專(zhuān)利名稱(chēng)：茉莉花愈傷組織誘導(dǎo)及繼代保持的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種茉莉花愈傷組織誘導(dǎo)及繼代保持的方法。
背景技術(shù)：
茉莉花為木犀科素馨屬(或茉莉?qū)?亞熱帶常綠灌木。茉莉花樹(shù)冠直立或半開(kāi)展?fàn)?，花冠白色，極芳香，花期較長(zhǎng)；《本草綱目》中記載其花、葉、根均可入藥，根能理氣、活血、安神鎮(zhèn)痛，花能開(kāi)郁、辟穢，葉能消腫解毒，近代研究也表明，茉莉花根提取物具有抗心律失常、鎮(zhèn)靜催眠、抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)、降低耗氧率等作用。其在盆栽觀(guān)賞、園林綠化、花茶窖制、香料生產(chǎn)等方面得到了廣泛應(yīng)用。因此，在我國(guó)茉莉花已滲透到人們的社會(huì)生活中，是我國(guó)既具觀(guān)賞價(jià)值又具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的重要園林花卉，也是中國(guó)的文化符號(hào)之一。然而，隨著近年來(lái)茉莉花茶市場(chǎng)下滑，加上花色單一，致使茉莉花栽培面積大大縮水，為了茉莉花產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，必須大力發(fā)展茉莉花新品種選育，但傳統(tǒng)的育種方法對(duì)于茉莉花有很大局限性。另一方面，對(duì)于茉莉花的研究還主要集中在栽培加工技術(shù)和理化性質(zhì)分析等前期研究方面，有關(guān)茉莉花生物技術(shù)研究還鮮見(jiàn)報(bào)道，雖然近年來(lái)茉莉花的組織培養(yǎng)有所報(bào)道，但相關(guān)的文獻(xiàn)和研究還較少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種茉莉花愈傷組織誘導(dǎo)及繼代保持的方法。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問(wèn)題的:一種茉莉花愈傷組織誘導(dǎo)及繼代保持的方法，包括以下步驟:
(I)外植體處理:從生長(zhǎng)健壯的母株上剪取當(dāng)年生枝條或花器官，去除葉片后洗凈、消毒，在無(wú)菌條件下切取長(zhǎng)0.5cm的莖段或花器官組織作為接種的外植體；(2)誘導(dǎo)培養(yǎng):將外植體接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，并于溫度23 25°C，光照強(qiáng)度1500 20001χ，每天光照12h的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)30天，得初代愈傷組織；(3)繼代保持:將初代愈傷組織轉(zhuǎn)接于繼代培養(yǎng)基中，并于溫度23 25°C，光照強(qiáng)度1500 20001χ，每天光照12h的條件下進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，直至獲得生長(zhǎng)一致且生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織，同時(shí)用所述繼代培養(yǎng)基長(zhǎng)期保持愈傷組織。進(jìn)一步地,所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括下述成分:MS培養(yǎng)基、6-節(jié)氨基腺嘌呤2.0mg/L、α -萘乙酸0.2mg/L、蔗糖30g/L和瓊脂粉6g/L ;其中，各成分的濃度均以誘導(dǎo)培養(yǎng)基總?cè)芤旱捏w積為基準(zhǔn)。進(jìn)一步地，所述繼代培養(yǎng)基包括下述成分:MS培養(yǎng)基、6-芐氨基腺嘌呤2.0mg/L、α -萘乙酸0.2mg/L、蔗糖30g/L和瓊脂粉6g/L ;其中，各成分的濃度均以誘導(dǎo)培養(yǎng)基總?cè)芤旱捏w積為基準(zhǔn)。