專利名稱：一株熒光假單胞菌及其對辣椒疫霉病的防治方法
技術領域：
本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術領域，具體是涉及生物防治植物病害的技術應用，主要一株植物內(nèi)生的熒光假單胞菌及對辣椒疫霉病的防治方法，屬于農(nóng)作物防病控病技術領域。
背景技術：
辣椒疫病是由辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)所引起的一種周期短，蔓延快、整個生育期各部位均可發(fā)病的毀滅性土傳病害，可經(jīng)雨水、土壤、氣流等多種途徑傳播，除了引起大面積死秧外，還可造成葉片枯萎、果實腐爛、莖桿出現(xiàn)壞死斑，以及整株萎蔫死亡等多種癥狀。該病于1918年首次在美國新墨西哥洲發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已在世界各辣椒產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生。近年來，在我國的新疆、內(nèi)蒙古、遼寧、北京、江蘇、陜西等二十幾個省市均有發(fā)生的報道，已成為我國辣椒生產(chǎn)上普遍發(fā)生的嚴重病害。多年來，國內(nèi)外不斷加強對辣椒疫病的防治工作，包括化學藥劑的使用，抗病品種的選育，農(nóng)業(yè)措施防治，生物防治。但是，辣椒疫霉屬于異宗配合疫霉種，不同交配型的菌株相互誘導產(chǎn)生的卵孢子具有很強的抗逆能力；同時在有性生殖過程中可能發(fā)生基因重組，使該病原菌獲得更強的生存能力、致病力以及更為廣泛的寄主范圍。而殺菌劑都屬于特異性位點抑制劑，對病原菌的作用位點單一，只對病原菌的單一代謝環(huán)節(jié)起作用，所以連年多次的使用易使辣椒疫霉菌易對殺菌劑易產(chǎn)生抗藥性，還會造成環(huán)境污染及果實的農(nóng)藥殘留。同時辣椒抗疫病種質(zhì)的抗性是由多基因控制的數(shù)量性狀，其轉(zhuǎn)育難度極大，且多為中抗或耐病品種，很少有高抗品種，更談不上有免疫品種。農(nóng)業(yè)措施防治如輪作、嫁接、套種、淺灌控水等可控制辣椒疫病的發(fā)生發(fā)展，但由于土地的限制以及經(jīng)濟利益的原因都不能從根本上消除辣椒疫病的發(fā)生。生物防治不會產(chǎn)生以上問題，而且有利于環(huán)境保護、維護生態(tài)平衡、保護物種多樣性、有利于人類健康等優(yōu)勢，因此已成為近年來植物病害防治的研究熱點。一株優(yōu)秀的生防菌株發(fā)揮作用的第一步就是要在寄主植物根圍或其它生境建立起一定的種群密度，這其中涉及到該生防菌與所施環(huán)境中土著種群以及一些病原微生物之間的相互競爭、抑制關系。在植物根圍生境中使用的生防菌株要考慮到施用后能否在植物根圍建立穩(wěn)定種群從而通過各種不同方式行使生物防治的作用。而植物內(nèi)生細菌作為植物微生態(tài)系統(tǒng)的組成成員，由于其定殖于植物組織內(nèi)部與表生細菌相比具有更加良好的生態(tài)環(huán)境，避開了外界的不利環(huán)境如溫度、滲透勢、紫外線等；另外，內(nèi)生細菌對寄主植物有促生、防病、內(nèi)生固氮等多方面的有益生物學作用。對于植物內(nèi)生細菌與植物和諧聯(lián)合作用的研究，其核心的問題在于明確其侵染定殖規(guī)律，這對于相關菌劑的開發(fā)與應用是至關重要的。近年來，國內(nèi)關于植物病害生防菌株的定殖研究報道有:何紅等(2004)報道了辣椒疫霉生防菌枯草芽孢桿菌BS-1和BS -2定殖在辣椒和白菜的根、莖、葉內(nèi)。周洪友等(2004)分離的番茄青枯病生防菌熒光假單胞菌CPFlO和2P24可定殖在番茄幼苗根部，且接菌20d后在根表和根內(nèi)仍維持較高定殖量(IO5Cfu.cm-1以上)。