生產(chǎn)方式。為提高絲狀真菌一黃孢原毛平革菌液態(tài)培養(yǎng)過(guò)程中木質(zhì)素過(guò)氧化物酶和催化活性，通常采用以下幾種方式:第一種方式是優(yōu)化培養(yǎng)基，在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中控制化學(xué)添加劑的種類和劑量，如表面活性劑(如吐溫80)、藜蘆醇、錳鹽、有機(jī)酸螯合物、聚丙二醇、磷脂和不飽和酸等；第二種方式是設(shè)計(jì)不同結(jié)構(gòu)的反應(yīng)器，如轉(zhuǎn)鼓反應(yīng)器、翻轉(zhuǎn)生物接觸反應(yīng)器、攪拌罐反應(yīng)器等；第三種方式是調(diào)節(jié)控制操作參數(shù)，如攪拌轉(zhuǎn)速、溫度和光照條件等；第四種方式是改良菌種，如構(gòu)建高表達(dá)和高活性的工程菌種等。上述方法各有千秋，但為進(jìn)一步提高黃孢原毛平革菌的降解性能拓展其應(yīng)用研究，新的調(diào)控方法仍亟待開(kāi)發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種提高黃孢原毛平革菌降解性能的培養(yǎng)方法。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種提高黃孢原毛平革菌降解性能的培養(yǎng)方法，添加無(wú)機(jī)納米粒子至黃孢原毛平革菌液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培 養(yǎng)，獲得球狀黃孢原毛平革菌菌絲團(tuán)體，所述無(wú)機(jī)納米粒子為硅基納米粒子。上述方案中，所述球狀黃孢原毛平革菌菌絲團(tuán)體內(nèi)部分布有所述無(wú)機(jī)納米粒子。上述方案中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的具體步驟為:將活化后的黃孢原毛平革菌菌種制備成孢子懸浮液，接種到添加有所述無(wú)機(jī)納米粒子的液體培養(yǎng)基中，每升添加有無(wú)機(jī)納米粒子的液體培養(yǎng)基中孢子接種量為2.0X IO6 3.0X IO6個(gè)，于3(T33°C下?lián)u床培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速140 150rpm，培養(yǎng)5 7天。上述方案中，所述無(wú)機(jī)納米粒子采用高溫高壓蒸汽滅菌，所述液體培養(yǎng)基中的組分采用過(guò)濾除菌，將所述無(wú)機(jī)納米粒子在無(wú)菌條件下添加至所述液體培養(yǎng)基中與所述液體培養(yǎng)基中的組分混合。上述方案中，過(guò)濾除菌中所用過(guò)濾器為0.22微米的微濾膜。上述方案中，所述液體培養(yǎng)基的組分包括:葡萄糖10g/L，磷酸二氫鉀2g/L，硫酸鎂0.5g/L，氯化鈣0.lg/L，藜蘆醇0.lg/L，酒石酸銨0.2g/L，及痕量元素溶液70ml/L ；所述痕量元素溶液配方為:硫酸鎂3g/L，硫酸錳0.5g/L，氯化鈉l.0g/L，七水硫酸亞鐵
0.lg/L，氯化鈷0.lg/L，硫酸銅0.lg/L，七水硫酸鋅0.lg/L，十二水硫酸鋁鉀10mg/L，硼酸10mg/L, 二水鑰酸鈉10mg/L,及氨三乙酸1.5g/L。 上述方案中，所述硅基納米粒子為二氧化硅納米粒子或硅鋁納米粒子。上述方案中，以IL所述液體培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，所述無(wú)機(jī)納米粒子在所述液體培養(yǎng)基中的添加量為0.0l-1Ogo上述方案中，所述無(wú)機(jī)納米粒子的粒徑為10-1000nm。本發(fā)明所選用的黃孢原毛平革菌菌種來(lái)源于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏號(hào)為CICC 14076。本發(fā)明的基本 原理:黃孢原毛平革菌生長(zhǎng)初期，通過(guò)硅基納米粒子與孢子和菌絲之間的相互作用來(lái)影響菌絲球的大小和數(shù)量；生長(zhǎng)中后期，通過(guò)硅基納米粒子與菌絲球的相互作用，同時(shí)硅基納米粒子進(jìn)入到菌絲球的內(nèi)部使其形態(tài)和致密度發(fā)生變化。納米粒子與孢子和菌絲球相互作用示意圖見(jiàn)圖1。本發(fā)明有益的效果在于:
