專利名稱：一種板栗菌根菌人工培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于菌根菌人工培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種板栗菌根菌人工培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
菌根是土壤微生物和植物相容性最普遍的共生現(xiàn)象，外生菌根的形成使樹木依靠菌根菌的幫助提高對土壤中水分和養(yǎng)分的吸收能力。外生菌根菌分泌的有機(jī)態(tài)磷分解酶能將枯枝落葉和土壤有機(jī)質(zhì)中的有機(jī)態(tài)磷分解吸收直接傳輸給樹木利用，從而起到抗旱、促生、防病的效果。外生菌根真菌侵染宿主植物根系后，一方面形成哈蒂氏網(wǎng)和菌套，另一方面菌絲向外延伸形成致密的菌絲網(wǎng)，甚至形成菌索。由于多數(shù)外生菌根真菌對寄主不具有嚴(yán)格的專一性，外延菌絲伸展過程中接觸到其它可與其共生的寄主植物的根系后也可再度侵染，形成根間的菌絲橋。菌絲橋的建立使不同植株之間形成了源庫關(guān)系，使植物間可傳遞
C、N、P和水分等物質(zhì)，從而使受體植物的營養(yǎng)狀況得到改善。板栗根系與外生菌根菌也存在一種共生關(guān)系。在板栗園林下，可以看到不同形狀和顏色的板栗菌根菌的子實(shí)體。調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，能與板栗形成外生菌根的真菌有13屬29種，分布的優(yōu)勢真菌有馬勃屬(Lycoperdon)、須腹菌屬(Rhizopogon)、秀馬勃屬(Calvatia)、紅燕屬(Russula)、牛肝菌屬(Boletus)、我鳥膏屬(Amanita)、松塔牛肝菌屬(Strobilomyces)等。其中，馬勃類和須腹菌與板栗共生關(guān)系最好，其次為紅菇屬及牛肝菌屬。外生菌根真菌對板栗的正常生長具有極其重要的作用，能提高板栗根系對土壤中水分和養(yǎng)分的吸收能力。如果土壤中缺少菌根菌，板栗就不能正常生長發(fā)育。板栗多生長在山區(qū)，在土壤肥力貧瘠的板栗園，土壤養(yǎng)分含量很低，施肥困難，因此，山區(qū)的板栗常因著生位置、株齡不同表現(xiàn)出植株?duì)I養(yǎng)狀況和生長勢很大差別。在板栗常規(guī)嫁接育苗中，由于苗床或培養(yǎng)基中缺乏能與板栗根系共生的菌根菌，所以，移栽到大田的常規(guī)嫁接苗，成活率低，生長發(fā)育遲緩，而且到2 3年后還會(huì)出現(xiàn)大樹死亡的現(xiàn)象。然而，板栗根系與外生菌根菌的共生關(guān)系十分復(fù)雜，許多菌根真菌的分離培養(yǎng)比較困難。板栗菌根化研究已有成功報(bào)道，但接種的菌劑均采用的是外來菌種，接種效果很不理想。雖然秦嶺等人也成功從板栗產(chǎn)區(qū)土壤中采集多種真菌子實(shí)體，但并未分離出能成功回接的菌種。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種板栗菌根菌人工培養(yǎng)方法，培養(yǎng)得到與板栗根系有良好共生關(guān)系的板栗菌根菌。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):一種板栗菌根菌人工培養(yǎng)方法，包括以下步驟:I)組織分離

取板栗菌根菌子實(shí)體，縱切為兩半，采集菌蓋與菌柄交匯處的菌肉組織塊；
2)菌絲培養(yǎng)與提純將采集的菌肉組織塊置于斜面培養(yǎng)基中，在25 28°C下培養(yǎng)至菌肉組織塊萌發(fā)出菌絲后，將菌絲轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基中，在25 28°C下培養(yǎng)至菌絲長滿斜面，獲得純菌絲；所述的斜面培養(yǎng)基的制作為:首先，用沸水煮馬鈴薯后過濾，回收濾液得到馬鈴薯汁液；其次，將板栗枯枝落葉水煮液、根際土壤水提液和水加入馬鈴薯汁液中后，加入瓊脂，邊加熱邊攪拌至瓊脂完全融化后，再加入葡萄糖，充分混勻后冷卻；最后，調(diào)節(jié)PH值為5 6 ；其中，馬鈴薯、葡萄糖和瓊脂的質(zhì)量比為(10 20): (I 2): (I 1.5)，板栗枯枝落葉水煮液、根際土壤水提液和水的體積比為(2 5):(1 2):(2 5);3)菌種擴(kuò)大培養(yǎng)將純菌絲接種到擴(kuò)大培養(yǎng)料中，在25 28°C下培養(yǎng)至菌絲長滿培養(yǎng)容器，獲得板栗菌根菌。所述的用沸水煮馬鈴薯的時(shí)間為30 50min ;采用lmol/L NaOH或lmol/L HCL調(diào)節(jié)pH值為5 6。