專利名稱：Soar1蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物抗逆境脅迫中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種SOARl蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物抗逆境脅迫中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
陸生植物在整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段都可能受到逆境脅迫的影響，其中干早、鹽堿、低溫(冷害與凍害)等非生物脅迫是強(qiáng)烈制約植物生長(zhǎng)和作物產(chǎn)量的重要因素。植物為生存進(jìn)化出一系列抵抗、耐受以及躲避逆境脅迫的策略。有關(guān)植物抗逆性的研究一直是植物學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。傳統(tǒng)的育種技術(shù)改良耐脅迫性狀難度較大，而隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展及對(duì)植物抗逆分子機(jī)制的深入研究，分子水平抗逆基因工程取得重大進(jìn)展。采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)向植物導(dǎo)入抗逆性外源基因已成為改良植物抗逆性的新途徑。植物抗逆機(jī)制及相關(guān)基因工程的研究具有非常廣闊的前景和十分重要的意義。植物對(duì)逆境的適應(yīng)過程涉及到多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑，植物激素可能作為抗逆基因表達(dá)的啟動(dòng)因素。脫落酸ABA作為最重要的植物激素之一，參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育各個(gè)階段，包括種子休眠、成熟、萌發(fā)，幼苗生長(zhǎng)，氣孔運(yùn)動(dòng)，以及營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)換等方面。同時(shí)，ABA在植物對(duì)外界各種逆境脅迫的響應(yīng)中起著重要作用，尤其是非生物脅迫關(guān)系最密切，包括鹽、干旱、低溫以及滲透脅迫，還有機(jī)械傷害等。隨著新基因不斷地被發(fā)現(xiàn)，一個(gè)ABA作用的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)逐步呈現(xiàn)在人們面前，并且這個(gè)網(wǎng)絡(luò)越來(lái)越清晰完善。PPR (pentatricopeptide repeats)基因家族是在植物中發(fā)現(xiàn)的最大家族之一。PPR蛋白(三角形五肽富足蛋白 )在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的重要作用。在擬南芥中鑒定出大約450個(gè)成員，其他陸生植物基因組序列中可編碼更多；然而在水生植物、微生物以及動(dòng)物中，其成員數(shù)量顯著降低。在陸生生物中，來(lái)自不同種屬的PPR蛋白具有高度同源性。PPR蛋白家族較少有基因丟失或者重復(fù)的情況，并且PPR蛋白基因的單基因突變即可引起較嚴(yán)重的突變體表型，說(shuō)明PPR蛋白在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的重要性。PPR蛋白在細(xì)胞內(nèi)主要分布在線粒體、葉綠體或其他亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)內(nèi)，研究發(fā)現(xiàn)PPR蛋白參與細(xì)胞器mRNA的加工過程，包括剪切、剪接、穩(wěn)定、RNA編輯，以及蛋白質(zhì)翻譯起始和核糖體組裝。有的PPR蛋白與雄性胞質(zhì)不育有密切聯(lián)系。目前人們?cè)跀M南芥中僅發(fā)現(xiàn)幾個(gè)PPR蛋白參與抗逆過程，如PPR40、AB05、SLGU PGN與AHGll等，這在龐大的陸生PPR蛋白家族中僅是冰山一角，更多的調(diào)控植物抗逆境脅迫的PPR蛋白還有待研究發(fā)現(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種SOARl蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物抗逆境脅迫中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的應(yīng)用，具體為如下A或B:A:由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)(命名為SOARl)在如下al)或a2)中的應(yīng)用:
