專利名稱：無菌斑馬魚的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種無菌斑馬魚的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
在1870年由巴斯德和科赫提出的細(xì)菌疾病理論極大的改變了我們的概念化，以及說明了我們與微生物的各種關(guān)系。細(xì)菌理論研究的成果在醫(yī)學(xué)和公共衛(wèi)生方面有著意義深遠(yuǎn)的進(jìn)步，以及對(duì)微生物有一個(gè)廣泛的概念化，例如病原體。在宿主與微生物相互作用關(guān)系中，那種長期以病原體為中心的觀點(diǎn)會(huì)讓我們忽視這一個(gè)事實(shí)，即動(dòng)物所遇到的大多數(shù)微生物并沒有引起明顯的疾病，并且可以被認(rèn)為是與宿主在共生或者互利共生關(guān)系的移住民。這些微生物居民包括細(xì)菌，古細(xì)菌以及真核微生物，其中有許多不能在體外培養(yǎng)。在基因組時(shí)代，對(duì)非致病的宿主與微生物之間相互作用的研究讓我們受益巨大，并讓我們對(duì)這些微生物群落的組成和能力的認(rèn)知顯著擴(kuò)增。這項(xiàng)研究大主體已經(jīng)建立，即動(dòng)物微生物非致病成員在動(dòng)物正常出生后的發(fā)育及生理方面發(fā)揮了顯著的作用，從體內(nèi)免疫穩(wěn)態(tài)到新陳代謝方面。此外，微生物群還和許多疾病的發(fā)病有關(guān)，包括過敏，炎癥性腸道疾病，癌癥以及肥胖。對(duì)宿主和其定植微生物之間分子交流的理解的提高使我們有希望找到促進(jìn)人類和動(dòng)物健康的新醫(yī)療策略。我們現(xiàn)在所知道的關(guān)于微生物群落如何有助于宿主的生物學(xué)和病理學(xué)都是從研究無菌動(dòng)物所獲得的。無菌這個(gè)詞是來源于希臘詞語“gnosis”(knowledge)和“bios”(life)，并且指一種實(shí)驗(yàn)環(huán)境即環(huán)境里所有的微生物都是確定的或者是沒有的。無菌實(shí)驗(yàn)的建立是根據(jù)在沒有任何微生物條件下養(yǎng)殖動(dòng)物的能力，用特定的微生物菌種在其體內(nèi)定植或者更復(fù)雜的協(xié)作。無菌實(shí)驗(yàn)的概念可以追溯到巴斯德，他在1885提出的假設(shè)即動(dòng)物在沒有微生物的條件下是不可能存活的。這個(gè)假設(shè)僅在11年后就被推翻了，1896年
Nuttal和Thierfelder用無菌剖腹產(chǎn)生產(chǎn)第一個(gè)無菌動(dòng)物-豚鼠，并且養(yǎng)到13天。這一
開始報(bào)導(dǎo)不久以后就成功生產(chǎn)出無菌小雞，山羊和一群其他動(dòng)物，鳥類和兩棲動(dòng)物。盡管這些早期的研究證實(shí)動(dòng)物可以在沒有微生物的條件下存活，但是無菌脊椎動(dòng)物連續(xù)的生產(chǎn)至始至終都沒有獲得成功，直到1940年Reyniers和他的同事在圣母大學(xué)以及Gustafsson和他同事在倫德大學(xué)才能獲得成功。無菌脊椎動(dòng)物連續(xù)的生產(chǎn)的成功主要是由于在無菌動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)獲得關(guān)鍵的進(jìn)展。雖然無菌動(dòng)物的可行性推翻了巴斯德的假設(shè)，但是在一方面是對(duì)的，即沒有微生物情況下會(huì)影響動(dòng)物生物學(xué)的許多方面。盡管大多數(shù)的無菌脊椎動(dòng)物的研究都集中在哺乳動(dòng)物和鳥類，但是也有人試圖在無菌條件下養(yǎng)殖魚類。Baker和Ferguson是第一次報(bào)導(dǎo)成功獲得無菌魚,卵胎生新月魚，在卵黃吸收后用殺菌飼料喂養(yǎng)可以存活幾周時(shí)間。在這一發(fā)現(xiàn)之后又成功獲得了無菌卵生羅非魚，多卵生鮭魚種類，多卵胎生花鏘科魚類和多卵生紅鱸。盡管這些開創(chuàng)性的報(bào)導(dǎo)證實(shí)無菌魚可以在一定時(shí)間內(nèi)存活，但是他們不包括無菌魚的基本形態(tài)和生理特性，也沒有說明無菌魚的特定營養(yǎng)需求， 也沒有評(píng)估用微生物在無菌魚定植的結(jié)果，也不能獲得生長到性成熟的無菌魚。
