專(zhuān)利名稱(chēng)：擬南芥熱激蛋白基因HSP101及其T-DNA插入突變株hot1的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
:本發(fā)明屬于種子生理和植物基因工程領(lǐng)域。具體地，涉及擬南芥基因HSPlOl及其T-DNA插入突變株hot I在改變種子保藏、種子萌發(fā)特性中的應(yīng)用，同時(shí)還涉及該基因T-DNA插入突變株hotl在改變種子萌發(fā)和保藏方面的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，以及在培育具有低含量脫落酸(ABA)，高含量赤霉素(GA3)和生長(zhǎng)素(IAA)的種子中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
:種子的保藏是植物種質(zhì)資源保存的重要手段，其對(duì)生物多樣性的保護(hù)、對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要的意義。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界上已收集的植物種質(zhì)資源有610萬(wàn)份，其中90%是以種子形式保存在低溫種質(zhì)庫(kù)中的，我國(guó)長(zhǎng)期貯存的種質(zhì)數(shù)量已達(dá)34萬(wàn)份，居世界首位。但是種質(zhì)低溫保存也存在很多問(wèn)題，其中對(duì)種質(zhì)遺傳完整性影響最大的就是種子老化問(wèn)題，表現(xiàn)為發(fā)芽率降低。種子在自然儲(chǔ)藏中發(fā)芽力也會(huì)逐漸喪失，這就是自然老化(Machado Neto, Custodio et al.2001)。自然老化歷時(shí)較長(zhǎng),在品種改良中進(jìn)行種質(zhì)篩選時(shí)難以應(yīng)用；人工老化則可克服常溫下自然老化所需時(shí)間較長(zhǎng)的不足，而被廣泛應(yīng)用于種子耐貯性的研究，人工老化常采用高溫高濕的方法。種子老化的過(guò)程中會(huì)發(fā)生一系列的生理生化及遺傳變化，包括:質(zhì)膜傷害、物質(zhì)能量代謝的變化、有機(jī)物質(zhì)含量及種類(lèi)的變化和遺傳結(jié)構(gòu)的變化(Galleschi, Capocchi et al.2002;Andreev, Spiridonova etal.2004; Freitas, Dias et al.2006)。因此,進(jìn)行種子老化的相關(guān)研究,揭示種子老化機(jī)理并進(jìn)一步找出相關(guān)應(yīng)對(duì)策略，對(duì)于種質(zhì)資源保存具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。種子是農(nóng)林、園藝生產(chǎn)中的重要生產(chǎn)資料，其萌發(fā)直接影響農(nóng)林園藝的生產(chǎn)。人們?yōu)椴シN獲得齊苗狀苗而設(shè)法使種胚打破休眠迅速整齊恢復(fù)生長(zhǎng)，為豐產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。種子的萌發(fā)受環(huán)境因素(如光、溫度和濕度等)和內(nèi)部因素(如基因、激素、糖、含氮化合物、種皮的顏色和結(jié)構(gòu)等)的協(xié)同調(diào)控(BeWleyl997)。激素調(diào)控方面，赤霉素(GA3)、生長(zhǎng)素(IAA)和脫落酸(ABA)是調(diào)控種子休眠和萌發(fā)的主要植物激素。ABA抑制萌發(fā)，誘導(dǎo)休眠，赤霉素和生長(zhǎng)素促進(jìn)萌發(fā)，是拮抗ABA的主要因子，為種子萌發(fā)所必需(Flores，Jurado etal.2006;Rizza, Boccaccini et al.2010)。目前，由休眠到萌發(fā)的“開(kāi)關(guān)”機(jī)制尚未明確，尤其是對(duì)種子萌發(fā)調(diào)控相關(guān)基因的研究方面。