a I)調(diào)控植物抗逆性；a2)選育抗逆性提高的植物品種。B:由序列表中序列3所不的氣基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因(命名為S0AR1)在如下al)或a2)中的應(yīng)用:al)調(diào)控植物抗逆性；a2)選育抗逆性提高的植物品種。在本發(fā)明中，以上所有al)中的所述調(diào)控植物抗逆性均具體為提高植物抗逆性；以上所有a2)中的所述選育抗逆性提高的植物品種的方法，均具體可包括將所述SOARl蛋白表達(dá)量較高的植株作為親本進(jìn)行雜交的步驟。在上述應(yīng)用中，所述抗逆性可為如下中的至少一種:抗鹽性、抗旱性和抗低溫性。本發(fā)明還提供一種培育抗逆性提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明所提供的培育抗逆性提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法，具體可包括如下步驟:a)向目的植物中導(dǎo)入由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因，得到表達(dá)所述編碼基因的轉(zhuǎn)基因植物；b)從步驟a)所得轉(zhuǎn)基因植物中得到與所述目的植物相比，抗逆性提高的轉(zhuǎn)基因植物。

在上述應(yīng)用或方法中，所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因(即SOARl基因)是如下I)至5)中任一所述的DNA分子:I)編碼序列為序列表中序列2自5’末端第89至1897位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)序列表中序列I所示的DNA分子；4)在嚴(yán)格條件下與I) -3)任一所限定的DNA分子雜交且編碼由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA分子；5)與I) -4)任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為用6XSSC，0.5%SDS的溶液，在65°C下雜交，然后用2XSSC，0.1%SDS 和 I X SSC, 0.1%SDS 各洗膜一次。其中，序列I由2216個(gè)核苷酸組成，為所述SOARl基因在擬南芥基因組中序列，其中第653-763位為內(nèi)含子序列；序列2由2105個(gè)核苷酸組成，為所述SOARl基因的cDNA序列，其中第89-1897位為編碼序列(ORF);序列I和序列2均編碼序列表中序列3所示的蛋白質(zhì)，序列3由602個(gè)氨基酸殘基組成。在上述方法中，所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因是通過含有所述蛋白質(zhì)的編碼基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物中的。所述重組表達(dá)載體可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等，如pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端。使用所述基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動(dòng)子、泛素基因Ubiquitin啟動(dòng)子(pUbi)、脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子rd29A等，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用重組表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因、具有抗性的抗生素標(biāo)記物或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等。也可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。在本發(fā)明中，所述重組表達(dá)載體中啟動(dòng)所述蛋白質(zhì)的編碼基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子為35S啟動(dòng)子。更為具體的，所述重組表達(dá)載體為將所述SOARl基因插入到pCAMBIA-1300-221載體的多克隆位點(diǎn)用限制性內(nèi)切酶BamH I與Sal I之間后得到的重組質(zhì)粒。在上述方法中，將攜帶有所述SOARl基因的所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物，具體可為:通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。在上述應(yīng)用或方法中，所述植物即可為單子葉植物，也可為雙子葉植物。在本發(fā)明的一個(gè) 實(shí)施例中，所述植物為雙子葉植物，具體為擬南芥，更加具體為擬南芥野生型(Col-Ο生態(tài)型)。在上述方法中，所述抗逆性可為如下中的至少一種:抗鹽性、抗旱性和抗低溫性。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所得的SOARl轉(zhuǎn)基因植株，相比未轉(zhuǎn)基因的對(duì)照植株，對(duì)鹽、干旱、低溫及滲透等多種非生物逆境脅迫的耐受性均提高。本發(fā)明對(duì)植物抗逆性分子機(jī)制以及分子育種研究方面具有重要意義，對(duì)于糧食和經(jīng)濟(jì)作物的遺傳改良，提高作物對(duì)自然氣候?yàn)?zāi)害和不良土壤環(huán)境的抗逆性和耐受性等方面具有重要的實(shí)用價(jià)值和廣闊的市場(chǎng)前景。


