專利名稱：一種抑制木質(zhì)素合成的植物rna干擾載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抑制木質(zhì)素合成的植物干擾載體的構(gòu)建及其在培育低木質(zhì)素含量植物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
木質(zhì)素是植物體內(nèi)一類重要的大分子酚類聚合物，其數(shù)量巨大，在自然界中的含量僅次于纖維素，居有機(jī)多聚物的第二位，通常占植物體干重的10%左右，在樹木甚至可以達(dá)到30%。木質(zhì)素在陸生植物的生長發(fā)育中起著及其重要的作用。然而，牧草中木質(zhì)素過量的沉積卻影響牲畜對(duì)牧草 中營養(yǎng)成分的吸收；工業(yè)用植物中的木質(zhì)素也加大了利用植物纖維的成本。因此，在畜牧生產(chǎn)和植物纖維利用工業(yè)中一直希望獲得木質(zhì)素含量低的新植物品系，從而改善牧草的營養(yǎng)特性或是降低工業(yè)生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種抑制木質(zhì)素合成的植物RNA干擾載體，該干擾載體含有部分紫花苜蓿(咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶)基因序列。CCoAOMT是木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶之一，編碼CCoAOMT的基因?yàn)镃CoAOMT基因。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種抑制木質(zhì)素合成的植物RNA干擾載體的制備方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種抑制木質(zhì)素合成的植物RNA干擾載體在培育低木質(zhì)素含量植物中應(yīng)用，為培育低木質(zhì)素含量牧草等提供良好素材。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種將構(gòu)建的干擾載體轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞的方法，利用該方法，將該干擾載體轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)獲得生長正常的低木質(zhì)素含量植株。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施:一種抑制木質(zhì)素合成的植物RNA干擾載體，所述的植物RNA干擾載體是:將序列表SEQ ID N0.1所示的核酸序列作為正向核酸片段和序列表SEQ ID N0.2所示的核酸序列作為反向核酸片段插入植物表達(dá)載體PFGC5941中。序列表所示的核酸序列為插入了酶切位點(diǎn)的紫花苜蓿片段。上述的抑制木質(zhì)素合成的植物RNA干擾載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟:
1)紫花苜?？俁NA的提取
2)反轉(zhuǎn)錄獲得紫花苜蓿cDNA；
3)帶有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的，分別作為正向核酸片段和反向核酸片段的紫花苜蓿CCoAOMT核酸序列的PCR擴(kuò)增；
4)PCR擴(kuò)增的正向核酸片段和反向核酸片段經(jīng)過切膠回收，分別連接到T載體上；
5)雙酶切連接到T載體上的正向核酸片段和植物表達(dá)載體pFGC5941，電泳回收目的片段，T4連接酶連接，獲得中間載體pFGC5941-CCoAOMT I ；
6)雙酶切連接到T載體上的反向核酸片段和pFGC5941-CCoA0MTl，電泳回收目的片段，T4連接酶連接，獲得植物RNA干擾載體pFGC5941-CCoAOMTi。將植物RNA干擾載體——pFGC5941-CCoAOMTi質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌中，獲得重組根癌農(nóng)桿菌。上述的植物RNA干擾載體在培育低木質(zhì)素含量植物中的應(yīng)用，其方法如下:
I)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程采用葉盤法
取植物(如煙草或其它植物)健壯葉片，剪成0.5 cm 2左右的葉盤，在分化培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)2d后，放入上述的含有植物RNA干擾載體pFGC5941-CCoAOMTi的重組根癌農(nóng)桿菌中浸泡lOmin，取出后接種到分化培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)2d。轉(zhuǎn)入篩選分化培養(yǎng)基，進(jìn)行卡那霉素抗性篩選及不定芽的誘導(dǎo)。將誘導(dǎo)的不定芽從基部切下，轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基中生根。當(dāng)根系發(fā)育完全，根長1.5 2.0cm時(shí)，移栽再生苗，獲得轉(zhuǎn)基因植株。2)轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測
