專利名稱：抗稻瘟病菌的水稻基因OsWRKY19及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗稻瘟病菌的水稻基因及該基因的用途。
背景技術(shù)：
水稻(Oryza sativa L.)作為重要的糧食作物,與全球特別是亞洲國家的糧食安全息息相關(guān)，如何提高水稻抗病蟲害能力是各國農(nóng)業(yè)科學(xué)家所關(guān)心的一項重要研究課題。稻瘟病是危害最嚴重的水稻病害，長年均有不同程度的發(fā)生，能導(dǎo)致水稻減產(chǎn)10-30 %，如何防治稻瘟病是關(guān)系到各國尤其是水稻主產(chǎn)國糧食安全的重大問題。栽培抗病水稻品種是防治稻瘟病的重要手段:通過傳統(tǒng)的遺傳手段，國內(nèi)外的育種學(xué)家獲得了一些具有較好稻瘟病抗性的水稻品種。然而，傳統(tǒng)育種周期過長且效率低下，并且由于稻瘟病菌生理小種遺傳的復(fù)雜性、致病的多樣性，往往造成抗病品種在推廣種植3-5年后抗性消失，引起稻瘟病復(fù)發(fā)和流行。防止稻瘟病的另一種方法是通過噴灑殺真菌劑進行化學(xué)防治，但該方法既昂貴又污染環(huán)境，而且長期有效的殺菌劑的缺乏也使之不能成為有效的防治稻瘟病的手段。所以，通過分子生物學(xué)方法研究水稻的稻瘟病抗性并在其基礎(chǔ)上進行分子育種，有望克服傳統(tǒng)防治方法的種種限制。水稻-稻瘟病菌相互作用的研究作為研究植物-真菌病理分子機制的模型，近十年來受到植物學(xué)家和植物病理學(xué)家的廣泛關(guān)注。在水稻-稻瘟病菌的相互作用中，研究比較多的有兩類基因:一是識別病原菌的抗性基因，二是與防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)的基因，這兩類基因在水稻的防衛(wèi)反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。其中抗性基因的作用是介導(dǎo)植物對稻瘟病菌無毒基因產(chǎn)物的識別，并引起水稻對稻瘟病菌的特異性的抗性。它們的相互作用模式遵循基因?qū)蚣僬f，植物與病原微 生物的相互作用取決于寄主的抗性基因與病原菌的無毒基因，只有當(dāng)它們同時存在時植物才表現(xiàn)出抗性。當(dāng)抗性基因產(chǎn)物與無毒基因產(chǎn)物相互識別后，首先在病菌侵入部位的植物細胞及鄰近的細胞中會迅速誘導(dǎo)形成超敏反應(yīng)，同時誘導(dǎo)水稻的其它防衛(wèi)反應(yīng)，如活性氧的釋放，植物細胞壁的加固，植保素、植物防御素、幾丁質(zhì)酶、蛋白酶抑制劑的合成以及其他病程相關(guān)蛋白和防衛(wèi)相關(guān)蛋白的誘導(dǎo)合成，以便最快地控制或殺死侵入的病菌。植物超敏反應(yīng)的啟動及其引起的防衛(wèi)信號的傳導(dǎo)，最終使寄主的其它組織對隨后的病原菌產(chǎn)生廣譜抗性，即系統(tǒng)獲得性抗性。除了以上兩類基因外，還有一些參與水稻信號途徑的基因也參與水稻對稻瘟病菌的防衛(wèi)反應(yīng)。2006年Reyna等人對水稻中的17個MAPK進行了研究，發(fā)現(xiàn)其中有9個基因可以被稻瘟病菌誘導(dǎo)表達，說明這些MAPK可能在水稻的防衛(wèi)反應(yīng)的信號傳導(dǎo)中具有一定功能。2009年，Li等人研究了 OsWAKl基因的功能，該基因可以被傷害、SA、MeJA還有稻瘟病菌誘導(dǎo)表達，在水稻中組成型表達OsWAKl可以使轉(zhuǎn)基因植株對稻瘟病菌致病小種產(chǎn)生抗性，說明該基因在水稻防衛(wèi)反應(yīng)中具有重要作用。此外，在水稻中過量表達0sWRKY31或0sffRKY53基因，都會增強植物對稻瘟病菌的抗性。這些基因編碼參與水稻防衛(wèi)反應(yīng)信號通路的調(diào)控，初步的研究發(fā)現(xiàn)它們在水稻抗病過程中具有重要功能，它們的具體功能以及作用機制還需要進一步的研究。通過各種方法找到的參與水稻防衛(wèi)反應(yīng)的基因都具有潛在的生產(chǎn)應(yīng)用價值，而借助成熟的水稻轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以快速地得到大量轉(zhuǎn)基因株系。