本發(fā)明的有益效果在于:不僅能夠快速獲得大量茉莉花愈傷組織，且所獲得的茉莉花愈傷組織具有高誘導(dǎo)效率及高質(zhì)量的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)可長(zhǎng)期繼代保持茉莉花愈傷組織，即具有旺盛的生長(zhǎng)能力，從而為茉莉花生物技術(shù)和細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物等研究奠定了良好的基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式一種茉莉花愈傷組織誘導(dǎo)及繼代保持的方法，A.實(shí)驗(yàn)材料的選取與預(yù)處理從生長(zhǎng)健壯的茉莉花母株上剪取當(dāng)年生枝條或花器官，去除葉片后放入加有洗滌劑的水中浸洗3 5min，再用自來(lái)水沖洗I 2h ;然后移入超凈工作臺(tái)，將枝條置于適量的75%乙醇(v/v)中浸泡30s,再用0.1 % HgCl2 (w/v)消毒6 8min (花器官為6min),接著用無(wú)菌水沖洗3 4次。在無(wú)菌條件下切取長(zhǎng)0.5cm左右的莖段或花器官組織作為接種的外植體。B.啟動(dòng)培養(yǎng):取所獲得的茉莉花外植體，接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，并置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，7天后可見(jiàn)愈傷組織形成，30天左右長(zhǎng)成初代愈傷組織；其中，培養(yǎng)條件為溫度23 25°C，光照強(qiáng)度1500 20001x，每天光照12h ；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括下述成分:MS培養(yǎng)基、6-節(jié)氨基腺嘌呤2.0mg/L、α -萘乙酸
0.2mg/L、蔗糖30g/L和瓊脂粉6g/L ;其中，各成分的濃度均以誘導(dǎo)培養(yǎng)基總?cè)芤旱捏w積為基準(zhǔn)。所述MS培養(yǎng)基具體包括以下各成分:硝酸銨(NH4NO3) 1650mg/L、硝酸鉀(KNO3)1900mg/L、氯化鈣(CaCl2.2H20) 440mg/L、硫酸鎂(MgSO4.7H20) 370mg/L、磷酸二氫鉀(KH2PO4) 170mg/L、硫酸錳(MnSO4.H2O) 22.3mg/L、硫酸鋅(ZnSO4.7H20) 8.6mg/L、氯化鈷(CoCl2.6H20) 0.025mg/L、硫酸銅(CuSO4.5H20) 0.02mg/L、硼酸(H3BO3) 6.2、鑰酸鈉(Na2MoO4.2Η20) 0.25mg/L、碘化鉀(ΚΙ) 0.83mg/L、硫酸亞鐵(FeSO4.7H20) 28.7mg/L、乙二胺四乙酸二鈉(Na2-EDTA)37.3mg/L、煙酸 0.5mg/L、維生素 B60.5mg/L、維生素 B10.lmg/L、肌醇 100mg/L、甘氨酸 2mg/L。C.繼代增殖與保持:將初代愈傷組織轉(zhuǎn)接于繼代培養(yǎng)基中，并置于培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)，以獲得生長(zhǎng)一致且生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織；同時(shí)用所述繼代培養(yǎng)基長(zhǎng)期繼代保持愈傷組織；其中，培養(yǎng)條件為溫度23 25°C，光照強(qiáng)度1500 20001x，每天光照12h。所述繼代培養(yǎng)基包括下述成分:MS培養(yǎng)基、6-芐氨基腺嘌呤2.0mg/L、α -萘乙酸0.2mg/L、蔗糖30g/L和瓊脂粉6g/L ;其中，各成分的濃度均以誘導(dǎo)培養(yǎng)基總?cè)芤旱捏w積為基準(zhǔn)。一、茉莉花愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程的影響因素1、不同類(lèi)型外植體對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響將茉莉花莖段或花器官組織接種于下文所述J2培養(yǎng)基中后，置于光照下培養(yǎng)。接種7d后，莖段或花瓣切口處均可觀(guān)察到愈傷組織形成，以后愈傷組織塊會(huì)不斷膨大，30d左右后長(zhǎng)成初代愈傷組織。從產(chǎn)生愈傷組織的能力上看，莖段或花瓣的差別不大，但從愈傷組織的長(zhǎng)勢(shì)上，初代培養(yǎng)時(shí)，莖段產(chǎn)生的愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)較強(qiáng)；而花瓣產(chǎn)生的愈傷組織，長(zhǎng)勢(shì)比較弱，且要及時(shí)繼代，否則會(huì)褐變死亡。 