在過去的三十年里，斑馬魚已經(jīng)成為一個(gè)重要的基礎(chǔ)和生物醫(yī)學(xué)研究的模式動(dòng)物。斑馬魚卵是在體外受精的，這導(dǎo)致胚胎在孵化成為自由生活幼魚之前一一受精后3天是在它的保護(hù)膜內(nèi)發(fā)育的。斑馬魚幼魚開始進(jìn)食是在受精后5天，以及幼體魚到成魚的變態(tài)發(fā)育是在受精后14天開始。斑馬魚具有額外的吸引性特征來分析宿主和微生物之間的相互作用，包括豐富的遺傳學(xué)背景和基因資源，在發(fā)育過程中光透明特性允許我們?cè)隗w內(nèi)觀察宿主和微生物細(xì)胞，并且可以控制進(jìn)一步基因篩選(宿主和微生物都可以)和化學(xué)篩選。這些屬性，結(jié)合斑馬魚和哺乳動(dòng)物基因組，解剖水平和生理水平之間有廣泛的同源性，讓斑馬魚作為人類生物學(xué)和病理學(xué)一個(gè)有用的模式動(dòng)物。無菌動(dòng)物模式便于分子一系列的參數(shù)，首先，無菌動(dòng)物可以用于研究微生物如何定植或者微生物代謝產(chǎn)物如何影響宿主生物進(jìn)程，包括基因表達(dá)，發(fā)育，生理，免疫和壽命。這可以使無菌動(dòng)物在特 定時(shí)間點(diǎn)暴露在個(gè)別菌種，特定的微生物或者產(chǎn)物然后分析宿主的反應(yīng)來完成。宿主的功能和微生物的基因產(chǎn)物可以通過在相應(yīng)的菌種進(jìn)行基因操作來檢測。第二，無菌動(dòng)物是一個(gè)非常好的平臺(tái)去研究微生物與微生物之間的相互作用在活體宿主的生理環(huán)境內(nèi)。我們可以用確定的微生物種類或者基因型組合讓它們定植在無菌宿主體內(nèi)，然后就可以用培養(yǎng)或DNA序列檢測微生物群落在活體內(nèi)之間的競爭。這些宿主與微生物以及微生物和微生物之間的相互作用可以作為一個(gè)函數(shù)用來分析微生物基因型，群落競爭，宿主基因型，宿主發(fā)育階段，宿主生理,宿主體內(nèi)定植微生物的歷史,解剖學(xué)定位,飲食和其他環(huán)境和生理參數(shù)。除了無菌斑馬魚和無菌哺乳動(dòng)物之間這些實(shí)驗(yàn)技術(shù)是共享的，斑馬魚還有著獨(dú)特的優(yōu)勢，所以斑馬魚應(yīng)該在無菌生物學(xué)領(lǐng)域受到重視。其中一個(gè)優(yōu)勢是斑馬魚在發(fā)育的早期特性的光透明性允許我們觀察宿主活體細(xì)胞，微生物細(xì)胞以及分子事件。盡管只能在光學(xué)亮視野內(nèi)觀察活斑馬魚的細(xì)胞和微生物的細(xì)胞，但是這些研究可以通過用宿主或者微生物的基因工程改造特定的調(diào)節(jié)序列去表達(dá)報(bào)告熒光蛋白來增強(qiáng)。此外，外界提供的熒光探針可以在體外或體內(nèi)檢測特定的細(xì)胞型和生物學(xué)進(jìn)程。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種無菌斑馬魚的生產(chǎn)方法。本發(fā)明所提供的無菌斑馬魚的生產(chǎn)方法，具體可包括如下步驟:(I)將斑馬魚受精卵置于AB-GZM溶液中，于25-29°C，且溫差小于0.5°C的條件下培養(yǎng)3-8h ；(2)將步驟(I)處理后的所述受精卵用所述AB-GZM溶液進(jìn)行漂洗；(3)將步驟(2)漂洗后的所述受精卵置于濃度為0.005g/L的聚維酮碘水溶液中，浸泡l-2min (注意:不能超過2min，否則會(huì)增加胚胎死亡率)；(4)將步驟(3)浸泡后的所述受精卵用無菌GZM溶液進(jìn)行漂洗；(5)將步驟(4)漂洗后的所述受精卵用漂白劑漂白10_20min，期間可輕輕搖晃幾次，使所述受精卵懸浮在所述漂白劑中，注意溶液不要有汽包；所述漂白劑為濃度為0.02g/L的次氯酸鈉水溶液。(6)將步驟(5)漂白后的所述受精卵用所述無菌GZM溶液進(jìn)行漂洗，漂洗后將所述受精卵置于所述無菌GZM溶液中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25-29°C，光周期為LlO:D14至L14:D10,直至所述受精卵孵化得到幼體魚；(7)對(duì)所述幼體魚每天進(jìn)行所述無菌GZM溶液的半量換液(即將舊的培養(yǎng)液去除一半體積，補(bǔ)充相應(yīng)體積的新的所述無菌GZM溶液；同時(shí)注意第一次換液的時(shí)候須把卵膜吸出去以免影響水質(zhì))培養(yǎng)，直至所述幼體魚長成為目的大小的斑馬魚，從所述目的大小的斑馬魚中獲得目的無菌斑馬魚。