王美琴等(2011)采用浸種和葉片涂抹2種方法測定了內(nèi)生枯草芽孢桿菌Thhyl在在番茄內(nèi)的定殖力，結果表明生防菌株Thhyl能進入番茄體內(nèi)，但不同接種方法菌株在植物體內(nèi)的定殖能力(數(shù)量)有差異，用葉片涂抹的方法數(shù)量為2532cfu.g_\浸種方法為75.3cfu.g'黎志坤等(2010)采用DGGE的方法通過樣品中的優(yōu)勢細菌直觀反映出細菌YPP-9能良好的定殖與番茄根際。Thomas等(2012)研究發(fā)現(xiàn)Cupriavidus pinatubonensis JMP134能利用擬南芥和洋槐根系分泌物而定殖在其根部的表皮和皮層，在根部的定殖量隨接入量的增加而增大。文才藝等(2011)采用利福平和鏈霉素標記生防菌EBS05并用灌根和浸種法測定其在小麥體內(nèi)的定殖力，結果表明EBS05在小麥根內(nèi)具有較強的定殖能力袁且能從根部向莖、葉部轉(zhuǎn)移，其定殖量與菌株的接種濃度呈正相關，當接種濃度為IO8CFRmr1時，EBS05能在根、莖內(nèi)有效定殖，并持續(xù)向葉內(nèi)轉(zhuǎn)移。岳海濤等(2007 )等利用掃描電鏡觀察植物根際解鹽促生細菌菌株Rs-5、Rs-35在無菌棉花根部的定殖情況，結果顯示，這兩株菌在棉花根部定殖具有宏觀不均勻性，在根面的部分區(qū)域能夠大量定殖，且在根部的擴展方式主要是根尖的被動攜帶。郝變青等(2010)采用綠色熒光蛋白基因標記技術研究了植物促生菌B96-1I在盆栽黃瓜植株上的分布。研究表明:B96-1I可在黃瓜的根、莖和葉上定殖，根部定殖的數(shù)量(7.2X IO4Cfu.g—1)顯著高于莖部和葉部定殖的數(shù)量；黃瓜植株體內(nèi)定殖的數(shù)量多于體表定殖的數(shù)量。這些研究報道了植物內(nèi)生細菌在植物體內(nèi)的定殖時間、定殖部位、定殖量和定殖機制、定殖動態(tài)以及采用標記方法和檢測方法等，但對于如何保持內(nèi)生細菌在植物體內(nèi)的定殖數(shù)量沒有相關報道，特別是沒有查閱到利用重復接種技術來保持植物內(nèi)生細菌定殖數(shù)量的報道。有關植物病害生防菌株的定殖的專利資料有:200710022993.2:主要研究了生防菌可以通過注射法或澆灌法定殖在植物體內(nèi)；200510016938.3:測定出生防菌株可以在多種植物體內(nèi)定殖；200710022993.2:將多種有益微生物制成混合菌劑，并在每半個月噴施一次，整個生長季節(jié)噴紙5-6次就可以有效防治葡萄白腐病菌等病害；CN200810207402.3:主要是研究如何加快荷葉離褶傘菌絲定殖的方法，包括配制栽培種培養(yǎng)基質(zhì)、裝袋、接種、培養(yǎng)、搔菌、催蕾與發(fā)育、采收步驟。但是查閱大量的公開資料都沒有關于維持單個植物內(nèi)生細菌在植物體內(nèi)定殖數(shù)量的方法是采用每隔一段時間人工接種以通過保持內(nèi)生細菌定殖數(shù)量的方式來有效防治辣椒疫霉病的方法。植物內(nèi)生細菌要想控制植物病害，必須在植物體內(nèi)保持一定的數(shù)量并且要能在植物整個生長周期都能定殖在植物體內(nèi)才行。當前植物病害田間防治效果很不理想，大部分原因就是生防菌不能在植物體內(nèi)始終保持有效防病定殖量。本專利獲得的一株熒 光假單胞RP15，它能定殖在辣椒根部，并且通過重復接種，比如每15 20d接一次，它就能在辣椒根部一直保持防治辣椒疫病的有效定殖量，從而確保辣椒在整個生長周期都能避免辣椒疫霉病的危害。

發(fā)明內(nèi)容