熱激蛋白質(zhì)Heat Shock Protein (HSP)廣泛存在于植物細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、葉綠體、線(xiàn)粒體等組織中(Zhang, Wang et al.2007),是一組結(jié)構(gòu)保守的蛋白質(zhì),依其分子量大小與序列的同源性，可分為small HSPs(sHSPs)、HSP60、HSP70、HSP90與HSP100等五類(lèi)(Papp, Nardai et al.2003)。它們的主要功能有:(I)防止受熱變性的蛋白質(zhì)聚集；(2)將已聚集的變性蛋白質(zhì)分開(kāi)；(3)輔助變性的蛋白質(zhì)折疊回其原有的構(gòu)形；(4)協(xié)助分解已變形的蛋白質(zhì)(Suk-Whan and Elizabeth2001)。大部分的熱激蛋白質(zhì)在演化上是高度保守的。以反義抑制方式，阻止擬南芥HSPlOl的表達(dá)，會(huì)使突變株喪失獲得性耐熱性，突變株在經(jīng)38°C, 90分鐘的前處理下仍然無(wú)法在45°C的環(huán)境生存(Gurley2000; Suk-Whan andElizabeth2001)。熱激蛋白和熱激轉(zhuǎn)錄因子除了在熱激下起作用外，還和其它多種非生物脅迫有關(guān)，如干旱，高鹽和低溫脅迫等(Kotak, Larkindale et al.2007) 番爺sHSP可被低溫誘導(dǎo)，HSP21被發(fā)現(xiàn)包含在抗氧化途徑中，At HSP17.6則可被滲透壓所誘導(dǎo)。在種子萌發(fā)，特別是早期，基因轉(zhuǎn)錄活躍，蛋白質(zhì)大量合成，細(xì)胞的增殖和分化非常劇烈，細(xì)胞的環(huán)境在不斷變化，細(xì)胞對(duì)外界刺激十分敏感。這個(gè)時(shí)期的HSPs變化和作用表現(xiàn)得非常突出(Hsu, Lai et al.2010)。目前，現(xiàn)有技術(shù)中未見(jiàn)擬南芥基因HSPlOl缺失及該基因的T-DNA插入突變株hotl能夠改變種子保藏、種子萌發(fā)特性的報(bào)道
發(fā)明內(nèi)容
:本發(fā)明的目的在于提供一種擬南芥熱激蛋白基因HSPlOl及其T-DNA插入突變株hotl在種子萌發(fā)、保藏和農(nóng)作物生產(chǎn)中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的還在于提供一種擬南芥基因HSPlOl及其T-DNA插入突變株hotl在培育具有提高種子萌發(fā)和保藏方面的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，以及培育具有低含量脫落酸(ABA)，高含量赤霉素(GA3)和生長(zhǎng)素(IAA)的種子中的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案:擬南芥熱激蛋白基因HSPlOl在種子萌發(fā)中的應(yīng)用。擬南芥熱激蛋白基因HSPlOl在種子儲(chǔ)藏中的應(yīng)用。擬南芥熱激蛋白基因 HSPlOl在培育具有低含量脫落酸ABA，高含量赤霉素GA3和生長(zhǎng)素IAA的種子中的應(yīng)用。擬南芥熱激蛋白基因HSPlOl缺失使擬南芥種子具有更高的萌發(fā)勢(shì)。擬南芥熱激蛋白基因HSPlOl缺失使擬南芥種子對(duì)人工老化敏感，在自然保存過(guò)程中不耐儲(chǔ)藏。擬南芥熱激蛋白基因HSPlOl缺失使擬南芥種子中內(nèi)源激素脫落酸ABA降低，赤霉素GA3升高，生長(zhǎng)素IAA升高，有利于萌發(fā)。擬南芥基因HSPlOl的T-DNA插入突變株hotl在培育改良種子萌發(fā)的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。擬南芥基因HSP101的T-DNA插入突變株hotl在培育改良種子儲(chǔ)藏的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。