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述目的大小的斑馬魚具體為所述受精卵孵化后1-6天的斑馬魚。所述GZM溶液的溶劑為水，溶質(zhì)為海鹽；所述海鹽在所述GZM溶液的含量為每升所述GZM溶液中含有60mg所述海鹽。所述AB-GZM溶液的溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下:250ng/mL的兩性霉素Β、5 μ g/mL的卡那霉素、100 μ g/mL的氨節(jié)霉素、10U/ml的青霉素、10U/ml的鏈霉素、59 μ g/mL的所述海鹽。在上述方法中，步驟(1)中，所述培養(yǎng)的溫度具體為28.5°C ;所述培養(yǎng)的時(shí)間具體為 4.5h。在上述方法中，步驟(3)中，所述浸泡的時(shí)間具體為lmin。在上述方法中，步驟(5)中，所述漂白的時(shí)間具體為15min。在上述方法中，步驟(6)中，所述培養(yǎng)的溫度具體為28.5°C ;所述培養(yǎng)的光周期具體為L14:D10 ;將所述受精卵置于所述無菌GZM溶液中培養(yǎng)，培養(yǎng)密度為每IOOmL所述無菌GZM溶液中培養(yǎng)40-60個(gè)(如50個(gè))所述受精卵。在上述方法中，步驟(7)中，從所述目的大小的斑馬魚中獲得所述目的無菌斑馬魚的方法具體可包括如下步驟:對(duì)已用于培養(yǎng)所述目的大小的斑馬魚的所述GZM溶液進(jìn)行無菌性檢測，經(jīng)檢測無菌的所述GZM溶液中培養(yǎng)的所述目的大小的斑馬魚即視為無菌斑馬魚。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述“對(duì)已用于培養(yǎng)所述目的大小的斑馬魚的所述GZM溶液進(jìn)行無菌性檢測”的方法具體為TSA平板培養(yǎng)法或16sV3PCR法。更加具體的，所述TSA平板培養(yǎng)法包括如下步驟:將待測培養(yǎng)液涂布于TSA平板上，于25-29°C (如28.5°C)在有氧條件下培養(yǎng)一周，觀察平板上是否有菌落生長。如果平板上有菌落生長，則用所測培養(yǎng)液飼養(yǎng)的斑馬魚并非無菌，再進(jìn)一步培養(yǎng)過程中，將其去除；如果平板上沒有菌落生長，則確定用所測培養(yǎng)液飼養(yǎng)的斑馬魚為無菌斑馬魚。所述16sV3PCR法包括如下步驟:以待測培養(yǎng)液為模板，用針對(duì)細(xì)菌16S核糖體DNAV3區(qū)的一段保守序列設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物有大小為198bp的目的條帶，則用所測培養(yǎng)液飼養(yǎng)的斑馬魚并非無菌，再進(jìn)一步培養(yǎng)過程中，將其去除；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物沒有大小為198bp的目的條帶，則確定用所測培養(yǎng)液飼養(yǎng)的斑馬魚為無菌斑馬魚。在上述方法中，步驟(2)、步驟(4)和步驟(6)中的所述漂洗均可漂洗3次。在上述方法中，還包括自受精后第5天對(duì)斑馬魚進(jìn)行喂食的步驟。所喂食物可為無菌的四膜蟲。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，具體為無菌的嗜熱四膜蟲。其喂食頻率為兩天一次，每次喂食量為每ImL所述GZM溶液(飼養(yǎng)斑馬魚過程中所用的GZM溶液)添加300條所述無菌的嗜熱四膜蟲。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種AB-GZM溶液。