2、培養(yǎng)條件對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的 影響將茉莉花莖段接種于6種培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)共形成6種類(lèi)型的愈傷組織:JC1、JC2、JC3、JC4、JC5、JC6。JCl是淡綠色或鮮綠色的粒狀松散狀愈傷組織；JC2是深綠色粒狀硬質(zhì)愈傷組織，從后期的繼代保持中，發(fā)現(xiàn)該類(lèi)型愈傷組織JC2生活力最強(qiáng)，增殖速度快；JC3是鮮綠色或深綠色粒狀松散狀愈傷組織；JC4是深綠色塊狀硬質(zhì)愈傷組織；JC5是淺黃綠色粒狀松軟狀愈傷組織，有玻璃化的趨勢(shì)，這種愈傷組織繼代后會(huì)褐變死亡JC6是JCl的一種衍生型愈傷組織，顏色較淡。在比較光照和黑暗對(duì)茉莉花愈傷組織誘導(dǎo)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，在光照條件下愈傷組織主要為上述六種，而在黑暗中誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生的愈傷組織，均為淺黃色或白色松散粒狀，定為JC7型愈傷組織。由此可見(jiàn)，在光照的條件下，茉莉花愈傷組織類(lèi)型較多，而在黑暗中僅產(chǎn)生JC7型愈傷組織。在光照條件下，JC1、JC2、JC3、JC4、JC6類(lèi)型的愈傷組織可以繼代增殖，為有效愈傷組織；而JC5類(lèi)型愈傷組織不能繼代保持，為無(wú)效愈傷組織。黑暗下，JC7愈傷組織也可以繼代增殖。3、不同培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響將茉莉花莖段接種于表I所列的6種培養(yǎng)基中，觀(guān)察其在光照條件下愈傷組織誘導(dǎo)的情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可以看出，6種培養(yǎng)基接種的莖段都能成功誘導(dǎo)出愈傷組織，其中J1、J2、J3和J5誘導(dǎo)率均為100%,J4和J6分別為77.78%和15.56%，經(jīng)鄧肯氏新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)表明，在愈傷組織誘導(dǎo)率上，前四種培養(yǎng)基(即Jl、J2、J3、J5)與后兩種培養(yǎng)基(即J4、J6)存在極顯著差異(P < 0.01)。另外，6種培養(yǎng)基中產(chǎn)生愈傷組織類(lèi)型的差異很大，JU J2和J5培養(yǎng)基中能分別形成上述JC1、JC2和JC5三種類(lèi)型愈傷組織；J3和J4培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)出上述JC2型，但均還產(chǎn)生了 JC3和JC4型愈傷組織；J6培養(yǎng)基則能誘導(dǎo)出上述JCl和JC6愈傷組織。從表2中可以看到，JU J2和J3培養(yǎng)基產(chǎn)生的有效愈傷組織誘導(dǎo)率最高，均為100%，經(jīng)鄧肯氏新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)表明，在有效愈傷組織誘導(dǎo)率上這三種培養(yǎng)基之間并沒(méi)有存在顯著性的差異，但這三種與J4、J5和J6培養(yǎng)基存在極顯著差異(P < 0.01)。從產(chǎn)生JC2類(lèi)型愈傷組織的比例看(見(jiàn)表2)，以J2培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出的JC2類(lèi)型愈傷組織占有率最高達(dá)100%, J2培養(yǎng)基與J3、J4培養(yǎng)基存在極顯著差異?？梢?jiàn)，在茉莉花愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)，附加2，4-D、KT、GA3的 培養(yǎng)基雖然可以成功誘導(dǎo)出愈傷組織，但并沒(méi)有J2培養(yǎng)基的效果理想。綜合表I和表2還可看出，不同濃度配比的BA、NAA都可以用來(lái)誘導(dǎo)茉莉花愈傷組織，但采用較高或較低濃度的NAA不利于JC2類(lèi)型愈傷組織的誘導(dǎo)。