專利名稱：用于誘導(dǎo)蘭科植物內(nèi)生真菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蘭科植物原地共生萌發(fā)的一項(xiàng)容器育苗技術(shù)，對(duì)于瀕危蘭科植物的保護(hù)和培育種苗工作開辟了一條新的可行途徑。
背景技術(shù)：
蘭科植物是一個(gè)十分龐大的家族，在被子植物中僅次于菊科植物。在某種程度上蘭科植物的保護(hù)也就意味著對(duì)地球生物多樣性未來的保護(hù)。蘭科植物的種子數(shù)量龐大，一般每個(gè)蒴果內(nèi)都有上萬粒種子，最多可達(dá)40萬粒種子。然而蘭科植物種子細(xì)小，無胚乳，僅有發(fā)育不完全的原胚，自然條件下種子萌發(fā)所需的營養(yǎng)物質(zhì)必須借助于共生的真菌來提供。通常對(duì)于蘭科植物種子的萌發(fā)，都采用種子無菌萌發(fā)的方式進(jìn)行非共生培養(yǎng)，萌發(fā)率很高，但是在成苗移栽過程中，由于缺乏與其對(duì)應(yīng)的共生菌建立互惠共生的關(guān)系，因而存活率較低。目前對(duì)于種子共生萌發(fā)研究所用的真菌多是從蘭科植物菌根中分離得到的。而根系中所具有的微生物是一個(gè)龐大復(fù)雜的體系，在菌根中含有對(duì)種子萌發(fā)有益的真菌和大量作用未知的內(nèi)生真菌，這使得有益真菌的篩選工作變得復(fù)雜而繁瑣。因此如何有效獲得蘭科植物種子萌發(fā)的促生菌成為了蘭科植物保護(hù)的重要決定因素。蘭花分布范圍狹窄再加上種子微小，在種子萌發(fā)的最初階段它們很難被發(fā)現(xiàn)，因而人們對(duì)其共生真菌的了解也甚少。目前人們通常采用種子袋原地共生萌發(fā)的技術(shù)分離促生真菌，即將蘭科植物的種子裝入特制的種子袋，埋于蘭科植株原生環(huán)境中。一段時(shí)間后，回收種子袋并觀察種子是否萌發(fā)，進(jìn)而分離并篩選出促進(jìn)種子萌發(fā)的有益真菌。但是由于種子袋自身空間 體積的限制，以及埋在土壤中缺乏光照因素的刺激，極大程度上阻礙了蘭科植物種子的萌發(fā)及生長(zhǎng)。在前人所做的種子袋原地共生萌發(fā)試驗(yàn)中，所得結(jié)果并非十分理想。其中很大一部分蘭科植物的種子沒有萌發(fā)或萌發(fā)周期較長(zhǎng)，少部分種子萌發(fā)后又由于種子袋網(wǎng)孔口徑過窄，或是空間限制的因素。種子的萌發(fā)往往停留于原球莖的階段，不能很好地發(fā)育成苗，因而造成了在研究蘭科植物與共生真菌相互作用和生物間的協(xié)同進(jìn)化時(shí)一直處于兩個(gè)極端的狀態(tài)。而我們知道蘭科植物由于生長(zhǎng)習(xí)性的特殊導(dǎo)致在植物自身發(fā)育的不同階段都會(huì)有不同的共生菌對(duì)該植物起到促生作用，因此需要進(jìn)行動(dòng)態(tài)的研究分析。由于種子袋無法滿足需求，而且種子袋選材的特殊性致使制作步驟繁瑣、造價(jià)成本過高，觀察記錄時(shí)也會(huì)存在眾多問題。因而近些年來國內(nèi)外對(duì)于蘭科植物種子原地共生萌發(fā)的研究一直未有突破性的進(jìn)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服上述種子袋原地共生萌發(fā)方法存在的缺點(diǎn)，提供一種操作簡(jiǎn)單、成本低的用于誘導(dǎo)蘭科植物內(nèi)生真菌的方法。