本發(fā)明所提供的AB-GZM溶液，溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下:250ng/mL的兩性霉素Β、5μ g/mL的卡那霉素、100 μ g/mL的氨節(jié)霉素、10U/ml的青霉素、10U/ml的鏈霉素、59 μ g/mL的海鹽。所述AB-GZM溶液在生產(chǎn)無菌魚中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。在上述應(yīng)用中，所述無菌魚具體可為無菌斑馬魚。在本發(fā)明中，所有的所述斑馬魚均具體為TU系斑馬魚。所述海鹽為海水蒸發(fā)后所得的鹽。在本發(fā)明中，所有的所述海鹽均為紅珊瑚海鹽；具體為紅珊瑚海鹽銷售中心(北京)產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為h-38。本發(fā)明通過自然繁殖獲得斑馬魚受精卵，然后通過一系列的抗生素和化學(xué)物質(zhì)處理，獲得無菌的胚胎，最后放置在無菌的環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，最終獲得無菌斑馬魚。本發(fā)明為研究微生物與斑馬魚之間的相互作用及許多生物學(xué)進(jìn)程提供了方便的材料，對(duì)于人們進(jìn)一步研究微生物和其脊椎動(dòng)物宿主之間關(guān)系的內(nèi)在機(jī)制也具有十分重要的參考意義。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中，光周期Lx:Dy表示每天光照時(shí)長X小時(shí),黑暗時(shí)長y小時(shí)，x+y=24。斑馬魚:為來自 于北京大學(xué)的TU系斑馬魚，記載在“楊寒朔，湯明海，鄧洪新等.納升超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測斑馬魚胚胎中小分子多肽的初步研究.四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2007年第06期”一文中，公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所獲得。嗜熱四膜蟲(Tetrahymena thermophila):記載在“張玉軍,王清路,孔浩.溜博市孝婦河不同區(qū)段水質(zhì)對(duì)四膜蟲有性生殖的影響.安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，16 (11):58-59” 一文中，公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所獲得。兩性霉素B、卡那霉素、氨芐霉素、聚維酮碘(聚乙烯吡咯烷酮與碘的絡(luò)合物)(polyvinyl pyrrolidone-1odine complex, PVP-1)、青霉素購、鏈霉素均購自 Sigma 公司。漂白劑:母液:濃度為10g/L的次氯酸鈉水溶液；工作液:濃度為0.02g/L的次氯酸鈉水溶液。海鹽:紅珊瑚海鹽，為紅珊瑚海鹽銷售中心(北京)產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為h-38。GZM溶液:將IL水與1.5mL海鹽溶液(40g海鹽每L水)混合，混合后高壓滅菌。合計(jì)所述GZM溶液中海鹽的含量為60mg/L。兩性霉素B儲(chǔ)存液(250 μ g/mL),卡那霉素儲(chǔ)存液(10mg/mL)，氨芐霉素儲(chǔ)存液(20mg/mL),青霉素-鏈霉素儲(chǔ)存液(青霉素和鏈霉素的含量均為IU/μ L)。以上各儲(chǔ)存液的溶劑均為水。AB-GZM溶液:將49.6mL的GZM溶液、50 μ L的兩性霉素B儲(chǔ)存液、25 μ L的卡那霉素儲(chǔ)存液、250 μ L的氨芐霉素儲(chǔ)存液和500 μ L的青霉素-鏈霉素儲(chǔ)存液混合,混合后用
0.2 μ m過濾器過濾，分裝到50-ml錐形管，_20°C保存。合計(jì)所述AB-GZM溶液中兩性霉素B的含量為250ng/mL,卡那霉素的含量為5 μ g/mL,氨節(jié)霉素的含量為100 μ g/mL,青霉素和鏈霉素的含量各為10U/mL，海鹽的含量為59 μ g/mL。實(shí)施例1、無菌斑馬魚的生產(chǎn)及效果評(píng)價(jià)