為了減少辣椒疫病對辣椒生產(chǎn)的影響，本發(fā)明提供了一株能防治辣椒疫病的熒光假單胞菌，以及用該菌株生產(chǎn)的菌劑。本發(fā)明所說的熒光假單胞菌，其代號為RP15，是熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)，它的保藏編號為CGMCC N0.7061。該菌株分離自辣椒根內(nèi)，經(jīng)反復人工接種測定在辣椒根部大量定殖，定殖的數(shù)量在接種5d后達到5.0X IO5Cfu.g—1以上，保持該數(shù)量時間是20d左右，在同一個辣椒植株生育期內(nèi)每隔15 20d接種該菌株能始終保持5.0 X IO5Cfu.g—1以上的定殖數(shù)量。在溫室內(nèi)通過盆栽辣椒苗的方法測定熒光假單胞菌RP15在辣椒根部的定殖量達到5.0X IO5Cfu.g—1以上時大量接種辣椒疫霉病菌能100%的防治辣椒疫霉病菌的侵染。本發(fā)明公開了上述熒光假單胞菌RP15在防治辣椒疫霉病中的應用。具體的應用方法是將熒光假單胞菌RP15通過人工接種方法在辣椒根內(nèi)定殖，定殖數(shù)量達到
5.0XlO5Cfu.g_1 以上。本發(fā)明還公開了一種防治辣椒疫霉病的方法，該方法是將上述的熒光假單胞菌RP15人工接種辣椒后保持5.0X IO5Cfu.g—1以上的定殖數(shù)量達到20d以上。在進行人工接種時，可以是在辣椒生長的任何時期，用棍在距辣椒苗3 8cm的距離扎一個深度5 IOcm的孔，孔內(nèi)立即注入0.5 2ml的熒光假單胞菌RP15菌劑。上述接種方法中根據(jù)辣椒苗的生長時期和大小選擇:小苗選擇直徑偏小的木棍和鐵棍，扎孔距小苗偏近，扎孔深度要淺，接種量偏少；大苗或生長期長的辣椒植株選擇直徑偏大的木棍和鐵棍，扎孔距苗偏遠，扎孔深度要深，接種量偏大。上述方法中的熒光假單胞菌RP15菌劑，是采用下述方法制備:選用常規(guī)發(fā)酵方法繁殖菌體，去除發(fā)酵液，留下菌體用生理鹽水懸浮制成的菌懸液，含菌量用血球計數(shù)版計數(shù)達到I X IO5 5.0 X IO5個^g-1SRPlS的菌劑。該菌劑在O 5°C保存，保存時間在3 6個月，使用前用血球計數(shù)版計數(shù)。本發(fā)明進一步公開了熒光假單胞菌RP15及其該菌制備的菌劑和利用重復接種技術在生物防治辣椒疫霉病上的應用。一個應用本 發(fā)明菌株防治辣椒疫霉病的具體操作如下:(I)熒光假單胞菌RP15菌劑的制備:選用常規(guī)發(fā)酵方法繁殖菌體，去除發(fā)酵液，留下菌體用生理鹽水懸浮制成的菌懸液，含菌量用血球計數(shù)版計數(shù)達到IX IO5 5.0X IO5個.g—1為RP15的菌劑，該菌劑在O 5°C保存，保存時間在3 6個月，使用前用血球計數(shù)版計數(shù)。(2)熒光假單胞菌RP15菌劑接種辣椒的步驟和方法:辣椒生長的任何時期采用木棍或者鐵棍(直徑0.5-2.0cm)在距辣椒苗3-8cm的距離扎一個深度5-lOcm的孔，孔內(nèi)立即注入0.5-2ml的熒光假單胞菌RP15的菌劑。小苗選擇直徑偏小的木棍和鐵棍，扎孔距小苗偏近，扎孔深度要淺，接種量偏少；大苗或生長期長的辣椒植株選擇直徑偏大的木棍和鐵棍，扎孔距苗偏遠，扎孔深度要深，接種量偏大。(3)熒光假單胞菌RP15在辣椒根內(nèi)定殖數(shù)量的檢測:采用抗利福平標記法測定菌株RP15在辣椒根內(nèi)的定殖力。在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(約50°C時)加入利福平，使利福平濃度10 μ g.mL—1，制成含利福平的平板。將RP15轉(zhuǎn)入此培養(yǎng)基中培養(yǎng)，28°C培養(yǎng)2 4d，挑取單菌落，再接入同一濃度的培養(yǎng)基，繼代I次后轉(zhuǎn)入濃度為20 μ g.πιΓ1的利福平平板上培養(yǎng)。