提取轉(zhuǎn)基因材料基因組DNA，以基因組DNA為模板，35S啟動(dòng)子加序列表SEQ ID N0.1所示的正向基因片段為檢測目標(biāo)，進(jìn)行PCR反應(yīng)；PCR產(chǎn)物測序、比對(duì)。通過該方法篩選陽性轉(zhuǎn)基因植株。上游引物:5’一 GCACGACACTCTGGTCTACTC—3，
下游引物:5’ — TTAITTAATGGGCTAAAAATGGTT— 3’。3)生長正常的低木質(zhì)素含量植株的獲得
轉(zhuǎn)基因植株木質(zhì)素含量的測定:通過經(jīng)典的Klason法測定樣本木質(zhì)素的含量。篩選木質(zhì)素含量較野生型降低10%以上的材料繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)基因植株生理生化指標(biāo)的測定:篩選木質(zhì)素含量較野生型降低10%以上的轉(zhuǎn)基因植株繼續(xù)培養(yǎng)，以外觀、株高、單株重為指標(biāo)，比較轉(zhuǎn)基因與野生型材料在生長勢方面的差異，以生長勢與野生型無顯著差異的轉(zhuǎn)基因植株為最終獲得的生長正常的低木質(zhì)素含量植株。本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明采用來源于紫花苜蓿(咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶)的部分基因序列，構(gòu)建了一種抑制木質(zhì)素合成的植物RNA干擾載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將該干擾載體轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)獲得生長正常的低木質(zhì)素含量植物，為培育低木質(zhì)素含量的牧草、造紙材料等提供種質(zhì)資源。


圖1是雙酶切驗(yàn)證干擾載體正向核酸片段；
Ml =Marker (2000bp) ；M2 =Marker (15000bp) ;1 6 ;重組載體酶切產(chǎn)物。圖2是雙酶切驗(yàn)證干擾載體反向核酸片段；
Ml =Marker (15000bp) ；M2 =Marker (2000bp) ;1 3 ;重組載體酶切產(chǎn)物。圖3是轉(zhuǎn)化植株(煙草)的PCR檢測(2000bp Marker)；
M =Marker (2000bp) ;1 5 ;有目標(biāo)片段，為陽性植株；6:無目標(biāo)片段，為野生型植株；7:重組質(zhì)粒:8:水。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1:紫花苜蓿CTo撕基因片段的克隆1.紫花苜?？俁NA的提取
(1)取幼嫩的紫花苜猜組織IOOmg,加入液氮研磨；向研缽中加入ImLRNAiso Plus,室溫靜置至樣品完全融化，繼續(xù)研磨至裂解液呈透明狀；
(2)將勻漿轉(zhuǎn)移至離心管中；12000r/min，4°C，離心5min;取上清移入新的離心管中；
(3)向上清液中加入氯仿(RNAisoPlus的1/5體積量)，震蕩15s，待溶液充分乳化后，再室溫靜置5min ；
(4)12000 r/min，4°C，離心15min ;吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中；
(5)向上清中加入等體積的異丙醇，充分混勻后，室溫靜置IOmin；
(6)12000 r/min,4°C,離心 IOmin ;棄上清，緩慢加入 75% 的乙醇 ImL ； 12000 r/min,4°C，離心5min后棄乙醇；
(7)室溫干燥沉淀2 5min，加入適量的RNase-free水溶解沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于_80°C保存，得RNA模板。2.經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄獲得紫花苜蓿cDNA