(1)添加硅基納米粒子至液體培養(yǎng)基中，能有效的控制菌絲生長(zhǎng)形態(tài)，同時(shí)由于納米粒子進(jìn)入菌絲球的內(nèi)部，有利于將菌絲球內(nèi)部更多的活性位點(diǎn)暴露出來(lái)，從而提高黃孢原毛平革菌液態(tài)培養(yǎng)過(guò)程中木質(zhì)素過(guò)氧化物酶和催化活性，進(jìn)而提高其降解性能，該方法成本低廉，簡(jiǎn)單易行，效果顯著。( 2 )同時(shí)，該方法培養(yǎng)獲得的菌絲球比表面積大，能有效的提高黃孢原毛平革菌對(duì)染料的吸附率。


圖1給出了納米粒子與孢子和菌絲球相互作用示意圖。圖2給出了實(shí)施例1所獲得的菌絲球掃描電鏡圖。圖3給出了實(shí)施例1的發(fā)酵液的蛋白電泳圖。圖中，1，4-納米粒子，2-孢子，3-菌絲球，M-蛋白分子量標(biāo)記，泳道1_對(duì)照，泳道2-添加了納米粒子的發(fā)酵結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖和實(shí)施例進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實(shí)施例。實(shí)施例1:
一種提高黃孢原毛平革菌降解性能的培養(yǎng)方法，其包括如下步驟:
(O菌種活化:將黃孢原毛平革菌接種在平板培養(yǎng)基上進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C，待培養(yǎng)2 3天后轉(zhuǎn)入室溫下培養(yǎng)至菌絲鋪滿平板；
(2)添加無(wú)機(jī)納米粒子:以IL液體培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，添加20.0g的SiO2納米粒子，該納米粒子的粒徑為20nm，以不添加該SiO2納米粒子的培養(yǎng)基作為對(duì)比例；
(3)菌體的培養(yǎng):將步驟(I)所得的活化后的菌種制備成孢子懸浮液，接種到步驟(2)所得到的添加有SiO2納米粒子的液體培養(yǎng)基，每升添加有SiO2納米粒子的液體培養(yǎng)基中孢子接種量為2.0X 106 3.0X IO6個(gè)，于30°C下?lián)u床培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速150rpm，培養(yǎng)5 7天，得到黃孢原毛平革菌菌絲球的發(fā)酵液。其中，步驟(I)中的平板培養(yǎng)基配方為:麥芽粉10g/L，葡萄糖10g/L，胰蛋白胨2g/L，酵母浸膏2g/L，天冬酰胺lg/L，磷酸二氫鉀2g/L，硫酸鎂lg/L，瓊脂20g/L。步驟(2)中的液體培養(yǎng)基配方為:葡萄糖10g/L，磷酸二氫鉀2g/L，硫酸鎂0.5g/L，氯化鈣
0.lg/L,藜蘆醇0.lg/L,酒石酸銨0.2g/L,及痕量元素溶液70ml/L ;該痕量元素溶液配方為:硫酸鎂3g/L，硫酸錳0.5g/L，氯化鈉1.0g/L，七水硫酸亞鐵0.lg/L，氯化鈷0.lg/L，硫酸銅0.lg/L，七水硫酸鋅0.lg/L，十二水硫酸鋁鉀10mg/L，硼酸10mg/L，二水鑰酸鈉10mg/L,及氨三乙酸1.5g/L。其中步驟(2)的SiO2納米粒子采用高溫高壓蒸汽滅菌，液體培養(yǎng)基中的組分采用過(guò)濾除菌，將無(wú)機(jī)納米粒子與液體培養(yǎng)基中的組分在無(wú)菌條件下混合。過(guò)濾除菌中所用過(guò)濾器為0.22微米的微濾膜。采用這種滅菌方法可以有效的降低SiO2納米粒子的團(tuán)聚。對(duì)步驟(3)所得到的發(fā)酵液中的菌絲球做掃描電鏡(SEM)測(cè)試，菌絲球的微觀結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2。由圖2可以看出，SiO2納米粒子與菌絲互相作用，納米粒子進(jìn)入菌絲球的內(nèi)部，使菌絲球的致密度降低，從而增大了菌絲球的比表面積，故菌絲球的吸附能力增強(qiáng)。同時(shí)，添加了納米粒子的培養(yǎng)基，發(fā)酵結(jié)束后菌絲球的數(shù)量明顯增多，結(jié)果如表I所示，進(jìn)一步增加了菌絲球總的比表面積。表I添加納米粒子后菌絲球數(shù)量和大小變化
