專利名稱：一種生防菌枯草芽孢桿菌sbz-106和可濕性粉劑及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種防治菌核病的生防菌枯草芽孢桿菌sbz-106，還涉及一種防治菌核病的生防菌枯草芽孢桿菌Sbz-106的制備方法，同時還涉及一種枯草芽孢桿菌可濕性粉劑，還涉及枯草芽孢桿菌的用途。
背景技術(shù)：
油菜是我國重要的油料作物及工業(yè)原料。油菜菌核病是由核盤菌[Sclerotiniasclerotioru m(Lib.) de Bary]引起的一種世界性病害,是我國油菜生產(chǎn)上的三大病害之一(陳利鋒，2001)，該病從油菜苗期到成熟期都可造成危害，嚴重影響著油菜的品質(zhì)和產(chǎn)量，成為影響我國油菜高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的關(guān)鍵因素。在一般年份，油菜菌核病的發(fā)病率為10% 30%，減產(chǎn)5% 7%。在發(fā)病重的年份，發(fā)病率高達80%，減產(chǎn)達30% 70%，含油量降低1% 5% (李國慶等，1995)。國內(nèi)外的研究證實利用枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)防治菌核病是替代化學(xué)防治以及彌補抗病資源匱乏的重要措施，生物防治可以有效的避免使用化學(xué)農(nóng)藥帶來的一系列環(huán)境和能源 方面的問題，更有利于促進農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展(于淑池，2004)。研究表明:枯草芽孢桿菌不僅對油菜菌核病有理想的防治效果，對多種植物病害均有防治效果。配制枯草芽孢桿菌可濕性粉劑可適用于田間土壤使用和噴霧使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種枯草芽孢桿菌菌株，該菌株對核盤菌有強防治效果，可用于制備枯草芽孢桿菌的微生物制劑，該菌株已于2013年4月8日送交中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，分類命名:枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) sbzl06, CCTCC NO:M2013127，地址:中國武漢武漢大學(xué)。本發(fā)明還有一個目的是在于提供了一種枯草芽孢桿菌可濕性粉劑，該粉劑對作物菌核病高效，對人畜無毒；成本低；適合多種菌核病的防治。本發(fā)明的制劑生產(chǎn)中沒有用到有機溶劑，降低了生產(chǎn)過程中和產(chǎn)品中的污染，也不會產(chǎn)生溶劑中毒，生產(chǎn)及使用均十分簡單，具有生物農(nóng)藥對人畜安全的優(yōu)點。本發(fā)明的最后一個目的是在于提供了一種枯草芽孢桿菌在制備治療或預(yù)防核盤菌制劑藥物中的應(yīng)用。為了達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施:—種枯草芽孢桿菌菌株，其篩選及鑒定過程為:1.枯草芽孢桿菌sbz-106菌株的分離篩選:枯草芽孢桿菌sbz-106分離與鑒定:申請人于2008年3月至5月從中國湖北省隨洲采集健康的油菜植株上分離、篩選得到一株對核盤菌具有強防治效果的枯草芽孢桿菌菌株，申請人將其命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)sbz-106o本發(fā)明的枯草芽孢桿菌sbz-106分離和篩選采用稀釋平板方法和平板拮抗的方法，菌種鑒定工作參照植物病理研究方法(方中達，1998)，微生物學(xué)實驗(趙斌和何紹江，2006)等書中的實驗方法。