擬南芥HSP101的T-DNA插入突變株hotl在培育具有低含量脫落酸ABA，高含量赤霉素GA3和生長(zhǎng)素IAA的種子中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的基因HSPIOI在GenBank中的編號(hào)是AT 1G74310，該基因的CDS長(zhǎng)2736bp，編碼911個(gè)氨基酸，其核苷酸序列和氨基酸序列如表I所示。利用從擬南芥生物資源中心 ABRC (Arabidopsis Biological Resource Center)獲得的 HSPlOl 基因 T-DNA 插入的擬南芥突變體hotl作為研究對(duì)象，突變體株系的種子編號(hào)為SALK_066374，突變體hotl源于載體PR0K2上的一段T-DNA插入基因HSP101的外顯子中，導(dǎo)致基因突變，插入位點(diǎn)處的側(cè)翼序列如表2所示。
本發(fā)明在模式植物擬南芥中發(fā)現(xiàn)熱激蛋白基因HSPlOl功能與種子的萌發(fā)和老化有關(guān)，該基因缺失可使得擬南芥種子具有更高的萌發(fā)勢(shì)，但對(duì)人工老化敏感，在自然保存過(guò)程中不耐儲(chǔ)藏，同時(shí)內(nèi)源激素脫落酸(ABA)降低，赤霉素(GA3)升高，生長(zhǎng)素(IAA)升高，有利于萌發(fā)。因此本發(fā)明發(fā)現(xiàn)操作基因HSPlOl能夠改變種子保藏和萌發(fā)特性，在種質(zhì)資源保存和農(nóng)作物生產(chǎn)中有很好的應(yīng)用前景。


:圖1 為 Western Blot 鑒定；圖2為PCR試驗(yàn)，圖2A為PCR引物設(shè)計(jì)示意圖；圖2B為電泳結(jié)果理論預(yù)期示意圖；圖3為PCR鑒定電泳結(jié)果；圖4為擬南芥種子萌發(fā)勢(shì)；圖5為擬南芥種子自然老化，圖5A為擬南芥種子自然老化兩年；圖5B為擬南芥種子自然老化兩年萌發(fā)率；圖6為擬南芥種子人工老化；圖7為擬南芥種子內(nèi)源激素含量；圖7A為種子內(nèi)源GA3含量；圖7B為種子內(nèi)源IAA含量；圖7C為種子內(nèi)源ABA含量。實(shí)施例1:突變株的獲得:本發(fā)明所述擬南芥熱激蛋白基因HSPlOl在GenBank中的編號(hào)是AT1G74310，該基因的CDS長(zhǎng)2736bp，核苷酸序列如序列表所示(表1)，編碼911個(gè)氨基酸，氨基酸序列如序列表所示(表I)。從美國(guó)擬南芥生物資源中心Arabidopsis Biological ResourceCenter (ABRC)購(gòu)買(mǎi)了此基因的T-DNA插入株系種子(SALK_066374)，突變株名稱(chēng)為hotl，其插入位點(diǎn)側(cè)翼序列如表2。表1HSP101的⑶S序列和氨基酸序列 I ATGAATCCAGAGAAATTCACACACAAGACAAACGAGACAATTGCTACAGCTCATGAGCTAI METAsnProGluLysPheThrHisLysThrAsnGluThrIIeAlaThrAlaHisGluLeu61 GCTGTGAATGCAGGACATGCTCAATTCACTCCTTTGCATTTAGCTGGTGCTTTGATCTCT21 AlaValAsnAlaGlyHisAlaGlnPheThrProLeuHisLeuAlaGlyAlaLeuIIeSerI2I GATCCCACCGGTATATTTCCTCAAGCAATCTCTAGTGCCGGTGGCGAGAACGCAGCTCAA41 AspProThrGlyIIePheProGlnAlaIIeSerSerAlaGlyGlyGluAsnAlaAlaGln181 TCTGCTGAAAGAGTGATCAATCAAGCCTTGAAGAAGCTTCCTTCACAATCTCCTCCACCT61 SerAlaGluArgValIleAsnGlnAlaLeuLysLysLeuProSerGlnSerProProPro241 GATGATATTCCAGCGAGTTCTAGTCTTATTAAGGTCATTCGTCGTGCTCAAGCTGCTCAG81 AspAspIleProAlaSerSerSerLeuIIeLysValIIeArgArgAlaGlnAlaAlaGln