以類似的方法，逐步提高利福平濃度依次為40、60、80、100、120、150、200、250、300 μ g.mL—1，直至篩選出在含有300μ g.mL—1的利福平平板上能穩(wěn)定生長、菌落形態(tài)及對辣椒根內(nèi)定殖能力保持不變的菌株。將標記菌株接種于裝有含300μ g.mL—1利福平的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基三角瓶中，28°C、150r.mirT1振蕩培養(yǎng)48h。把發(fā)酵液裝入離心管中，離心收集菌體稀釋成IO5AiL-1的菌懸液，將菌懸液采用(2)的方法接種盆栽苗，每株苗接種菌懸液lml，每盆4株苗。分別在接種5，10，15，20，25，30d后取辣椒根部進行表面消毒，采用稀釋涂布法分別涂布于含300 u g.mL-1利福平的牛肉膏蛋白胨平板，每梯度3個重復，于28°C培養(yǎng)72h后分別計數(shù)單菌落，統(tǒng)計數(shù)量。接種后菌株RP15逐漸進入辣椒苗的根中，第5d在辣椒根部的定殖量達到5.0X IO5Cfu.g_\到第15d定殖量達到最大值8.0X IO5Cfu.g_S 25d下降到 5.0XlO5Cfu.g'30d 下降至Ij 3.0XlO5Cfu.g'(4)重復接種技術維持定殖數(shù)量的方法:將(3)標記的熒光假單胞菌RP15菌株制成IO5個.mL-1的菌懸液，接種辣椒苗。在第一次接種20d后，再對同一處理的辣椒苗采用同樣方法接入相同濃度和相同體積菌懸液，第二次接種后20d采用相同方法進行第三次接種，分別在第一次接種后5，10，15，20，25，30，40，50，60，70，80d后，采用稀釋涂布法測定熒光假單胞菌RP15在辣椒根部的定殖動態(tài)。結果表明，每20d接種辣椒苗一次，連續(xù)重復接種三次，得出RP15在三次接種后均能穩(wěn)定定殖在辣椒盆栽苗根部，且在第二次和第三次接種后能重新完成一個新的定殖周期，并與第一次的定殖消長趨勢相同都在接種后第15d定殖量達到最高，分別為:7.9 X IO5Cfu.g—1、9.0X IO5Cfu.g-1 和 9.9X 105cfu.g-1 ;第三次接種后的第25d時的定殖量5.6 X IO5Cfu.g—1。(5)辣椒疫霉病囷抱子懸液的制備:將辣椒疫霉囷種(來源于中國農(nóng)業(yè)囷種保減中心ACCC36278)挖菌塊接種到玉米粉培養(yǎng)基上，置28°C光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)7d至辣椒疫霉長滿平板，并產(chǎn)生大量的分生孢子囊，用無菌水洗下分生孢子囊，配制成每視野3 5個分生孢子囊的溶液，震蕩后制成分生孢子懸浮液。

(6)接種熒光假單胞菌RP15后對辣椒疫霉病防治方法:采用(I)的方法制成菌懸液，含菌量用血球計數(shù)版計數(shù)達到IX IO5 5.0X IO5個.mr1，采用(2)的方法接種熒光假單胞菌RP15，接種第5d采用(4)的方法制備辣椒疫霉病菌孢子懸液。辣椒苗澆足清水后，將辣椒疫霉菌孢子懸液澆灌到辣椒根部，每株澆灌2 4ml，25-28°C培養(yǎng)，用大塑料袋罩住辣椒苗保濕。分別設生理鹽水代替RP15菌劑接種后澆罐病原菌的對照和不接病原菌的空白對照。在澆灌辣椒疫霉病菌第IOd調(diào)查辣椒苗的發(fā)病情況，計算發(fā)病率和防治效果。發(fā)病率(%) =(發(fā)病株數(shù)/總株數(shù))X100;防治效果(%) =[(對照區(qū)病情指數(shù)-處理區(qū)病情指數(shù))/對照區(qū)病情指數(shù)]X 100。結果接種熒光假單胞菌RP15的處理防效都達到100%，而接生理鹽水對照發(fā)病率在90%以上。