2.枯草芽孢桿菌sbz-106菌學(xué)特征:(I)枯草芽孢桿菌sbz-106的形態(tài)學(xué):枯草芽孢桿菌sbz-106在LB培養(yǎng)基(配方:胰蛋白胨IOg,酵母提取物5g,氯化鈉10g，補充蒸餾水至1000ml，調(diào)pH至7.0，在121 °C高壓蒸汽滅菌30min)上菌落接近圓形，中間部分有小顆粒狀隆起，不透明，菌落乳白色。菌體直桿狀，大小為(0.7-0.8)μ mX (2-2.5)μ m，革蘭氏染色反應(yīng)紫色，為陽性；產(chǎn)生芽孢，芽孢呈橢圓形近中生，但不產(chǎn)生莢膜，周生鞭毛。(2)枯草芽孢桿菌sbz-106菌株的遺傳學(xué)特性:將sbz-106菌株于28°C 180r/min培養(yǎng)24h，取1μ I作為模板，對16S rDNA片段進行PCR擴增。引物設(shè)計和擴增條件參照細菌16S rDNA的通用引物和標準方法(見=Weisburg et al.，1991),所述的引物DNA序列如下:正向引物:5'AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG3/反向引物:5'ACG GTT ACC TTG TTA CGA CTT3/序列分析表明16S rDNA擴增片段長度為1513bp，其序列如序列表SEQ ID NO:1所不。在 NCBI 網(wǎng)站(http://www.ncb1.nlm.nih.gov)進行 BLAST 分析，可知其與 Bacillussubtilis菌株的相應(yīng)序列的同源性為99%。(3)枯草芽孢桿菌sbz-106菌株生理生化特性:sbz-106菌株適宜的生長溫度為25_37°C，適宜的生長環(huán)境pH值為7.0。能利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、山梨 醇、淀粉、甘露醇、乳糖、D—果糖和肌糖等碳源；能利用酵母粉、NH4NO3、鑰酸銨、NH4C1、硫酸銨、碳酸銨、牛肉浸膏和酵母浸膏等氮源；革蘭氏染色為陽性，運動性測定為陽性，過氧化氫酶測定為陽性，苯丙氨酸解氨酶為陰性，淀粉水解反應(yīng)為陽性，吲哚產(chǎn)生為陰性，甲基紅(MR)測定為陰性，乙酰甲基甲醇(VP)反應(yīng)為陽性，接觸酶反應(yīng)為陰性，氧化酶測定為陽性，明膠液化為陽性，硝酸鹽還原反應(yīng)為陽性，纖維素分解測定為陰性，檸檬酸鹽的利用為陽性，丙二酸鹽反應(yīng)為陽性，NaCl濃度超過10%時不能生長，葡萄糖氧化發(fā)酵測定為陽性，產(chǎn)H2S試驗(產(chǎn)氣)為陰性。一種枯草芽孢桿菌可濕性粉劑，每IOOOmg粉劑含有:枯草芽抱桿菌sbz-106 I X 109cfu黃原膠2_16mg羧甲基纖維素鈉8_64mg碳酸鈣10_20mg抗壞血酸10_20mg娃藻土補充至lOOOmg。所述的黃原膠、羧甲基纖維素鈉、碳酸鈣、抗壞血酸和硅藻土為市售的商品化的產(chǎn)品O一種枯草芽孢桿菌可濕性粉劑，每IOOOmg粉劑含有(優(yōu)選范圍):枯草芽抱桿菌sbz-106 I X 109cfu ；黃原膠2-10mg ； 羧甲基纖維素鈉8_30mg ；碳酸鈣 15_20mg ；
抗壞血酸10_15mg ；娃藻土補充至lOOOmg。一種枯草芽孢桿菌可濕性粉劑，每IOOOmg粉劑含有(更優(yōu)范圍):枯草芽抱桿菌sbz-106 I X 109cfu ；黃原膠2_5mg ；羧甲基纖維素鈉8_15mg ;碳酸鈣15_20mg ；抗壞血酸10_12mg ；娃藻土補充至lOOOmg。一種枯草芽孢桿菌可濕性粉劑，每IOOOmg粉劑含有(最佳值):枯草芽抱桿菌sbz-106 I X 109cfu ；黃原膠2mg ；羧甲基纖維素鈉8mg;碳酸鈣20mg ；抗壞血酸IOmg ；硅藻土補充至lOOOmg。