(I)下午喂食后兩個(gè)小時(shí)，將一對(duì)性成熟斑馬魚放到一個(gè)干凈的斑馬魚孵化缸中，中間放置透明隔板把雌雄魚隔開，水由無菌過濾系統(tǒng)提供。(2)第二天早上8:00把隔板取走，自然狀態(tài)下雌魚產(chǎn)卵,雄魚進(jìn)行體外受精，Ih后把魚轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)魚缸，立即用吸管收集受精卵，轉(zhuǎn)移至裝有AB-GZM溶液的滅菌的廣口瓶中，28.5°C培養(yǎng)4.5h (提示:3-8h均可)。(3)去除帶白點(diǎn)或泛白的低質(zhì)量受精卵，選取透明且保護(hù)膜完整的高質(zhì)量受精卵進(jìn)行以下操作，用時(shí)約30min ；(4)用AB-GZM溶液漂洗步驟(3)中選取的受精卵，漂洗3次(用時(shí)約lOmin)，然后將受精卵輕輕浸入濃度為0.005g/L的PVP-1水溶液中，浸泡lmin。(注意:不能超過2min，否則會(huì)增加受精卵胚胎的死亡率)(5)用無菌的GZM溶液漂洗經(jīng)步驟(4)處理后的受精卵，漂洗3次(用時(shí)約lOmin)，然后用次氯酸鈉濃度為0.02g/L的漂白劑工作液(用蒸餾水稀釋漂白劑母液后獲得)加滿廣口瓶，蓋緊。漂白15min (提示:10-20min均可)，期間隔段時(shí)間輕輕搖晃，使受精卵懸浮在漂白劑里。注意溶液中盡量不要有氣泡。(6)用無菌的GZM溶液漂洗經(jīng)步驟(5)處理后的受精卵，漂洗3次(用時(shí)約lOmin)，然后將受精卵轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中或者12孔板中培養(yǎng)，培養(yǎng)密度為每IOOml的GZM溶液中養(yǎng)50個(gè)受精卵胚胎，放置于超凈臺(tái)或者細(xì)胞培養(yǎng)箱中，于溫度28.5°C，光周期L14:D10的條件下
進(jìn)行養(yǎng)殖。(8) 48-72h后，受精卵胚胎孵化成幼體魚，之后每天進(jìn)行半量換液，即去除一半體積的舊的培養(yǎng)液，同時(shí)補(bǔ)充等體積的無菌的GZM溶液。(9)自受精 卵胚胎孵化成幼體魚后，每天一方面定時(shí)觀察斑馬魚生存狀態(tài)并統(tǒng)計(jì)其存活率，另一方面定時(shí)取100 μ L培養(yǎng)液進(jìn)行TSA平板培養(yǎng)，取10 μ L培養(yǎng)液進(jìn)行16sV3PCR來檢測所得斑馬魚的無菌性。其中，存活率=觀察時(shí)存活的斑馬魚數(shù)目/步驟(3)中所選取的受精卵數(shù)目 X 100%;無菌率=無菌斑馬魚數(shù)目/存活的斑馬魚數(shù)目X 100%TSA平板培養(yǎng)法檢測斑馬魚無菌性的操作方法:將待測的培養(yǎng)液涂布于TSA平板上，倒置后于28.5°C在有氧條件下培養(yǎng)一周，觀察平板上是否有菌落生長。結(jié)果判斷方法:如果平板上有菌落生長，則用所測培養(yǎng)液飼養(yǎng)的斑馬魚并非無菌，再進(jìn)一步培養(yǎng)過程中，將其去除；如果平板上沒有菌落生長，則確定用所測培養(yǎng)液飼養(yǎng)的斑馬魚為無菌斑馬魚。其中，TSA 平板:Trypticase Soy Broth (OXOID, England),貨號(hào)為 CM0129，按 30g/L 加 20g 瓊脂高壓滅菌后，倒板，冷卻后即可以用。16sV3PCR法檢測斑馬魚無菌性的原理:根據(jù)細(xì)菌在16S核糖體DNA V3區(qū)的一段保守序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段為198bp。檢測方法:以待測的培養(yǎng)液為模板，用16s核糖體RNA目標(biāo)基因來檢測容器中任何細(xì)菌的存在。反應(yīng)體系為:10 X PCR buffer2.5 μ I，dNTP mix (2.5mmol/L) 2 μ I，弓 I 物 338F (20 μ mol/L) 0.5 μ I，引物519R(20ymol/L)0.5μ 1，rTaq(2.5U/μ L) 0.5 μ 1，10 μ I 模板，4 μ I 水總體積 20 μ I。PCR反應(yīng)程序?yàn)?94°C 5min ；94°C 30s, 53°C 30s, 72°C 30s，30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 lOmin。結(jié)果判斷方法:如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物有大小為198bp的目的條帶，則用所測培養(yǎng)液飼養(yǎng)的斑馬魚并非無菌，再進(jìn)一步培養(yǎng)過程中，將其去除；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物沒有大小為198bp的目的條帶，則確定用所測培養(yǎng)液飼養(yǎng)的斑馬魚為無菌斑馬魚。