圖1為SOARl基因相關(guān)T-DNA插入突變體的鑒定。測(cè)序比對(duì)結(jié)果，突變體soarl_2以及soarl-3T-DNA分別插入在SOARl基因的起始密碼子(ATG)前352bp(啟動(dòng)子區(qū))和77bp(5’非翻譯區(qū))位置。圖2為各遺傳材料SOARl基因表達(dá)量的分析結(jié)果。其中，(a)為SOARl相關(guān)突變體的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果，SOARl基因的表達(dá)均為相對(duì)值，以擬南芥野生型(Col-Ο生態(tài)型)SOARl基因的表達(dá)為I ;(b)為SOARl相關(guān)突變體免疫印跡檢測(cè)結(jié)果，SOARl蛋白的表達(dá)均為相對(duì)值，以擬南芥野生型(Col-Ο生態(tài)型)SOARl蛋白的表達(dá)為100。圖3為NaCl對(duì)SOARl各遺傳材料種子萌發(fā)的影響分析結(jié)果。圖4為NaCl對(duì)SOARl各遺傳材料幼苗生長(zhǎng)的影響分析結(jié)果。其中，(a)為將SOARl各遺傳材料種子分別播種在含有不同NaCl濃度的MS培養(yǎng)基上(OmM和IOOmM),豎直生長(zhǎng)IOd后的幼苗生長(zhǎng)情況；(b)為(a)中對(duì)應(yīng)幼苗的主根長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)。圖5為甘露醇對(duì)SOARl遺傳材料種子萌發(fā)的影響分析結(jié)果。其中，Ca)為OmM甘露醇；(b)為300mM甘露醇。圖6為甘露醇對(duì)SOARl遺傳材料幼苗生長(zhǎng)的影響分析結(jié)果。其中，Ca)為OmM甘露醇；(b)為300mM甘露醇。圖7為低溫脅迫對(duì)SOARl各遺傳材料幼苗生長(zhǎng)的影響分析結(jié)果。其中，Ca)為當(dāng)溫度降到_4°C后，Oh取出的結(jié)果；(b)為當(dāng)溫度降到-4°C后，2h取出的結(jié)果。圖8為低溫脅迫對(duì)SOARl各遺傳材料幼苗存活率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。其中，橫坐標(biāo)的低溫脅迫時(shí)間為當(dāng)溫度降到_4°C后持續(xù)時(shí)間。圖9為低溫脅迫后SOARl各遺傳材料的電解質(zhì)滲透率的測(cè)定結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中的％，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果取平均值 。pCAMBIA-1300-221 載體:由清華大學(xué)提供(記載文獻(xiàn):Li jing Liu, YiyueZhang, Sanyuan Tang，et a 1.An efficient system to detect proteinubiquitination by agroinfiltration in Nicotiana benthamiana.The PlantJournal, 2010(61):893-903.)。在 pCAMBIA-1300-221 載體中，位于多克隆位點(diǎn)(MCS)上游的啟動(dòng)子為35S啟動(dòng)子。在pCAMBIA-1300-221載體中，含有GFP基因。pCAMBIA-1300-221載體相關(guān)信息；http://www.cambia.0rg/daisy/cambia/materials/vec tor s/585, html。擬南芥野生型(Col-0生態(tài)型):擬南芥野生型種子(Arabidopsis thaliana，ecotype Columbia-0)購(gòu)自擬南芥生物研究中心(ABRC)。T-DNA插入突變體soarU、soarl-3種子:購(gòu)自凡爾賽遺傳學(xué)和植物育種實(shí)驗(yàn)室擬南芥資源中心(Versailles Genetics and Plant Breeding Laboratory Arabidopsisthaliana Resource Centre)。背景為擬南芥野生型(Col_0 生態(tài)型)，soarl-2、soarl-3為S0AR1基因表達(dá)降低的兩個(gè)T-DNA插入突變體。種子編號(hào)信息=SoarU: (stocknumber:FLAG—546D07) ；soarl-3: (stock number:FLAG—500B04)。根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens):根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101，由清華大學(xué)提供(記載文獻(xiàn):R.Berres，L Otten，B.Tinland et al.Transformation of vitis tissueby different strains of Agrobacterium tumefaciens containing the T_6b gene.Plant Cell Reports，1992(11):192-195.)。大腸桿菌(Escherichia coli)菌株DH5a (DE3)感受態(tài)，購(gòu)自全式金生物有限公司。S0AR1蛋白抗體:以特異性較高的由序列表中序列3的第299-602位氨基酸組成的肽段作為免疫原，免疫兔子，制備得到的兔源多克隆抗體。實(shí)施例1、S0AR1轉(zhuǎn)基因植物的獲得及鑒定本實(shí)施例中所涉及的S0AR1基因來(lái)源于擬南芥(Arabidopsis thaliana)，其在擬南芥基因組中的序列如序列表中序列I所示，序列I由2216個(gè)核苷酸組成，其中第653-763位為內(nèi)含子序列；所述S0AR1基因的cDNA序列如序列表中序列2所示，序列2由2105個(gè)核苷酸組成，其中第89-1897位為編碼序列(ORF);序列I和序列2均編碼序列表中序列3所示的蛋白質(zhì)，序列3由602個(gè)氨基酸殘基組成。