一種枯草芽孢桿菌可濕性粉劑的制備方法，其步驟是:將菌濃度為108/ml枯草芽孢桿菌sbz-106發(fā)酵菌液IOml離心去上清液，枯草芽孢桿菌菌體低溫冷凍干燥后按比例依次加入黃原膠2-16mg、羧甲基纖維素鈉8-15mg和碳酸隹丐10-12mg充分攪拌混合均勻，然后依次加入抗壞血酸10-12mg和娃藻土補充至IOOOmg,邊加入邊攪拌均勻，于粉碎機中充分粉碎，使枯草芽孢桿菌sbz-106可濕性粉劑的粒徑為44 74 μ m即得。一種枯草芽孢桿菌在制備治療或預(yù)防核盤菌制劑藥物中的應(yīng)用，其步驟是:將枯草芽孢桿菌按照4.8 X 108cfu/m2試驗田(或2.4 X 108cfu/m2試驗田或1.2父108(^11/1112試驗田)噴在油菜株冠(花、枝條)上。在油菜葉片和莖干上人工接種核盤菌后每隔一周測一次菌核病發(fā)病情況及其病級。實驗結(jié)果證實，經(jīng)枯草芽孢桿菌sbz-106處理的油菜植株發(fā)病指數(shù)都比對照的低，本發(fā)明制備的枯草芽孢桿菌sbz-106可濕性粉劑的防效與速克靈沒有顯著差異，各個處理油菜產(chǎn)量與對照相比均有顯著增加。田間實驗結(jié)果表明本發(fā)明制備的枯草芽孢桿菌sbz-106可濕性粉劑對油菜菌核病具有較好的防治作用，該制劑具有良好的生防價值，可以對其進行進一步地開發(fā)與應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點:1.本發(fā)明篩選出的枯草芽孢桿菌sbz-106對核盤菌的平板拮抗實驗平均抑菌寬度達2.7cm，平均抑菌率為80%以上，為一株強拮抗活性的菌株。2.本發(fā)明對作物菌核病高效，對人畜無毒；成本低；適合多種菌核病的防治。3.本發(fā)明利用枯草芽孢桿菌sbz-106所制得的制劑生產(chǎn)中沒有用到有機溶劑，降低了生產(chǎn)過程中和產(chǎn)品中的污染，也不會產(chǎn)生溶劑中毒，生產(chǎn)及使用均十分簡單，具有生物農(nóng)藥對人畜安全的優(yōu)點。


圖1為一種枯草芽孢桿菌sbz-106與核盤菌對峙培養(yǎng)后的菌絲形態(tài)示意圖。左:對照組右:對峙培養(yǎng)后的菌絲。圖2為一種枯草芽孢桿菌sbz-106與核盤菌平板對峙實驗示意圖。左:對峙培養(yǎng)菌落形態(tài)；右:對照組。圖3為一種枯草芽孢桿菌sbz-106離體油菜葉片下對核盤菌菌絲侵染的抑制作用示意圖。圖4為一種枯草芽孢桿菌SZ-106可濕性粉劑。圖5A為一種枯草芽孢桿菌SZ-106揮發(fā)性物質(zhì)對核盤菌菌絲生長的抑制作用。左:對照；右:sbz-106處理。圖5B為一種枯草芽孢桿菌SZ-106揮發(fā)性物質(zhì)對核盤菌菌核萌發(fā)的抑制作用。左:對照；右:sbz-106處理。
具體實施例方式實施例1:
枯草芽孢桿菌sbz-106的分離與鑒定:枯草芽孢桿菌sbz-106分離與鑒定:申請人于2008年3月至5月從中國湖北省隨洲采集健康的油菜植株上分離、篩選得到一株對核盤菌具有強防治效果的枯草芽孢桿菌菌株，申請人將其命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) sbz-106。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌sbz-106分離和篩選采用稀釋平板方法和平板拮抗的方法，菌種鑒定工作參照植物病理研究方法(方中達，1998)，微生物學(xué)實驗(趙斌和何紹江，2006)等書中的實驗方法。將sbz-106菌株于28 V 180r/min培養(yǎng)24h，取I μ I作為模板，對16S rDNA片段進行PCR擴增。引物設(shè)計和擴增條件參照細菌16S rDNA的通用引物和標準方法(見:Weisburg etal.，1991)，所述的引物DNA序列如下:正向引物:5'AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG3/反向引物:5'ACG GTT ACC TTG TTA CGA CTT3/序列分析表明16S rDNA擴增片段長度為1513bp，其序列如序列表SEQ ID NO:1所不。