同樣，在接種熒光假單胞菌RP15第10d、第15d、第20d、第25d澆灌辣椒疫霉病菌孢子懸液的處理防效均都達到100%。在接種熒光假單胞菌RP15第30d澆灌辣椒疫霉病菌孢子懸液的處理防效下降能達到60% 80%的防效。由此證明熒光假單胞菌RP15在接種辣椒后有效防治辣椒疫霉病的時間是接種后第5d到25d之間。(7)重復接種技術的實施對辣椒疫霉病的防治:(4)中表明每隔20d接種一次熒光假單胞菌RP15的菌劑持續(xù)保持在辣椒根部的定殖數(shù)量是5.0X IO5Cfu.g'在自然條件下辣椒疫霉菌的侵染時期是不確定的，熒光假單胞菌RP15重復接種能始終在辣椒根部保持一定的數(shù)量。采用(4)的方法接種熒光假單胞菌RP15的辣椒苗在第一次接種后第10d、30d、50d采用(6)的方法澆灌辣椒疫霉病菌測定這些處理的辣椒苗防治疫霉病的效果均在
100% o(8)熒光假單胞菌RP15菌劑在田間防治辣椒疫霉病的使用方法:熒光假單胞菌RP15使用方法正確能有效保護辣椒全生育期內(nèi)辣椒疫霉病菌的危害，生產(chǎn)上辣椒的栽培分為育苗和田間種植兩個時期。育苗時期采用分苗時沾根的方法接種，因為辣椒分苗時從育苗盤中拔出的小苗須根均受到一定的傷害，這時把小苗的根部沾上熒光假單胞菌RP15的菌劑會立即完成接種的過程，接種后把小苗移栽到育苗盆中或者田間。過20d辣椒小苗完全緩苗或者生長良好，這時采用(2)的方法接種。每20d接種一次，RP15就可以一直定殖在辣椒根部，并且在辣椒整個生育期能維持有效的防治辣椒疫病的危害。
具體實施例方式實施例1: RP15菌株的獲得從田間采集健康的辣椒植株，用自來水洗凈表面并晾干，分別取植物的根、莖、葉進行表面消毒后研碎，稀釋涂布牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，置28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 7d，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色等挑取單菌落，純化后保存。采用平板對峙培養(yǎng)法篩選拮抗辣椒疫霉菌的菌株。首先將辣椒疫霉菌在胡蘿卜培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待辣椒疫霉菌長滿平板后用打孔器在平板邊緣打取菌塊，放在另一個無菌的胡蘿卜平板中央，在距離菌塊2.5cm處放置形同直徑的內(nèi)生細菌菌餅，每皿4個，每處理重復3次，置于25°C培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)，每天觀察，記錄對辣椒疫霉菌有拮抗作用的菌株。從植物體內(nèi)共分離出172株內(nèi)生細菌，采用平板對峙培養(yǎng)法對這172株內(nèi)生菌進行篩選，共篩選出6株對辣椒疫霉菌有拮抗作用的內(nèi)生細菌。其中抑菌圈直徑大于Icm的有兩株，其中命名為RP15的菌株的抑菌圈直徑最大為2.02cm。實施例2:RP15菌株的鑒定、保藏形態(tài)特征及生理 生化測定按常規(guī)方法進行。將篩選獲得的生防菌株RP15在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上28 °C培養(yǎng)24h后進行染色觀察，48h后觀察菌落形態(tài)；生理生化實驗參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》第8版進行，綜合以上各項指標進行初步鑒定。采用菌落PCR法提取生防菌株RP15的DNA和進行16S rDNA序列擴增。擴增采用細菌通用引物 27F (5 ' -GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '，SEQ ID N0.1)和 1492R(5' -CTACGGCTACCTTGTTACGA-3' , SEQ ID N0.2)。