301 AAGTCACGAGGTGATACTCATTTGGCTGTTGACCAGTTGATTATGGGTCTTCTTGAAGAT101 LysSerArgGlyAspThrHisLeuAlaValAspGlnLeuIIeMETGlyLeuLeuGluAsp361 TCTCAAATCAGGGATTTGTTGAACGA AGTCGGTGTAGCGACGGCGAGGGTAAAGTCTGAG121 SerGlnIIeArgAspLeuLeuAsnGluValGlyValAlaThrAlaArgValLysSerGlu
42IGTTGAGAAGCTTCGTGGGAAAGAAGGGAAGAAAGTTGAGAGTGCTTCAGGGGACACAAAT141ValGluLysLeuArgGlyLysGluGlyLysLysValGluSerAlaSerGlyAspThrAsn48ITTTCAAGCTTTAAAGACTTATGGAAGAGATTTGGTTGAGCAAGCAGGGAAGCTTGATCCT161PheGlnAlaLeuLysThrTyrGlyArgAspLeuvalGluGlnAlaGlyLysLeuAspPro54IGTGATTGGTCGTGATGAGGAGATTAGAAGAGTCGTGAGGATTCTTTCGAGGAGAACGAAG181ValIIeGlyArgAspGluGluIIeArgArgValValArgIIeLeuSerArgArgThrLys
601AACAATCCTGTGCTATTGGAGAGCCAGGAGTTGGTAAAACAGCTGTGGTTGAAGGTTTA201AsnAsnProValLeuIleGlyGluProGlyValGlyLysThrAlaValValGluGlyLeu66IGCACAAAGGATTGTGAAAGGAGATGTGCCCAACAGTCTTACTGATGTGAGATTAATTTCG221AlaGlnArgIleValLysGlyAspValProAsnSerLeuThrAspValArgLeuIIeSer721TTGGACATGGGTGCGTTAGTTGCTGGTGCTAAATACCGAGGAGAGTTTGAAGAAAGGTTG241LeuAspMETGlyAlaLeuValAlaGlyAlaLysTyrArgGlyGluPheGluGluArgLeu78IAAATCTGTTTTGAAAGAAGTTGAGGACGCTGAAGGCAAAGTGATTCTCTTTATTGATGAG261LysSerValLeuLysGluValGluAspAlaGluGlyLysValIIeLeuPheIIeAspGlu84IATTCATTTGGTTCTTGGTGCTGGCAAAACTGAAGGGTCGATGGATGCAGCTAATCTGTTC281IleHisLeuValLeuGlyAlaGlyLysThrGluGlySerMETAspAlaAlaAsnLeuPhe
901AAGCCCATGTTAGCTAGAGGGCAGCTTCGATGCATTGGTGCTACAACGCTTGAAGAATAC301LysProMETLeuAlaArgGlyGlnLeuArgCysIIeGlyAlaThrThrLeuGluGluTyr96IAGGAAATATGTTGAGAAAGATGCTGCCTTTGAGAGGAGGTTCCAACAAGTCTATGTTGCG321ArgLysTyrValGluLysAspAlaAlaPheGluArgArgPheGlnGlnValTyrValAla1021 GAGCCAAGTGTGCCTGACACCATTAGTATCCTTAGAGGACTCAAGGAGAAGTATGAGGGA341GluProSerValProAspThrIIeSerIIeLeuArgGlyLeuLysGluLysTyrGluGly108I CATCATGGTGTGCGAATCCAAGACAGAGCTCTTATAAATGCTGCTCAGCTGTCTGCTCGT361HisHisGlyValArgIIeGlnAspArgAlaLeuIIeAsnAlaAlaGlnLeuSerAlaArg1141 TACATAACTGGTCGGCATTTACCGGATAAAGCAATTGATTTGGTTGATGAGGCTTGTGCG381TyrlleThrGlyArgHisLeuProAspLysAlalleAspLeuValAspGluAlaCysAla