在 NCBI 網(wǎng)站(http://www.ncb1.nlm.nih.gov)進行 BLAST 分析，可知其與 Bacillussubtilis菌株的相應(yīng)序列的同源性為99%。該菌株已于2013年4月8日送交中國典型培養(yǎng)物保藏中心(英文簡稱CCTCC)，分類命名:枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) sbzl06,CCTCC NO:M2013127，地址:中國武漢武漢大學(xué)。實施例2:枯草芽孢桿菌sbz-106與核盤菌平板拮抗實驗和離體葉片測定:( I)枯草芽孢桿菌sbz-106與核盤菌平板拮抗實驗:將枯草芽孢桿菌sbz-106菌株在PDA平板中央劃線，用內(nèi)徑為5mm的打孔器打取活化好的核盤菌接在待測菌株的兩側(cè)，間距為4cm，以PDA平板中央劃線無菌水兩邊接核盤菌作為對照，重復(fù)3次。待核盤菌長滿整個平板后觀察其拮抗作用的大小，顯微鏡下觀察其菌絲形態(tài)。試驗結(jié)果為圖1和圖2，枯草芽孢桿菌sbz-106對核盤菌有明顯的抑制作用，核盤菌的菌絲發(fā)生潰解(圖1)。
(2)離體葉片測定:將枯草芽孢桿菌sbz-106接種于已滅好菌的LB中(每瓶IOOml )，搖菌48h，直至菌濃度為108/ml，真菌接直徑為5mm的菌塊。將田間采集的新鮮油菜葉片在流動的自來水中沖洗干凈，自然涼干后將其浸入發(fā)酵液(加一滴土溫)約5 10s，以噴無菌水作為對照，每個處理設(shè)10次重復(fù)。處理24h后，在每個葉片的相同位置處接培養(yǎng)2 3d后的核盤菌尖端菌絲塊，菌塊大小為5mm。瓷盤內(nèi)保持一定的濕度，蓋上膠紙膜后置于20°C恒溫光照培養(yǎng)箱中，每24h觀察發(fā)病情況，并測量其病斑大小。實驗結(jié)果如圖3所示，離體葉片條件下抑制作用同樣表現(xiàn)出較強的拮抗活性。平板拮抗實驗平均抑菌寬度達2.7cm,平均抑菌率為80%以上，為一株強拮抗活性的菌株。(3)枯草芽孢桿菌sbzl06揮發(fā)性物質(zhì)對核盤菌菌絲生長和菌核萌發(fā)的抑制活性測定①揮發(fā)性物質(zhì)對核盤菌菌絲生長的抑制作用(雙皿對扣法):在培養(yǎng)皿底傾倒LB培養(yǎng)基，凝固后涂布100 μ L濃度為I X IO8的sbz-106菌懸液。頂蓋傾倒PDA培養(yǎng)基，凝固后在培養(yǎng)皿中央接種核盤菌菌絲塊(Φ=9πιπι)。用封口膜密封。對照不接種菌株sbz-106。先將培養(yǎng)皿于28°C培養(yǎng)24h使細菌迅速長滿全皿，然后再將培養(yǎng)皿置于22°C培養(yǎng)，連續(xù)觀察并計算抑菌率。試驗設(shè)置10次重復(fù)。抑制率(％)=(對照菌落直徑一處理的菌落直徑)/對照菌落直徑X 100%②揮發(fā)性物質(zhì)對核盤菌菌核萌發(fā)的抑菌作用(雙皿對扣法):選取大小一致的菌核(平均直徑為500 600mm),表面殺菌、洗凈、晾干備用。在培養(yǎng)皿底傾倒LB培養(yǎng)基，凝 固后涂布100 μ L濃度為I X 108的枯草芽孢桿菌sbz-106菌懸液。頂蓋傾倒PDA培養(yǎng)基，冷卻后將菌核放在PDA平板上，每個平板上放3個菌核，用封口膜封好。對照不接種sbz-106。先將培養(yǎng)皿于28°C培養(yǎng)24h使細菌迅速長滿全皿，然后再將培養(yǎng)皿置于22°C培養(yǎng)，連續(xù)觀察并計算抑制率。試驗設(shè)置10次重復(fù)。