解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案由下述步驟組成:1、果莢的低溫處理選取健壯且性狀優(yōu)良的蘭科植株進(jìn)行人工雜交，待授粉18周后采摘形態(tài)飽滿發(fā)育成熟的果莢，放入冰箱中4°C保存。2、制作育苗杯取透明的一次性塑料杯，將尼龍網(wǎng)覆于塑料杯杯口，用回形針卡死，再用剪刀除去杯底，制作成育苗杯。3、種子播種將步驟I低溫處理后的果莢沿縱肋刨開，取出果莢內(nèi)的種子，將種子與草木灰按體積比為1:500 1000混合拌勻，將制作好的育苗杯倒置，用毛筆蘸取拌勻后的種子，按3 5粒/cm2的密度由育苗杯杯底殘口處均勻地播灑在杯內(nèi)的尼龍網(wǎng)上，在育苗杯底的殘口處覆一層紗布，用橡皮筋固定包扎。4、樣地的選擇選取生長(zhǎng)狀況良好的野生蘭科植株，在靠近成年植株的根部周圍挖深度為3 5cm的圓柱形坑，坑的口徑與塑料杯口直徑相同，將育苗杯倒置于挖好的坑內(nèi)，播灑種子的尼龍網(wǎng)與坑底的土壤充分接觸，用土填埋空隙加固育苗杯，灑水澆透育苗杯周圍的土壤，土壤的含水量為60% 80%。5、內(nèi)生真菌的分離篩選定期觀測(cè)育苗杯 內(nèi)種子的萌發(fā)狀況，根據(jù)需要回收不同生長(zhǎng)階段的蘭科植物幼苗，采用常規(guī)分離方法分離純化有效內(nèi)生真菌。本發(fā)明方法可用于白及、鐵皮石斛等蘭科植物。本發(fā)明步驟3中所述的尼龍網(wǎng)的孔徑可以根據(jù)具體蘭科植物種子的體積大小來確定。本發(fā)明的有益效果:與現(xiàn)有的種子袋技術(shù)相比，本發(fā)明方法中所采用的育苗杯更為牢固穩(wěn)定，能很好的為蘭科植物種子的萌發(fā)提供一個(gè)有效的保護(hù)屏障，從而抵擋惡劣的氣候條件及其他不良因素的干擾，有效地解決了在使用種子袋中遇到的種子流動(dòng)結(jié)團(tuán)的問題。同時(shí)由于育苗杯具有優(yōu)良的透光性以及空間體積較大等優(yōu)點(diǎn)，因而更有利于蘭科植物種子的萌發(fā)和幼苗的發(fā)育，且在觀察時(shí)，可以直接透過育苗杯壁或揭開紗布從育苗杯的頂端來觀察種子的萌發(fā)狀況，而不會(huì)對(duì)發(fā)育中的幼苗造成任何損害。本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單、取材方便、成本較低，且種子出苗率高，可以根據(jù)需要選取不同發(fā)育階段的幼苗進(jìn)行有效菌種的分離，為瀕危蘭科植物的保護(hù)和種苗的培育開辟了一條新的可行途徑。


圖1是育苗杯的制作流程及使用方法示意圖。圖2是原地共生萌發(fā)試驗(yàn)中育苗杯的實(shí)例圖。圖3是播種I個(gè)月后育苗杯內(nèi)白及種子的萌發(fā)狀況。圖4是播種3個(gè)月后種子萌發(fā)生成的白及幼苗。
具體實(shí)施方案下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。實(shí)施例11、果莢的低溫處理