338F:5’ _CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG_3’ ；519R: 5，-ATTACCGCGGCTGCTGG-3，。(10)自受精卵形成后第5天，對(duì)幼體斑馬魚進(jìn)行喂食。每兩天喂一次(溫馨提示:請(qǐng)指明喂食的頻率。如每天喂多少次，或每隔多長時(shí)間喂一次)。每次喂食按照如下操作進(jìn)行:把培養(yǎng)好的無菌四膜蟲B2086轉(zhuǎn)移到滅菌的EP管中，2000rpm離心4min，棄掉上層培養(yǎng)液，用無菌的GZM溶液重新懸浮，之后按照Iml的GZM培養(yǎng)液(飼養(yǎng)斑馬魚過程中所用的GZM溶液)加約300條四膜蟲的量加入培養(yǎng)有斑馬魚的器皿中。其中，無菌嗜熱四膜蟲的培養(yǎng)方法如下:A)四膜蟲的復(fù)蘇:取1 00 μ I四膜蟲保藏液，接到20ml的SPP培養(yǎng)基中，30°C，在135r/min的搖床中培養(yǎng)一周。B)生長:復(fù)蘇好的四膜蟲按1:100 (即ImlSPP培養(yǎng)基加10 μ I四膜蟲)的接種量接到SPP培養(yǎng)基中，30°C，在135r/min的搖床中培養(yǎng)48h。TSA平板培養(yǎng)法驗(yàn)證四膜蟲的無菌性，具體方法及結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)參見步驟(9)中相關(guān)描述。取經(jīng)鑒定無菌的四膜蟲備用。SPP 培養(yǎng)基:2% (2g/100mL)蛋白胨(0X0ID，LP0042), 1% (lg/100mL)酵母提取物(0X0ID，LP0021)，2% (2g/100mL)葡萄糖(國藥，北京)，0.003% (0.003g/100mL)檸檬酸鐵(國藥，北京)；pH7.0。本發(fā)明的發(fā)明人參照上述方法，共進(jìn)行了三次實(shí)驗(yàn)(每次實(shí)驗(yàn)步驟(3 )中所選取的受精卵數(shù)目為400枚)，結(jié)果取三次重復(fù)的平均值。自受精卵胚胎孵化成幼體魚后第1-6天(ldpf_6dpf)，三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)對(duì)斑馬魚的存活率和無菌率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表I所示。從表中可以看出，自受精卵胚胎孵化成幼體魚后第1-6天，斑馬魚的存活率高達(dá)93%以上；到第6天時(shí)，斑馬魚的無菌率仍可達(dá)75%以上。可見，通過本方法，可以簡單快速的獲得無菌斑馬魚，為提供研究微生物與宿主之間的相互作用提供了非常重要的材料。例如致病菌的治病機(jī)制，益生菌的益生效應(yīng)等基礎(chǔ)研究和生物醫(yī)學(xué)研究表I斑馬魚ldpf-6dpf的存活率和無菌率的三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果
權(quán)利要求
1.無菌斑馬魚的生產(chǎn)方法，包括如下步驟: (1)將離體的斑馬魚受精卵置于AB-GZM溶液中，于25-29°C培養(yǎng)3_8h； (2)將步驟(I)處理后的所述受精卵用所述AB-GZM溶液進(jìn)行漂洗； (3)將步驟(2)漂洗后的所述受精卵置于濃度為0.005g/L的聚維酮碘水溶液中，浸泡l_2min ； (4)將步驟(3)浸泡后的所述受精卵用無菌GZM溶液進(jìn)行漂洗； (5)將步驟(4)漂洗后的所述受精卵用漂白劑漂白10-20min； (6)將步驟(5)漂白后的所述受精卵用所述無菌GZM溶液進(jìn)行漂洗，漂洗后將所述受精卵置于所述無菌GZM溶液中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25-29°C，光周期為LlO:D14至L14:D10，直至所述受精卵孵化得到幼體魚； (7)對(duì)所述幼體魚每天進(jìn)行所述無菌GZM溶液的半量換液培養(yǎng)，直至所述幼體魚長成為目的大小的斑馬魚，從所述目的大小的斑馬魚中獲得目的無菌斑馬魚； 