經(jīng)過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，SOARl是PPR蛋白家族中的一員。在 http: //www.eb1.ac.uk/Tools/InterProScan/index, htmla 數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì) SOARl進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)SOARl蛋白是由N端信號(hào)肽、中間三角形五肽富足蛋白區(qū)和C端未知功能區(qū)段構(gòu)成。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)表明所發(fā)現(xiàn)蛋白SOARl是一種新發(fā)現(xiàn)的PPR蛋白(三角形五肽富足蛋白)，其編碼基因(SOARl)是PPR蛋白家族中的一個(gè)新基因。一、重組表達(dá)載體 pCAMBIA-1300-221-S0ARl 的構(gòu)建提取擬南芥野生型(Col-Ο生態(tài)型)的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA。以所得cDNA為模板，通過引物I與引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行純化，表明擴(kuò)增得到約ISOObp片段，測(cè)序表明，該片段具有自序列表中的序列2自5’端起第89-1897位核苷酸序列(SOARl基因的編碼序列，0RF)。引物I:5，-CGGGATCCTATGAACTCTCTGTTCACCGCC-3，(下劃線部分為 BamH I 的識(shí)別位點(diǎn)，該序列的第10-30位為序列2的第89-109位)引物2:5’-ACGCGTCGACTCACTCAAAATCCCCTGCATCTC-3’ (下劃線部分為 Sal I 的識(shí)別位點(diǎn)，其后的序列為序列2的第1875-1897位的反向互補(bǔ)序列)用限制性內(nèi)切酶BamH I和Sal I雙酶切以上所得PCR產(chǎn)物，膠回收酶切片段，與經(jīng)過同樣雙酶切的PCAMBIA-1300-221載體骨架大片段相連，得到重組質(zhì)粒。將所述重組質(zhì)粒送樣測(cè)序，將經(jīng)測(cè)序表明在pCAMBIA-1300-221載體的酶切位點(diǎn)BamH I和Sal I之間插入“T+序列2的第89-1897位”所示DNA片段的重組質(zhì)粒命名為pCAMBIA-1300-221-S0ARl。在重組表達(dá)載體PCAMBIA-1300-221-S0AR1中，啟動(dòng)所述SOARl基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子為35S啟動(dòng)子。在重組表達(dá)載體pCAMBIA-1300-221-S0ARl的構(gòu)建過程中，也可以人工合成的序列表的序列2所不的SOARl基因?yàn)閨旲板。二、SOARl基因表達(dá)降低突變體鑒定SOARl基因表達(dá)降低的兩個(gè)T-DNA插入突變體，將其命名為soarl-2和soarl-3，購(gòu)買自INRA凡爾賽遺傳學(xué)和植物育種實(shí)驗(yàn)室擬南芥資源中心(Versailles Genetics andPlant Breeding Laboratory, Arabidopsis thaliana Resource Centre, http://dbsgap.versailles.1nra.fr/portail/)，背景為擬南芥野生型(Col-0生態(tài)型)。通過分子生物學(xué)方法鑒定出各自的純合體，并通過測(cè)序?qū)ν蛔凅wT-DNA插入位點(diǎn)進(jìn)行分析。測(cè)序比對(duì)結(jié)果如圖1所示:soarl-2突變體中的T-DNA插入在S0AR1基因的起始密碼子(ATG)前352bp (啟動(dòng)子區(qū))位置；soarl-3突變體中的T-DNA插入在S0AR1基因的起始密碼子(ATG)前77bp (5，非翻譯區(qū))位置。 所用引物序列如下:(I)soarl-2(stock number:FLAG_546D07)LB4:5’-CGTGTGCCAGGTGCCCACGGAATAGT-3’ (Left border primer, LB)
soarl-2LP:5’-GTGAACCAACTCAACACTCGG-3，(Left primer, LP)soarl-2RP:5，-TCACCGCAATGTATCTACCATC-3’ (Right primer, RP)(2)soarl-3(stock number:FLAG_500B04)LB4:5，-CGTGTGCCAGGTGCCCACGGAATAGT-3，soarl-3LP:5，-GCTCGTATAGCTTGTTGCACC-3’soar 1-3RP: 5，-ATAACCACATCCATTGCCTTG-3，三、SOARl轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得及鑒定1、SOARl轉(zhuǎn)基因擬南芥及轉(zhuǎn)入pCAMBIA-1300-221空載體的擬南芥植株的獲得將步驟一構(gòu)建的重組表達(dá)載體pCAMBIA-1300-221-S0ARl通過凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)。