選取健壯且性狀優(yōu)良的白及植株進(jìn)行人工雜交，并作套袋處理，待授粉18周后采摘形態(tài)飽滿發(fā)育成熟的白及果莢，將采摘的果莢裝入牛皮紙袋中，置于通風(fēng)陰涼處晾至果莢的顏色變?yōu)樽攸S色且果莢外殼完全脫水，置于冰箱中4°C保存。2、制作育苗杯如圖1所示，選取450mL透明無色的一次性塑料杯，按照塑料杯杯口的口徑剪取單層40目的尼龍網(wǎng)，并覆于塑料杯杯口，用回形針卡死，再用剪刀除去塑料杯的杯底。3、種子播種用刀片將步驟I低溫處理后的白及果莢沿縱肋刨開，取出果莢內(nèi)的種子，將種子與草木灰按體積比為1:500混合拌勻，將步驟2制作好的育苗杯倒置，用毛筆蘸取拌勻后的白及種子，按5粒/cm2的密度由育苗杯杯底殘口處均勻地播灑在杯內(nèi)的尼龍網(wǎng)上，在育苗杯底的殘口處覆一層紗布，并用橡皮筋固定包扎。4、樣地的選擇選取生長(zhǎng)狀況良好且生于陰坡的野生白及植株，在其周圍用小鏟挖深度為3cm的圓形小坑，坑的口徑與育苗杯杯口直徑一致，將育苗杯放置于挖好的坑內(nèi)，確保播灑種子的尼龍網(wǎng)與坑底的土壤充分接觸，同時(shí)在地表以上遺留一部分的育苗杯，以利于陽光的照射及育苗杯的監(jiān)測(cè)回收，最后用土填埋空隙以加固育苗杯，并灑水澆透其周圍的土壤，使土壤的含水量為60%。5、內(nèi)生真菌的分離篩選定期透過塑料杯壁或揭開紗布從育苗杯的頂端觀察種子的萌發(fā)狀況，根據(jù)需要選擇不同生長(zhǎng)階段的的白及幼苗，采用常規(guī)分離方法分離純化有效內(nèi)生真菌。

實(shí)施例21、果莢的低溫處理選取健壯且性狀優(yōu)良的鐵皮石斛植株進(jìn)行人工雜交，并作套袋處理，待授粉18周后采摘形態(tài)飽滿發(fā)育成熟的鐵皮石斛果莢，置于冰箱中4°C保存。2、制作育苗杯選取450mL透明無色的一次性塑料杯，按照塑料杯杯口的口徑剪取單層60目的尼龍網(wǎng)，并覆于塑料杯杯口，用回形針卡死,再用剪刀除去塑料杯的杯底。3、種子播種用刀片將步驟I低溫處理后的鐵皮石斛果莢沿縱肋刨開，取出果莢內(nèi)的種子，將種子與草木灰按體積比為1:1000混合拌勻，將步驟2制作好的育苗杯倒置，用毛筆蘸取拌勻后的鐵皮石斛種子，按3粒/cm2的密度由育苗杯杯底殘口處均勻地播灑在杯內(nèi)的尼龍網(wǎng)上，在育苗杯底的殘口處覆一層紗布，并用橡皮筋固定包扎。4、樣地的選擇選取生長(zhǎng)狀況良好的野生鐵皮石斛植株，在其周圍用小鏟挖深度為3cm的圓形小坑，坑的口徑與育苗杯杯口直徑一致，將育苗杯放置于挖好的坑內(nèi)，確保播灑種子的尼龍網(wǎng)與坑底的土壤充分接觸，同時(shí)在地表以上遺留一部分的育苗杯，以利于陽光的照射及育苗杯的監(jiān)測(cè)回收，最后用土填埋空隙以加固育苗杯，并灑水澆透其周圍的土壤，使土壤的含水量為80%。5、內(nèi)生真菌的分離篩選
定期透過塑料杯壁或揭開紗布從育苗杯的頂端觀察種子的萌發(fā)狀況，根據(jù)需要選擇不同生長(zhǎng)階段的的鐵皮石斛幼苗，采用常規(guī)分離方法分離純化有效內(nèi)生真菌。為了證明本發(fā)明的有益效果，發(fā)明人采用實(shí)施例1的方法在陜西省安康旬陽縣白柳鎮(zhèn)羊山野生白及撫育基地對(duì)白及植株進(jìn)行原地共生萌發(fā)育苗，育苗杯使用過程中的樣地選擇以及埋藏的深度可以根據(jù)具體的實(shí)際情況而定(如圖2所示)，圖3是播種I個(gè)月后育苗杯內(nèi)白及種子的萌發(fā)狀況，圖4是播種3個(gè)月后白及種子萌發(fā)生成的幼苗。