1201AATGTGAGAGTCCAGCTTGATAGTCAACCTGAAGAGATTGATAACCTTGAAAGGAAGAGG401AsnValArgValGlnLeuAspSerGlnProGluGluIIeAspAsnLeuGluArgLysArg1261ATGCAGCTGGAAATTGAACTTCACGCCTTGGAAAGGGAGAAGGATAAAGCCAGCAAAGCT421METGlnLeuGlulleGluLeuHisAlaLeuGluArgGluLysAspLysAlaSerLysAla1321 CGACTTATAGAGGTGCGGAAAGAGCTTGATGACCTGAGAGACAAGCTTCAGCCTCTCACG441ArgLeuIIeGluValArgLysGluLeuAspAspLeuArgAspLysLeuGlnProLeuThrI38IATGAAATACAGAAAGGAGAAAGAGAGAATTGATGAGATTCGAAGGCTTAAACAGAAAAGA461METLysTyrArgLysGluLysGluArglleAspGluIleArgArgLeuLysGlnLysArg1441 GAAGAGCTCATGTTTTCTTTGCAGGAGGCAGAACGAAGATATGACCTTGCAAGAGCTGCT481GluGluLeuMETPheSerLeuGlnGluAlaGluArgArgTyrAspLeuAlaArgAlaAla
1501 GATCTAAGATATGGCGCAATTCAAGAAGTGGAATCTGCAATTGCCCAACTTGAAGGAACT501AspLeuArgTyrGlyAlaIleGlnGluValGluSerAlalIeAlaGlnLeuGluGlyThr1561 TCTTCTGAAGAGAATGTGATGCTCACAGAAAACGTTGGGCCTGAACACATTGCTGAGGTT
權(quán)利要求
1.擬南芥熱激蛋白基因HSPlOl及其T-DNA插入突變株hotl在培育具有低含量脫落酸ABA，高含量赤霉素GA3和生 長(zhǎng)素IAA的種子中的應(yīng)用，其特征在于擬南芥熱激蛋白基因HSPlOl缺失使擬南芥種子中內(nèi)源激素脫落酸ABA降低，赤霉素GA3升高，生長(zhǎng)素IAA升高，有利于萌發(fā)。
全文摘要
提供擬南芥基因HSP101及其T-DNA插入突變株hot1在改變種子萌發(fā)和保藏中的應(yīng)用，該基因T-DNA插入突變株hot1在改變種子萌發(fā)和保藏方面的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，以及在培育具有低含量脫落酸(ABA)，高含量赤霉素(GA3)和生長(zhǎng)素(IAA)的種子中的應(yīng)用。本發(fā)明在模式植物擬南芥中發(fā)現(xiàn)熱激蛋白基因HSP101功能與種子萌發(fā)和老化有關(guān)，該基因缺失可使得擬南芥種子對(duì)人工老化敏感，在自然保存過(guò)程中不耐儲(chǔ)藏，同時(shí)內(nèi)源激素脫落酸(ABA)降低，赤霉素(GA3)升高，生長(zhǎng)素(IAA)升高，有利于萌發(fā)。因此本發(fā)明發(fā)現(xiàn)操作基因HSP101能夠改變種子保藏、種子萌發(fā)特性，在種質(zhì)資源保存和農(nóng)作物生產(chǎn)中有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A01H5/10GK103173431SQ20131007660
公開(kāi)日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2012年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月16日
發(fā)明者李唯奇, 禹曉梅, 陶發(fā)清, 郁步竹 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所