擴增產(chǎn)物回收純化后送上海生工生物工程有限公司測序，將測序結果與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行BLAST，確定菌株的分類地位。菌株RP15的菌落圓形光滑狀，邊緣不整齊，濕潤，易挑取，不透明，淺黃色，在LB液體培養(yǎng)基中呈混濁，不形成菌膜。對三個菌株進行形態(tài)特征和生理生化測定，結果如表1，從表I中我們得出該菌符合熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens )特性。RP15的16S rDNA部分序列長度為1.5kb左右，將序列檢測后提交GenBank。在NCBI數(shù)據(jù)庫上進行Blast比對，發(fā)現(xiàn)該菌的16SrDNA序列與熒光假單胞菌的16SrDNA較為相似，序列同源性達到99%。綜合以上結果得出RP15為突光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens )。表I植物內(nèi)生細菌RP15的形態(tài)特征和生理生化特性
權利要求
1.一株突光假單胞菌{Pseudomonas fluorescens ) RP15,它的保藏編號為CGMCCN0.7061。
2.權利要求1所述的熒光假單胞菌RP15在防治辣椒疫霉病中的應用。
3.根據(jù)權利要求2所述的應用，其特征在于將熒光假單胞菌RP15通過人工接種方法在辣椒根內(nèi)定殖，定殖數(shù)量達到5.0X IO5Cfu.g—1以上。
4.一種防治辣椒疫霉病的方法，其特征在于將權利要求1所述的熒光假單胞菌RP15人工接種辣椒后保持5. 0X IO5Cfu.g—1以上的定殖數(shù)量達到20d以上。
5.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于所述接種辣椒的方法是在辣椒生長的任何時期，用棍在距辣椒苗3 8cm的距離扎一個深度5 IOcm的孔，孔內(nèi)立即注入0.5 2ml的熒光假單胞菌RP15菌劑。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于，所述熒光假單胞菌RP15菌劑是通過下述方法制備:選用常規(guī)發(fā)酵方法繁殖菌體，去除發(fā)酵液，留下菌體用生理鹽水懸浮制成的菌懸液，含菌量用血球計數(shù)版計數(shù)達到IX IO5 5.0X IO5個.g—1為RP15的菌劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)其代號為RP15，保藏編號為CGMCC No.7061。該菌株能通過人工接種方法在辣椒根內(nèi)大量的定殖，定殖數(shù)量達到5.0×105cfu.g-1以上時能100%的防治辣椒疫霉病菌的侵染，每一次人工接種后保持5.0×105cfu.g-1以上的定殖數(shù)量達到20d以上，每隔20d接種一次能使辣椒植株根內(nèi)持續(xù)保持該菌體數(shù)量。該菌株制成的菌劑可以在辣椒疫霉病發(fā)生的季節(jié)采用每隔15～20d接種的重復接種技術來防治辣椒疫霉病的發(fā)生。該菌株制成的菌劑和防治辣椒疫霉病的方法適用于由疫霉菌引起的辣椒疫霉病的生物防治。
文檔編號A01G13/00GK103146609SQ201310075560
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月8日 優(yōu)先權日2013年3月8日
發(fā)明者閆淑珍, 付思婭, 陳雙林 申請人:南京師范大學