對(duì)轉(zhuǎn)化后的重組農(nóng)桿菌用由引物I和引物2組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR鑒定。將經(jīng)鑒定表明含有SOARl基因(PCR目的條帶大小為1800bp)的農(nóng)桿菌GV3101命名為 pCAMBIA-1300-221-S0ARl ;將轉(zhuǎn)入 pCAMBIA-1300-221 空載體的農(nóng)桿菌 GV3101 命名為空-GFP/pCAMBIA-1300-221。采用農(nóng)桿菌花序侵染的方法(SJ Clough, AF Bent.Floral dip:asimplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsisthaliana.The Plant Journal, 1998, 16(6):735-743.)將上述所得的重組農(nóng)桿菌pCAMBIA-1300-221-S0AR1 (或空-GFP/pCAMBIA-1300-221)轉(zhuǎn)化擬南芥野生型(Col-0)。轉(zhuǎn)化后進(jìn)行潮霉素抗性篩選，在含40mg/L潮霉素MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，收集具有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)基因擬南芥的種子`，獲得具有潮霉素抗性的兩種轉(zhuǎn)基因苗，即轉(zhuǎn)入PCAMBIA-1300-221-S0AR1的擬南芥植株和轉(zhuǎn)入pCAMBIA-1300-221空載體的擬南芥植株(T1 代)。2、S0AR1轉(zhuǎn)基因擬南芥鑒定(I) PCR 鑒定從步驟I獲得的T1代S0AR1轉(zhuǎn)基因擬南芥，以及轉(zhuǎn)入pCAMBIA-1300-221空載體的對(duì)照植株中分別提取基因組DNA。對(duì)于S0AR1轉(zhuǎn)基因擬南芥，以引物I和引物2 (序列同步驟一所述)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)鑒定同時(shí)得到大小約為ISOObp (外源插入的序列2所示S0AR1基因)和1900bp (擬南芥內(nèi)源的序列I所示S0AR1基因)兩個(gè)目的條帶的植株即為S0AR1轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，而鑒定只得到大小為1900bp目的條帶的植株為S0AR1轉(zhuǎn)基因陰性植株。對(duì)于轉(zhuǎn)入pCAMBIA-1300-221空載體的對(duì)照植株，用GFP引物GFP-Fl和GFP-Rl (引物序列如下)進(jìn)行PCR鑒定，經(jīng)鑒定表明含有GFP基因的(PCR產(chǎn)物大小約為700bp)植株即為pCAMBIA-1300-221空載體轉(zhuǎn)入陽(yáng)性的植株。所用引物序列如下:GFP-Fl:5，-AGGAGAAGAACTTTTCACTGG-3，；GFP-Rl:5’ -GTATAGTTCATCCATGCCATG-3’。經(jīng)上述PCR分子鑒定，將鑒定陽(yáng)性的其中三個(gè)S0AR1轉(zhuǎn)基因擬南芥株系分別記作0E1、0E3 和 0E6。(2)遺傳學(xué)分離比方法鑒定插入拷貝數(shù)根據(jù)遺傳學(xué)原理，單拷貝插入之后自交后代會(huì)產(chǎn)生3:1的分離比。結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法，統(tǒng)計(jì)抗生素培養(yǎng)基上抗性苗和非抗性苗的數(shù)量。用分離比方法鑒定出轉(zhuǎn)基因植株為單拷貝插入的株系(單拷貝S0AR1轉(zhuǎn)基因擬南芥)，從而用于純合體的篩選。
(3)轉(zhuǎn)基因擬南芥0E1、0E3和0E6純合系的篩選經(jīng)上述鑒定分析后，選擇其中三個(gè)代表性單拷貝SOARl轉(zhuǎn)基因擬南芥株系，OEU0E3和0E6 (T1代)。播種于含40mg/L潮霉素MS培養(yǎng)基上，經(jīng)過連續(xù)2代篩選，以所有自交后代均能正常生長(zhǎng)(即所有后代均具潮霉素抗性)的親本植株為純合系，最終獲得T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥0E1、0E3和0E6的純合系植株，作為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行以下ABA耐受性試驗(yàn)分析。四、轉(zhuǎn)基因擬南芥0E1、0E3和0E6純合系中SOARl基因表達(dá)量分析提取擬南芥野生型(Col-Ο生態(tài)型)與T-DNA插入突變體soarl-2、soarl-3，過表達(dá)植株0E1、0E3和0E6的總RNA和總蛋白，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫印跡技術(shù)，分別檢測(cè)這些遺傳材料中SOARl基因在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平上的RNA和蛋白表達(dá)情況。具體如下:1、轉(zhuǎn)錄水平分析(RNA表達(dá)量)以上述獲得的轉(zhuǎn)基因擬南芥0E1、0E3和0E6純合系，T-DNA插入突變體soarl-2、soarl-3,以及擬南芥野生型(Col-0生態(tài)型)萌發(fā)后Id的種子為實(shí)驗(yàn)材料。