所述板栗枯枝落葉水煮液為:用沸水煮板栗枯枝落葉30 50min，靜置后過濾得到的濾液。所述根際土壤水提液為:用沸水煮板栗根際土壤30 50min，靜置后過濾得到的濾液。所述的擴(kuò) 大培養(yǎng)料由基質(zhì)和營養(yǎng)液按質(zhì)量比10:2 3配成。所述的基質(zhì)由板栗修剪枝條或栗苞的粉碎物與玉米粉按體積比(80 85):(20 15)混勻配成。所述的營養(yǎng)液由水、白糖、KH2PO4' NH4Cl' CaSO4.2H20、FeCl3按質(zhì)量比80:10:3:5:1:1配制而成，調(diào)節(jié)pH值為5 6。所述的擴(kuò)大培養(yǎng)料的含水質(zhì)量為60 65%。所述的板栗菌根菌子實(shí)體在組織分離前還包括預(yù)處理操作，是將采集的新鮮、壯實(shí)、中等成熟的野生板栗菌根菌子實(shí)體，先經(jīng)無菌保鮮劑洗滌，再經(jīng)75%的酒精浸泡消毒，最后經(jīng)無菌水清洗。所述的無菌保鮮劑為:質(zhì)量濃度為0.02 0.06%的抗壞血酸液和質(zhì)量濃度為
0.01 0.03%的檸檬酸液按體積比(I 5): (I 3)配成的混合液。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果:本發(fā)明的板栗菌根菌人工培養(yǎng)方法，利用菌根菌營養(yǎng)專一性的屬性，選用板栗枯枝落葉、根際土壤等獲取營養(yǎng)液，經(jīng)過組織分離、純化、培養(yǎng)、繁殖，獲得能與板栗形成最佳共生關(guān)系的菌根菌種。本發(fā)明操作簡單，通過回接試驗(yàn)，利用本發(fā)明培養(yǎng)得到的菌種回接板栗幼苗，證明效果非常好，菌根浸染率最高可達(dá)50.3%，平均浸染率為46.5%。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體的實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。實(shí)施例1
一種板栗菌根人工培養(yǎng)方法，包括以下步驟:I)野生菌根菌子實(shí)體的采集在10齡以上的板栗園林下，采集新鮮、壯實(shí)、中等成熟的野生菌根菌子實(shí)體，除去表面雜物后，在預(yù)先制備好的無菌保鮮劑中浸泡I 2分鐘，撈出浙干，裝入無菌保鮮袋內(nèi)，密封，在48小時(shí)內(nèi)帶回后在75%酒精中浸泡5秒消毒，之后再用無菌水清洗兩遍。其中，所述的無菌保鮮劑是由質(zhì)量濃度0.04%抗壞血酸液和質(zhì)量濃度0.02%檸檬酸液按體積比1:1配成的混合液。2)組織分離在無菌條件下，將清洗、消毒后的子實(shí)體縱剖為兩半，用解剖刀切取菌蓋與菌柄交匯處，得到菌肉組織塊(綠豆大小);3)制作斜面培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基的配方為:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15g，板栗枯枝落葉煮提液400ml,根際土壤煮提液200ml,自來水400ml, pH值為5 ；斜面培養(yǎng)基的制作步驟為:①取板栗枯枝落葉200g，加水1000ml，煮沸40min，用四層紗布過濾，得板栗枯枝落葉水煮液，備用；②取板栗根際土壤100g，加水500ml，煮沸30min，用四層紗布過濾，得根際土壤水提液，備用；
`
③將馬鈴薯去皮和芽眼、切塊或切片，稱取200g，加水1000ml，煮沸30min，至馬鈴
薯能被玻璃棒戳破為宜，用三層紗布過濾，得馬鈴薯汁液，備用；④量取上述板栗枯枝落葉煮提液400ml，根際土壤煮提液200ml，自來水400ml，加入到馬鈴薯汁液中，再加入瓊脂15g，繼續(xù)加熱，邊加熱邊攪拌，至瓊脂完全溶化，再加葡萄糖20g，稍冷，再用水補(bǔ)足至IOOOml ;用lmol/L NaOH或lmol/L HCL溶液調(diào)節(jié)pH值為5 ;⑤將上述配制好的培養(yǎng)基趁熱分裝于試管，裝入量約為試管長度的1/4 ;然后塞上棉塞，包扎，放入滅菌鍋，上蓋2層報(bào)紙，在121°C或0.103MPa下滅菌30分鐘，待壓力降為零時(shí)取出試管，擺成斜面，冷卻，備用；⑥將斜面培養(yǎng)基試管置于28°C的恒溫箱中培養(yǎng)3天，如斜面仍光滑，無雜菌出現(xiàn)，就可作為合格斜面培養(yǎng)基使用。上述組織分離制作的斜面培養(yǎng)基試管應(yīng)盡量多，不少于50支，然后在28°C中培養(yǎng)。從第4天起，每隔3天檢查I次，及時(shí)刷除污染管，將未污染管繼續(xù)培養(yǎng)。