綜合有效愈傷組織誘導(dǎo)率和JC2類(lèi)型愈傷組織誘導(dǎo)率兩個(gè)因素，以附加2.0mg.L^1BA和0.2mg.T1NAA的MS培養(yǎng)基(即J2培養(yǎng)基)用于誘導(dǎo)茉莉花愈傷組織為佳。其中，表I中的Jl、J2、J3、J4、J5、J6培養(yǎng)基均指在MS培養(yǎng)基中附加了各成分及其含量的培養(yǎng)基。2，4-D為:2，4-二氯苯氧基乙酸；BA為:6-芐氨基腺嘌呤；NAA為:α -萘乙酸；KT為:6_糠氨基嘌呤；TDZ為:苯基噻二唑基脲；GA3為:赤霉素。表I各培養(yǎng)基中的附加成份及其含量(單位:mg/L)
權(quán)利要求
1.一種茉莉花愈傷組織誘導(dǎo)及繼代保持的方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)外植體處理:從生長(zhǎng)健壯的母株上剪取當(dāng)年生枝條或花器官，去除葉片后洗凈、消毒，在無(wú)菌條件下切取長(zhǎng)0.5cm的莖段或花器官組織作為接種的外植體； (2)誘 導(dǎo)培養(yǎng):將外植體接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，并于溫度23 25°C,光照強(qiáng)度1500 20001x，每天光照12h的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)30天，得初代愈傷組織； (3)繼代保持:將初代愈傷組織轉(zhuǎn)接于繼代培養(yǎng)基中，并于溫度23 25°C，光照強(qiáng)度1500 20001χ，每天光照12h的條件下進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，直至獲得生長(zhǎng)一致且生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織，同時(shí)用所述繼代培養(yǎng)基長(zhǎng)期保持愈傷組織。
2.如權(quán)利要求1所述的茉莉花愈傷組織誘導(dǎo)及繼代保持的方法，其特征在于:所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括下述成分:MS培養(yǎng)基、6-芐氨基腺嘌呤2.0mg/L、α -萘乙酸0.2mg/L、蔗糖30g/L和瓊脂粉6g/L ;其中，各成分的濃度均以誘導(dǎo)培養(yǎng)基總?cè)芤旱捏w積為基準(zhǔn)。
3.如權(quán)利要求1所述的茉莉花愈傷組織誘導(dǎo)及繼代保持的方法，其特征在于:所述繼代培養(yǎng)基包括下述成分=MS培養(yǎng)基、6-芐氨基腺嘌呤2.0mg/L、α -萘乙酸0.2mg/L、蔗糖30g/L和瓊脂粉6g/L ;其中，各成分的濃度均以誘導(dǎo)培養(yǎng)基總?cè)芤旱捏w積為基準(zhǔn)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種茉莉花愈傷組織誘導(dǎo)及繼代保持的方法，包括茉莉花外植體處理的步驟、誘導(dǎo)培養(yǎng)的步驟、繼代增殖培養(yǎng)與保持的步驟。本發(fā)明不僅能夠快速獲得大量茉莉花愈傷組織，且所獲得的茉莉花愈傷組織具有高誘導(dǎo)效率及高質(zhì)量的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)可長(zhǎng)期繼代保持茉莉花愈傷組織，即具有旺盛的生長(zhǎng)能力，從而為茉莉花生物技術(shù)和細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物等研究奠定了良好的基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)A01H4/00GK103238518SQ20131015760
公開(kāi)日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2013年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月28日
發(fā)明者賴(lài)呈純, 劉波, 朱育菁, 甘煌燦, 陳文輝 申請(qǐng)人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所