(I)紫花苜蓿cDNA第一鏈的合成。將獲得的RNA模板(3 μ I)、Primer Mix (2 μ I)、dNTP Mix (4 μ I)和 RNase-Free Water (4 μ I)配置反應(yīng)體系，70°C孵育 lOmin，迅速冰浴2min。短暫離心。繼續(xù)向以上反應(yīng)液中加入5XRT Buff (4μ 1),0.1M DTT (2μ I), 42°C孵育 2min;加入 Ιμ HiF1-MMLV (200U/μ I )，42°C孵育 50min。70°C 孵育 15min。反應(yīng)結(jié)束后，短暫離心，置于冰上冷卻。(2)紫花苜蓿cDNA合成。上述反應(yīng)產(chǎn)物作為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得紫花苜蓿cDNA序列。3.帶有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的紫花苜?；虿糠制蔚臄U(kuò)增 以紫花苜蓿cDNA為模板，擴(kuò)增CCoAOMT基因片段。擴(kuò)增正向核酸片段，上游引物5’ -GGCGCGCCACGGAGAAGGAAAGCAAA-3,
下游引物 5’ -AITTAAATGCGGAGGGGCGCGTCGGG-3’。擴(kuò)增反向核酸片段，上游引物5’ -TCCCCCGGGACGGAGAAGGAAAGCAAA-3’，
下游引物 5’ -GCTCTAGAGCGGAGGGGCGCGTCGGG-3’。PCR擴(kuò)增，經(jīng)測序得到如序列表SEQ ID N0.1所示的正向核酸片段和如序列表SEQID N0.2所示的反向核酸片段。實(shí)施例2:抑制木質(zhì)素合成的植物RNA干擾載體的制備
將實(shí)施例1獲得的帶有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的正向核酸片段和反向核酸片段分別連接到PMD19-T載體上；用Asc I和Swa I雙酶切連接到pMD19_T載體上的正向核酸片段和植物表達(dá)載體PFGC5941，回收目的片段，T4連接酶連接，獲得中間載體pFGC5941-CCoA0MTl ;用Xba I和5)胳I雙酶切含有反向核酸片段的pMD19-T載體和中間載體pFGC5941_CCoA0MTl，回收目的片段，T4連接酶連接，構(gòu)建成抑制木質(zhì)素合成的植物RNA干擾載體PFGC5941-CCoAOMTi ο雙酶切載體pFGC5941_CCoA0MTi進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖1和圖2所示，獲得2個(gè)片段，大小與設(shè)計(jì)一致。以干擾載體pFGC5941-CCoAOMTi為模板，35S啟動(dòng)子加正向基因片段為檢測目標(biāo)，進(jìn)行PCR反應(yīng)；PCR產(chǎn)物送上海生工測序，測序正確。
實(shí)施例3:植物RNA干擾載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌。1.農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
挑取根癌農(nóng)桿菌單菌落接種于3ml LB液體培養(yǎng)基中；220 r/min，28°C，振蕩培養(yǎng)至OD600 =0.5 ;吸取1.5ml菌液于離心管中，冰浴IOmin ；5000 r/min,離心30s,棄去上清液,沉淀用1.5 ml 0.5M NaCl懸浮，冰浴20min ；5000 r/min,離心30s,棄去上清液；每管用100 μ I 20mM CaCl2懸浮，用于轉(zhuǎn)化。2.質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
50 μ I農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中加入質(zhì)粒pFGC5941-CCoAOMTi IOul，冰浴30 min ;放入液氮中l(wèi)min，然后立即放入37°C水浴鍋中水浴5min ;取出離心管，加入0.5mlLB，28°C、220 r/min振蕩培養(yǎng)4h ;取出菌液于含卡那霉素的LB平板上涂板，在培養(yǎng)箱中28°C條件下倒置培養(yǎng)。2天左右菌落可見，得到重組根癌農(nóng)桿菌。3.重組根癌農(nóng)桿菌鑒定
小量提取質(zhì)粒DNA，PCR鑒定，重組根癌農(nóng)桿菌中含有質(zhì)粒pFGC5941-CCoAOMT i。實(shí)施例4:植物RNA干 擾載體轉(zhuǎn)化煙草植物
1.轉(zhuǎn)導(dǎo)(采用葉盤法)
取煙草健壯葉片，剪成0.5 cm 2左右的葉盤，葉腹面向下置于分化培養(yǎng)基上，溫度260C 土 1°C，光照16h/d，培養(yǎng)2d。將葉片放入已經(jīng)培養(yǎng)至OD6tltl (0.5-0.6)的重組根癌農(nóng)桿菌菌液中浸泡lOmin，用無菌濾紙吸去多余菌液，葉腹面向下接種到分化培養(yǎng)基中，溫度260C 土1°C，暗培養(yǎng)2d。轉(zhuǎn)入含卡那霉素的篩選分化培養(yǎng)基，進(jìn)行抗性篩選及不定芽的誘導(dǎo)，培養(yǎng)溫度26°C ±1°C，光照16h/d。培養(yǎng)7d左右，葉片上發(fā)生愈傷組織；繼續(xù)培養(yǎng)IOd左右，愈傷組織上分化出不定芽。當(dāng)不定芽長至1.5cm高時(shí)，將其從基部切下，與葉盤分開，轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度26°C ±1°C，光照16h/d。培養(yǎng)IOd左右，不定根發(fā)生，當(dāng)根系發(fā)育完全，根長1.5 2.0cm時(shí)，將再生植株移栽至裝有營養(yǎng)土的盆中培養(yǎng)，常規(guī)管理。經(jīng)上述操作獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株。2.轉(zhuǎn)基因煙草植株的PCR檢測