4)菌絲培養(yǎng)與提純將菌肉組織塊置于斜面培養(yǎng)基中，在25°C下培養(yǎng)至菌肉組織塊萌發(fā)菌絲后，在無菌條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)管(新的斜面培養(yǎng)基中)后，移入培養(yǎng)箱，溫度控制在28°C，待菌絲長滿斜面后，即獲得純菌絲(一級菌種)，并在純菌絲試管外貼上菌種名稱、菌株號、接種日期的標(biāo)簽，以便于保存和擴(kuò)大繁殖。5)菌種擴(kuò)大培養(yǎng)將純菌絲接種到擴(kuò)大培養(yǎng)料的接種孔中，稍壓實(shí)，使菌種與培養(yǎng)料相接觸，將待培養(yǎng)的菌種瓶移入培養(yǎng)箱或光線暗淡的培養(yǎng)室，在25°C下培養(yǎng)至菌絲長滿培養(yǎng)瓶，獲得擴(kuò)大種(二級菌種)，即板栗菌根菌。
其中，所述擴(kuò)大培養(yǎng)料由基質(zhì)和營養(yǎng)液按質(zhì)量比10:2配成，基質(zhì)由板栗修剪枝條或栗苞的粉碎物與玉米粉按體積比85:15混勻配成，營養(yǎng)液由水、白糖、KH2PO4, NH4Cl,CaSO4.2H20、FeCl3按質(zhì)量比80:10:3:5:1:1配制而成，調(diào)節(jié)pH值為5 6。所述擴(kuò)大培養(yǎng)料的制備步驟為:①將板栗修剪枝條或栗苞粉碎物與玉米粉按體積比85:15混合均勻，再將營養(yǎng)液拌入基質(zhì)，基質(zhì)與營養(yǎng)液的質(zhì)量比為10:2 ;②基質(zhì)與營養(yǎng)液充分混勻后，在用適量水調(diào)節(jié)培養(yǎng)料水分在60 65%之間(以用手握料，指縫間有水滲出為宜)，拌均勻后，即可立即分裝菌種瓶；(菌種瓶可選用75ml的廣口瓶，邊裝邊壓實(shí)，菌種瓶裝好后上邊壓平實(shí)，在培養(yǎng)料中間打一接種孔。)③用清水將瓶口內(nèi)外清洗干凈，用一層塑料布二層報(bào)紙?jiān)诨蛑苯佑妹藁ㄈ冢饪诤罅⒓囱b鍋，在121°C滅菌，備用。通過以上步驟I) 4)就可以獲得二級擴(kuò)大菌種，根據(jù)生產(chǎn)需要，還可以繼續(xù)擴(kuò)大獲得三級菌種。利用二級菌種或三級菌種都可以生產(chǎn)不同類型的菌根制劑或板栗根菌專用肥。對本發(fā)明培養(yǎng)得到的板栗菌根菌進(jìn)行回接效果試驗(yàn)，具體試驗(yàn)內(nèi)容及測試結(jié)果如下:·
I)試驗(yàn)方法采用隨機(jī)·區(qū)·組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在板栗容器苗剛長出一對真葉時(shí)，利用固體菌劑直接接種，以不接菌為對照。固體菌劑接種量為IOg/株，分3個(gè)組，重復(fù)3次，每個(gè)組重復(fù)接種30株。接種I個(gè)月后，采用番紅-淡綠染色法調(diào)查菌根侵染率。經(jīng)染色后，根細(xì)胞核染成鮮紅或紫紅色，菌絲綠色或藍(lán)綠色，利用此可以分辨根浸染與否，計(jì)算侵染率。計(jì)算公式:菌根侵染率(%)=侵染根數(shù)/全部根數(shù)X 100%。待苗木根系菌根化后3個(gè)月，測定苗木的苗高、地徑、高徑比等生長指標(biāo)。2)試驗(yàn)結(jié)果①菌根侵染率，如表I所示:表I回接菌根菌劑后板栗苗菌根浸染率
權(quán)利要求
1.一種板栗菌根菌人工培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟 1)組織分離 取板栗菌根菌子實(shí)體，縱切為兩半，采集菌蓋與菌柄交匯處的菌肉組織塊； 2)菌絲培養(yǎng)與提純 將采集的菌肉組織塊置于斜面培養(yǎng)基中，在25 28°C下培養(yǎng)至菌肉組織塊萌發(fā)出菌絲后，將菌絲轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基中，在25 28°C下培養(yǎng)至菌絲長滿斜面，獲得純菌絲； 所述的斜面培養(yǎng)基的制作為首先，用沸水煮馬鈴薯后過濾，回收濾液得到馬鈴薯汁液；其次，將板栗枯枝落葉水煮液、根際土壤水提液和水加入馬鈴薯汁液中后，加入瓊脂，邊加熱邊攪拌至瓊脂完全融化后，再加入葡萄糖，充分混勻后冷卻；最后，調(diào)節(jié)PH值為5 6 ; 其中，馬鈴薯、葡萄糖和瓊脂的質(zhì)量比為(10 20) : (I 2) : (I I. 5)，板栗枯枝落葉水煮液、根際土壤水提液和水的體積比為(2 5):(1 2):(2 5); 3)菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 將純菌絲接種到擴(kuò)大培養(yǎng)料中，在25 28°C下培養(yǎng)至菌絲長滿培養(yǎng)容器，獲得板栗菌根菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種板栗菌根菌人工培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的用沸水煮馬鈴薯的時(shí)間為30 50min ;采用lmol/L NaOH或lmol/L HCL調(diào)節(jié)pH值為5 6。