所述GZM溶液的溶劑為水，溶質(zhì)為海鹽；所述海鹽在所述GZM溶液的含量為每升所述GZM溶液中含有60mg所述海鹽； 所述AB-GZM溶液的溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下:250ng/mL的兩性霉素Β、5 μ g/mL的卡那霉素、100 μ g/mL的氨節(jié)霉素、10U/ml的青霉素、10U/ml的鏈霉素、59 μ g/mL的海鹽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(I)中，所述培養(yǎng)的溫度為28.5°C ；或 所述培養(yǎng)的時(shí)間為4.5h。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:步驟(3)中，所述浸泡的時(shí)間為lmin。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:步驟(5)中，所述漂白的時(shí)間為15min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:步驟(6)中，所述培養(yǎng)的溫度為28.5 0C ;或 所述培養(yǎng)的光周期為L14:D10。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:步驟(6)中，將所述受精卵置于所述無菌GZM溶液中培養(yǎng)，培養(yǎng)密度為每IOOmL所述無菌GZM溶液中培養(yǎng)40-60個(gè)所述受精卵。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于:步驟(7)中，從所述目的大小的斑馬魚中獲得所述目的無菌斑馬魚的方法包括如下步驟:對(duì)已用于培養(yǎng)所述目的大小的斑馬魚的所述GZM溶液進(jìn)行無菌性檢測，經(jīng)檢測無菌的所述GZM溶液中培養(yǎng)的所述目的大小的斑馬魚即為目的無菌斑馬魚。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于:在所述方法中，還包括自所述受精卵后第5天對(duì)孵化所得斑馬魚進(jìn)行喂食的步驟；所喂食物為無菌的四膜蟲。
9.AB-GZM溶液，其特征在于:所述AB-GZM溶液的溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下:250ng/mL的兩性霉素Β、5 μ g/mL的卡那霉素、100 μ g/mL的氨節(jié)霉素、10U/ml的青霉素、10U/ml的鏈霉素、59 μ g/mL的海鹽。
10.權(quán)利要求9所述AB-GZM溶液在生產(chǎn)無菌魚中的應(yīng)用； 所述無菌魚具體為無菌斑馬魚。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種無菌斑馬魚的生產(chǎn)方法。該方法包括如下步驟1)將斑馬魚受精卵置于AB-GZM溶液中，于25-29℃培養(yǎng)3-8h；2)用所述AB-GZM溶液漂洗；3)用0.005g/L的聚維酮碘水溶液浸泡1-2min；4)用無菌GZM溶液漂洗；5)用漂白劑漂白10-20min；6)用所述無菌GZM溶液漂洗，漂洗后，將受精卵置于所述無菌GZM溶液中培養(yǎng)，溫度為25-29℃，光周期為L10D14至L14D10；7)待胚胎孵化后，每天進(jìn)行所述無菌GZM溶液的半量換液；從孵化后的斑馬魚中獲得無菌斑馬魚。本發(fā)明通過自然繁殖獲得斑馬魚受精卵，最終獲得無菌斑馬魚；本發(fā)明為研究微生物與斑馬魚之間的相互作用及多生物學(xué)進(jìn)程提供了方便的材料，對(duì)進(jìn)一步研究微生物和其脊椎動(dòng)物宿主之間關(guān)系的內(nèi)在機(jī)制也具有十分重要的參考意義。
文檔編號(hào)A01K61/00GK103141425SQ20131009624
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月25日
發(fā)明者周志剛, 覃初斌, 徐俐, 楊雅麟, 何夙旭, 張美超, 李青, 余強(qiáng) 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所