權(quán)利要求
1.一種提高黃孢原毛平革菌降解性能的培養(yǎng)方法，其特征在于，添加無(wú)機(jī)納米粒子至黃孢原毛平革菌液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，獲得球狀黃孢原毛平革菌菌絲團(tuán)體，所述無(wú)機(jī)納米粒子為娃基納米粒子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述球狀黃孢原毛平革菌菌絲團(tuán)體內(nèi)部分布有所述無(wú)機(jī)納米粒子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)的具體步驟為:將活化后的黃孢原毛平革菌菌種制備成孢子懸浮液，接種到添加有所述無(wú)機(jī)納米粒子的液體培養(yǎng)基中，每升添加有無(wú)機(jī)納米粒子的液體培養(yǎng)基中孢子接種量為2.0X IO6 3.0X IO6個(gè)，于30 33°C下?lián)u床培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速14(Tl50rpm，培養(yǎng)5 7天。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述無(wú)機(jī)納米粒子采用高溫高壓蒸汽滅菌，所述液體培養(yǎng)基中的組分采用過(guò)濾除菌，將所述無(wú)機(jī)納米粒子在無(wú)菌條件下添加至所述液體培養(yǎng)基中與所述液體培養(yǎng)基中的組分混合。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，過(guò)濾除菌中所用過(guò)濾器為0.22微米的微濾膜。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述液體培養(yǎng)基的組分包括:葡萄糖10g/L，磷酸二氫鉀2g/L，硫酸鎂0.5g/L，氯化鈣0.lg/L，藜蘆醇0.lg/L，酒石酸銨0.2g/L，及痕量元素溶液70ml/L;所述痕量元素溶液配方為:硫酸鎂3g/L，硫酸錳0.5g/L，氯化鈉1.0g/L，七水硫酸亞鐵0.lg/L，氯化鈷0.lg/L，硫酸銅0.lg/L，七水硫酸鋅0.lg/L，十二水硫酸招鉀10mg/L,硼酸10mg/L, 二水鑰酸鈉10mg/L,及氨三乙酸1.5g/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述硅基納米粒子為二氧化硅納米粒子或娃招納米粒子。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，以IL所述液體培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，所述無(wú)機(jī)納米粒子在所述液 體培養(yǎng)基中的添加量為0.0l-1Og0
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述無(wú)機(jī)納米粒子的粒徑為lO-lOOOnm。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種提高黃孢原毛平革菌降解性能的培養(yǎng)方法，屬于生物工程領(lǐng)域。本發(fā)明將硅基納米粒子添加至黃孢原毛平革菌液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，通過(guò)硅基納米粒子與孢子和菌絲之間的作用，同時(shí)納米粒子進(jìn)入菌絲球內(nèi)部，獲得球狀黃孢原毛平革菌菌絲團(tuán)體，該菌絲團(tuán)體在染料降解方面具有較佳的應(yīng)用效果。
文檔編號(hào)C05G3/00GK103168619SQ20131006770
公開(kāi)日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2013年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月4日
發(fā)明者蘇寶連, 李其昌, 李昱, 謝浩 申請(qǐng)人:武漢理工大學(xué)