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種板栗菌根菌人工培養(yǎng)方法，其特征在于，所述板栗枯枝落葉水煮液為用沸水煮板栗枯枝落葉30 50min，靜置后過濾得到的濾液。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種板栗菌根菌人工培養(yǎng)方法，其特征在于，所述根際土壤水提液為用沸水煮板栗根際土壤30 50min，靜置后過濾得到的濾液。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種板栗菌根人工培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的擴(kuò)大培養(yǎng)料由基質(zhì)和營養(yǎng)液按質(zhì)量比10:2 3配成。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種板栗菌根菌人工培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的基質(zhì)由板栗修剪枝條或栗苞的粉碎物與玉米粉按體積比(80 85) : (20 15)混勻配成。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種板栗菌根菌人工培養(yǎng)方法,其特征在于,所述的營養(yǎng)液由水、白糖、KH2PO4' NH4Cl' CaSO4 · 2H20、FeCl3 按質(zhì)量比 80:10:3:5:1:1 配制而成，調(diào)節(jié) pH值為5 6。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種板栗菌根菌人工培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的擴(kuò)大培養(yǎng)料的含水質(zhì)量為60 65%。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種板栗菌根菌人工培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的板栗菌根菌子實(shí)體在組織分離前還包括預(yù)處理操作，是將采集的新鮮、壯實(shí)、中等成熟的野生板栗菌根菌子實(shí)體，先經(jīng)無菌保鮮劑洗滌，再經(jīng)75%的酒精浸泡消毒，最后經(jīng)無菌水清洗。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種板栗菌根菌人工培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的無菌保鮮劑為質(zhì)量濃度為O. 02 O. 06%的抗壞血酸液和質(zhì)量濃度為O. 01 O. 03%的檸檬酸液按體積比(I 5) : (I 3)配成的混合液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種板栗菌根菌人工培養(yǎng)方法，屬于菌根菌人工培養(yǎng)領(lǐng)域。包括以下步驟1)取板栗菌根菌子實(shí)體，縱切為兩半，采集菌蓋與菌柄的交匯處，得到菌肉組織塊；2)將菌肉組織塊置于斜面培養(yǎng)基中，在25～28℃下培養(yǎng)至菌肉組織塊萌發(fā)出菌絲后，將菌絲轉(zhuǎn)管后，在25～28℃下培養(yǎng)至菌絲長滿斜面，獲得純菌絲；3)將純菌絲接種到擴(kuò)大培養(yǎng)料的接種孔中，在25～28℃下培養(yǎng)至菌絲長滿培養(yǎng)容器，獲得板栗菌根菌。本發(fā)明板栗菌根菌的人工培養(yǎng)方法，操作簡單，利用本發(fā)明培養(yǎng)得到的菌種回接板栗幼苗，菌根浸染率最高可達(dá)50.3%，平均浸染率為46.5%。
文檔編號A01G1/04GK103250564SQ201310172589
公開日2013年8月21日 申請日期2013年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月10日
發(fā)明者季志平, 呂平會(huì), 何佳林, 杜雙田, 劉建軍, 康永祥, 康博文 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)