抑制率(％)=(對照菌核的萌發(fā)個數(shù)一處理的菌核萌發(fā)個數(shù))/對照菌核萌發(fā)個數(shù) X 100%結(jié)果測定:未經(jīng)枯草芽孢桿菌sbz-106處理的對照核盤菌菌絲長滿全皿時,計算其對核盤菌的抑制率為84%，此后經(jīng)K-106處理的核盤菌菌絲未生長，抑制率為100%。(圖5A)。72h后,未經(jīng)枯草芽孢桿菌sbz-106處理的對照核盤菌菌核全部萌發(fā),而經(jīng)sbz-106處理的菌核全部未萌發(fā)，由此推斷sbz-106的揮發(fā)性物質(zhì)可以完全抑制核盤菌菌核的萌發(fā)(圖 5B)。實施例3 9:一種枯草芽孢桿菌sbz-106可濕性粉劑,每IOOOmg粉劑含有:
權(quán)利要求
1.一種枯草芽孢桿菌，其特征在于:枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)sbzl06,CCTCCNO:M2013127o
2.一種枯草芽孢桿菌可濕性粉劑，每IOOOmg粉劑含有: 枯草芽抱桿菌sbz-106 I X 109cfu ； 黃原膠2-16mg ； 羧甲基纖維素鈉8-64mg ； 碳酸I丐10-20mg ； 抗壞血酸10_20mg ； 娃藻土補充至lOOOmg。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種枯草芽孢桿菌可濕性粉劑，每IOOOmg粉劑含有: 枯草芽抱桿菌sbz-106 I X 109cfu ； 黃原膠2-10mg ； 羧甲基纖維素鈉8-30mg ； 碳酸韓15-20mg ； 抗壞血酸10_15mg ； 娃藻土補充至lOOOmg。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種枯草芽孢桿菌可濕性粉劑，每IOOOmg粉劑含有: 枯草芽抱桿菌sbz-106 I X 109cfu ； 黃原膠2-5mg ； 羧甲基纖維素鈉8-15mg ； 碳酸韓15-20mg ； 抗壞血酸10-12mg ； 娃藻土補充至lOOOmg。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種枯草芽孢桿菌可濕性粉劑，每IOOOmg粉劑含有: 枯草芽抱桿菌sbz-106 I X 109cfu ； 黃原膠2mg ； 羧甲基纖維素鈉8mg ； 碳酸韓20mg ； 抗壞血酸IOmg ； 娃藻土補充至lOOOmg。
6.權(quán)利要求1所述的一種枯草芽孢桿菌在制備治療或預(yù)防核盤菌制劑藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生防菌枯草芽孢桿菌sbz-106及其可濕性粉劑及應(yīng)用。本發(fā)明公開的枯草芽孢桿菌sbz-106對核盤菌具有強防治效果，已保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，CCTCCNOM2013127。同時制備了一種枯草芽孢桿菌sbz-106可濕性粉劑，該粉劑中枯草芽孢桿菌芽孢含量為1×109cfu/g，由黃原膠、羧甲基纖維素鈉配方、碳酸鈣、抗壞血酸、用硅藻土組成。本發(fā)明產(chǎn)品對作物菌核病高效，對人畜無毒；成本低；適合多種菌核病的防治。本發(fā)明的制劑生產(chǎn)中沒有用到有機溶劑，降低了生產(chǎn)過程中和產(chǎn)品中的污染，也不會產(chǎn)生溶劑中毒，生產(chǎn)及使用均十分簡單，具有生物農(nóng)藥對人畜安全的優(yōu)點。
文檔編號A01P3/00GK103224902SQ201310167139
公開日2013年7月31日 申請日期2013年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月8日
發(fā)明者肖炎農(nóng), 甄熙, 謝沖, 莫陳汨, 黃麗娜, 王珍 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)