按植物基因組DNA提取試劑盒操作，提取轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNA，以基因組DNA為模板，35S啟動(dòng)子加正向基因片段為克隆目標(biāo)，進(jìn)行PCR反應(yīng)；PCR產(chǎn)物測序、比對(duì)。通過該方法篩選陽性轉(zhuǎn)基因植株。上游引物:5’一 GCACGACACTCTGGTCTACTC— 3，
下游引物:5’ — TTAITTAATGGGCTAAAAATGGTT— 3’
通過PCR篩選陽性轉(zhuǎn)基因植株。如圖3所示，經(jīng)檢測，再生植株中含有目標(biāo)片段。收集目標(biāo)片段，送交上海生工測序，測序結(jié)果與原設(shè)計(jì)相符，判斷為陽性植株。實(shí)施例5:生長正常的低木質(zhì)素含量植株的獲得。1.轉(zhuǎn)基因煙草植株木質(zhì)素含量的測定
取在營養(yǎng)土中培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因和野生型煙草葉片烘干至恒重，取IOOmg作為樣本，通過經(jīng)典的Klason法測定樣本木質(zhì)素的含量。經(jīng)檢測，轉(zhuǎn)基因煙草植株中木質(zhì)素含量較野生型平均降低10%以上。Klason法:樣品液氮研磨后,精確稱取烘至恒重后的樣品100 mg,加入12.5ml 72% H2SO4, 30°C消化lh，將消化后的混合液用無菌水稀釋到4 %，120°C第2次消化lh，將熱溶液通過烘干至恒重的砂心漏斗(W1)過濾，并用熱水沖洗3次，殘?jiān)吐┒芬黄鸱湃牒嫦渲校?0°C烘至恒重(W2),并按下式計(jì)算木質(zhì)素含量值。每個(gè)樣品木質(zhì)素含量重復(fù)測定3次，取平均值。木質(zhì)素含量(mg/IOOmg)=W2 - W1。2.轉(zhuǎn)基因植株生理生化指標(biāo)的測定
以外觀、株高、單株重為指標(biāo)，比較轉(zhuǎn)基因與野生型材料在生長勢方面的差異，以生長勢與野生型無顯著差異 的轉(zhuǎn)基因材料為最終獲得的生長正常的低木質(zhì)素含量植株。<110>遼寧大學(xué)
〈120〉一種抑制木質(zhì)素合成的植物RNA干擾載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用 〈160〉 2
〈210〉 I〈211〉 684〈212〉 DNA
〈213〉紫花苜蓿CCoAOMT核酸片段(作為正向核酸片段)
〈400〉 I
GCTATTAGTAGGGCATTCGCGCATCCTGCGAAGAATCTTGGGTATACTTCTCCATATTATTTCTTTATAAAC
AATGATTCCCCCCGGACTCTCTTTCTGTCCGGAGTCTTAAAGAATGAATTCTATTGAGTTGTGGTTGTTGACCAACA
AATTATGCATGGGAGAAAGATTCACAAAGGAAAACTAACCTTGATCCAGAAAGAAAGGGGCCCCTTCATCGCATCGG
GTTGGGTTGGCCCATCAGAATTTGTGCATTGCATCCTACCTAATTCGTTAGCGCTTTTTCTTTTAAGAATGCATCTG
GTTCTATCTTTCTTTCGCCAGTTAGTCCACCTTTTAGTGATTCTAGTAATTCTGGTTTGATAGTGCTTAGAATGTCT
CTTTCATATTGAGCAATTTTGTCTAATGGCATTCGATCACAGAATCCATTGACAGCTGCATAAATTACTAGAATTTG
TTTTTCAATTGGAAGTGGTGCATATTGTGGTTGTTTTAGTACTTCTGTAAGCCTTGCACCTCTATTGAGTAATGCCT
GAGTCGCAGCATCAAG GTCTGAGCCAAATTGAGCAAAGGCGGCCACTTCGCGATATTGTGCCAATTCAAGTTTTAAA
CTACCGCAGACTTGTTTCATAGCTTTCAACTGAGCGGCAGACCCGACGCGCCTCTCGCATTTTTTATATATAA
〈210〉 2〈211〉 686〈212〉 DNA
〈213〉紫花苜蓿核酸片段(作為反向核酸片段)
〈400〉 2