由圖3可見，播種I個(gè)月后白及種子的萌發(fā)率高，出苗量大，且出苗速度快。由圖4可見，育苗杯內(nèi)的白及幼苗葉片為深綠色，生長(zhǎng)發(fā)育良好，長(zhǎng)勢(shì)較強(qiáng)。因此，我們可以選取不同生長(zhǎng)階段的白及 進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離。
權(quán)利要求
1.一種用于誘導(dǎo)蘭科植物內(nèi)生真菌的方法，其特征在于它由下述步驟組成: (1)果莢的低溫處理 選取健壯且性狀優(yōu)良的蘭科植株進(jìn)行人工雜交，待授粉18周后采摘形態(tài)飽滿發(fā)育成熟的果莢，放入冰箱中4°C保存； (2)制作育苗杯 取透明的一次性塑料杯，將尼龍網(wǎng)覆于塑料杯杯口，用回形針卡死，再用剪刀除去杯底，制作成育苗杯； (3)種子播種 將步驟(I)低溫處理后的果莢沿縱肋 刨開，取出果莢內(nèi)的種子，將種子與草木灰按體積比為1:500 1000混合拌勻，將制作好的育苗杯倒置，用毛筆蘸取拌勻后的種子，按3 5粒/cm2的密度由育苗杯杯底殘口處均勻地播灑在杯內(nèi)的尼龍網(wǎng)上，在育苗杯底的殘口處覆一層紗布，用橡皮筋固定包扎； (4)樣地的選擇 選取生長(zhǎng)狀況良好的野生蘭科植株，在靠近成年植株的根部周圍挖深度為3 5cm的圓柱形坑，坑的口徑與塑料杯口直徑相同，將育苗杯倒置于挖好的坑內(nèi)，播灑種子的尼龍網(wǎng)與坑底的土壤充分接觸，用土填埋空隙加固育苗杯，灑水澆透育苗杯周圍的土壤，土壤的含水量為60% 80% ； (5)內(nèi)生真菌的分離篩選 定期觀測(cè)育苗杯內(nèi)種子的萌發(fā)狀況，根據(jù)需要選擇不同生長(zhǎng)階段的蘭科植物幼苗，采用常規(guī)分離方法分離純化有效內(nèi)生真菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于誘導(dǎo)蘭科植物內(nèi)生真菌的方法，其特征在于:所述的蘭科植物為白及或鐵皮石斛。
全文摘要
一種用于誘導(dǎo)蘭科植物內(nèi)生真菌的方法，以育苗杯替代種子袋進(jìn)行蘭科植物種子的原地共生萌發(fā)及有效內(nèi)生真菌的誘導(dǎo)，解決了蘭科植物在傳統(tǒng)的原地共生萌發(fā)中所遇到的種子結(jié)團(tuán)、萌發(fā)率低、易受氣候條件等不良因素干擾的問題。本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單、取材方便、成本較低，且種子出苗率高，可以根據(jù)需要選取不同發(fā)育階段的幼苗進(jìn)行有效菌種的分離，為瀕危蘭科植物的保護(hù)和種苗的培育開辟了一條新的可行途徑。
文檔編號(hào)A01G7/00GK103238470SQ20131015274
公開日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2013年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月27日
發(fā)明者肖婭萍, 呂鼎豪, ?？》? 王喆之, 任倩俐 申請(qǐng)人:陜西師范大學(xué)