提取各實(shí)驗(yàn)材料的基因組RNA，分別通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分析SOARl基因在各實(shí)驗(yàn)材料中的表達(dá)情況。其中，擴(kuò)增SOARl基因的引物序列為:引物SOARl-F:5，-TACGGAACTTAGGTTGCTTGAG-3，(序列 2 的第 715-736 位)，引物SOARl-R:5’ -AACAACAGTCGGCTTCACATTC-3’(序列 2 的第 925-946 位的反向互補(bǔ)序列)。以Act in2/8作為內(nèi)參基因，擴(kuò)增內(nèi)參Act in的引物序列為:Actin-F:5，-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3，，Actin-R:5，-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3，。上述引物的反應(yīng)條件如下:(I)反應(yīng)體系的建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)在如下al)或a2)中的應(yīng)用 al)調(diào)控植物抗逆性； a2)選育抗逆性提聞的植物品種。
2.由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因在如下al)或a2)中的應(yīng)用 al)調(diào)控植物抗逆性； a2)選育抗逆性提聞的植物品種。
3.培育抗逆性提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟 a)向目的植物中導(dǎo)入由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因，得到表達(dá)所述編碼基因的轉(zhuǎn)基因植物； b)從步驟a)所得轉(zhuǎn)基因植物中得到與所述目的植物相比，抗逆性提高的轉(zhuǎn)基因植物。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的應(yīng)用，或權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因是如下I)至5)中任一所述的DNA分子 1)編碼序列為序列表中序列2自5’末端第89至1897位核苷酸所示的DNA分子； 2)序列表中序列2所示的DNA分子； 3)序列表中序列I所示的DNA分子； 4)在嚴(yán)格條件下與I)-3)任一所限定的DNA分子雜交且編碼由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA分子； 5)與I)-4)任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA分子。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因是通過含有所述蛋白質(zhì)的編碼基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物中的。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述重組表達(dá)載體中啟動(dòng)所述編碼基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子為35S啟動(dòng)子。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的應(yīng)用或方法，其特征在于所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的應(yīng)用或方法，其特征在于所述抗逆性為如下中的至少一種抗鹽性、抗旱性和抗低溫性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種SOAR1蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物抗逆境脅迫中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的應(yīng)用具體為由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)在如下a1)或a2)中的應(yīng)用a1)調(diào)控植物抗逆性；a2)選育抗逆性提高的植物品種。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所得的SOAR1轉(zhuǎn)基因植株，相比未轉(zhuǎn)基因的對(duì)照植株，對(duì)鹽、干旱、低溫及滲透等多種非生物逆境脅迫的耐受性均提高。本發(fā)明對(duì)植物抗逆性分子機(jī)制以及分子育種研究方面具有重要意義，對(duì)于糧食和經(jīng)濟(jì)作物的遺傳改良，提高作物對(duì)自然氣候?yàn)?zāi)害和不良土壤環(huán)境的抗逆性和耐受性等方面具有重要的實(shí)用價(jià)值和廣闊的市場(chǎng)前景。
文檔編號(hào)A01H5/00GK103255165SQ20131017428
公開日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2013年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月13日
發(fā)明者王小芳, 姜上川, 梅超, 張大鵬 申請(qǐng)人:清華大學(xué)