CCTTGCCGGCTAGCTGAGCTATGAACAGTCTGCGGTAGTTTAAAACTTGAATTGGCACAATATCGCGAAGTGGCCGCCTTTGCTCAATTTGGCTCAGACCTTGATGCTGCGACTCAGGCATTACTCAATAGAGGTGCAAGGCTTACAGAAGTACTAAAACAACCACAATATGCACCACTTCCAATTGAAAAACAAATTCTAGTAATTTATGCAGCTGTCAATGGATTCTGTGATCGAATGCCATTAGACAAAATTGCTCAATATGAAAGAGACATTCTAAGCACTATCAA ACCAGAATTACTAGAATCACTAAAAGGTGGACTAACTGGCGAAAGAAAGATAGAACCAGATGCATTCTTAAAAGAAAAAGCGCTAACGAATTAGGTAGGATGCAATGCACAAATTCTGATGGGCCAACCCAACCCGATGCGATGAAGGGGCCCCTTTCTTTCTGGATCAAGGTTAGTTTTCCTTTGTGAATCTTTCTCCCATGCATAATTTGTTGGTCAACAACCACAACTCAATAGAATTCATTCTTTAAGACTCCGGACAGAAAGAGAGTCCGGGGGGAATCATTGTTTATAAAGAAATAATATGGAGAAGTATACCCAAGATTTTCTTCGCAGGATGCGCGAATTTGCCCTACTAATTATCCTTTGCTTTCCTTCTCCGCCCCGGGGGGAAGG
權(quán)利要求
1.一種抑制木質(zhì)素合成的植物RNA干擾載體，其特征在于所述的植物RNA干擾載體是:將序列表SEQ ID N0.1所示的紫花苜蓿部分核酸序列作為正向核酸片段和序列表SEQ ID N0.2所示的紫花苜蓿沈bD#部分核酸序列作為反向核酸片段，插入植物表達(dá)載體PFGC5941 中。
2.權(quán)利要求1所述的抑制木質(zhì)素合成的植物RNA干擾載體的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟: O紫花苜?？俁NA的提?。? 2)反轉(zhuǎn)錄獲得紫花苜蓿cDNA； 3)帶有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的，分別作為正向核酸片段和反向核酸片段的紫花苜蓿CCoAOMT核酸序列的PCR擴(kuò)增； 4)PCR擴(kuò)增的正向核酸片段和反向核酸片段經(jīng)過切膠回收，分別連接到T載體上； 5)雙酶切連接到T載體上的正向核酸片段和植物表達(dá)載體PFGC5941，電泳回收目的片段，T4連接酶連接，獲得中間載體pFGC5941-CCoAOMTI ； 6)雙酶切連接到T載體上的反向核酸片段和pFGC5941-CCoAOMTI，電泳回收目的片段，T4連接酶連接，獲得植物RNA干擾載體pFGC5941-CCoAOMTi。
3.一種重組根癌農(nóng)桿菌，其特征在于將植物RNA干擾載體pFGC5941-CCoAOMTi轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，獲得重組根癌農(nóng)桿菌。
4.權(quán)利要求1所述的植物RNA干擾載體在培育低木質(zhì)素含量植物中的應(yīng)用，其特征在于方法如下: 1)采用葉盤法用含有植物RNA干擾載體pFGC5941-CCoAOMTi的重組根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物葉片； 2)葉片經(jīng)培養(yǎng)獲得再生植株； 3)將再生植株移栽至裝有營養(yǎng)土的盆中獲得轉(zhuǎn)基因植株。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抑制木質(zhì)素合成的植物RNA干擾載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。所述的植物RNA干擾載體是將序列表SEQIDNO.1所示的紫花苜蓿CCoAOMT部分核酸序列(作為正向核酸片段)和序列表SEQIDNO.2所示的紫花苜蓿CCoAOMT部分核酸序列(作為反向核酸片段)插入植物表達(dá)載體pFGC5941中，構(gòu)建成植物RNA干擾載體pFGC5941-CCoAOMTi。用獲得的干擾載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞，獲得了含干擾載體的農(nóng)桿菌工程菌。利用含干擾載體的農(nóng)桿菌工程菌轉(zhuǎn)化植物，培育低木質(zhì)素含量植物，利用該方法，獲得了生長正常、木質(zhì)素含量降低的轉(zhuǎn)基因植物，為培育低木質(zhì)素牧草、造紙植物等提供種質(zhì)資源。
文檔編號(hào)A01H4/00GK103146745SQ20131007941
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月13日
發(fā)明者韓陽, 王紅艷, 段亞楠, 盧福榮, 茹藝, 李曹娜 申請人:遼寧大學(xué)