20世紀80年代以來，隨著生物工程技術(shù)的興起與完善，特別是基因工程技術(shù)在作物改良方面的廣泛應(yīng)用，為培育抗病品種提供了新的手段。植物抗病轉(zhuǎn)基因成為生物技術(shù)人員的研究熱點，高效穩(wěn)定的水稻轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立為外源基因轉(zhuǎn)化水稻創(chuàng)造了條件。具體說來，水稻抗病的基因工程主要從抗性(R)基因和防衛(wèi)基因兩個方面進行。Mackil等人培育出了一套以C039作為遺傳背景的帶有Pi_l、P1-2, P1-3, P1-4a和Pi_4b稻瘟病抗性基因的近等基因系，實驗者用這套近等基因系進行接種實驗，發(fā)現(xiàn)攜帶P1-3的近等基因系C104PKT抗病時間長、病斑數(shù)少并且與其他基因組合的累加系也對稻瘟病有很高的抗性；進而利用C104PKT與帶有P1-1和P1-2的近等基因系A(chǔ)57-119雜交培育出 BL13 (攜帶 P1-1、P1-3)、BL-23 (攜帶 P1-2, P1-3)和 BL-123 (攜帶 P1-1、P1-2, P1-3)的近等基因系，目前已引種到美國、越南、菲律賓、印尼、日本等國，經(jīng)3到5年的種植均表現(xiàn)出很高的抗性。而Nishizawa等人將水稻的幾丁質(zhì)酶基因Cht_2、Cht_3分別轉(zhuǎn)入粳稻Nipponbare和Koshihikari,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株中Cht_2在細胞內(nèi)積累，而Cht_3在細胞外積累。Cht-2或Cht-3轉(zhuǎn)基因植株的RO及Rl代對稻瘟菌致病小種的抗性提高，而且抗性與幾丁質(zhì)酶的表達量具有相關(guān)性。Lin等人和Datta等人將水稻中的I類幾丁質(zhì)酶基因Chill轉(zhuǎn)入秈稻，轉(zhuǎn)基因植株對紋枯病表現(xiàn)出一定抗性，而且?guī)锥≠|(zhì)酶的含量和活性與抗性呈正相關(guān)。Feng等人將水稻幾丁質(zhì)酶基因RC24和苜蓿β-1，3-葡聚糖酶基因同時轉(zhuǎn)入水稻，部分Rl代植株對廣東省稻瘟菌5個代表小種表現(xiàn)出不同程度的抗性增強。

現(xiàn)有的研究證明，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進行分子育種有望找到具有實際生產(chǎn)應(yīng)用價值的轉(zhuǎn)基因水稻品種。但是現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因成果還極少有投入到生產(chǎn)應(yīng)用當(dāng)中，而且現(xiàn)在參與水稻抗稻瘟病的關(guān)鍵基因還有待發(fā)現(xiàn)，如何發(fā)現(xiàn)這些基因并且大規(guī)模的轉(zhuǎn)化水稻進行鑒定還有待深入研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種抗稻瘟病的基因及其編碼蛋白，用于提高水稻等植物的抗病性能。本發(fā)明所提供的抗稻瘟病基因，名稱為0sWRKY19，來源于水稻(Oryza sativa)，編碼下述蛋白質(zhì)⑴或(ii):⑴序列表中的SEQ ID No:1所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(ii)序列表中的SEQ ID No:1氨基酸序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而衍生的蛋白質(zhì)，并且所衍生的蛋白質(zhì)具有相同的功能。序列表中的SEQ ID No:1由277個氨基酸殘基組成，其中第105位到165位為保守的WRKY結(jié)構(gòu)域。所述取代、缺失或添加的一至十個氨基酸殘基可以是非保守區(qū)域中的氨基酸殘基，其改變不會對該蛋白的功能產(chǎn)生影響。對氨基酸殘基進行取代、缺失或添加的方法，以及對蛋白功能的檢測均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，通常是利用基因工程的手段對其編碼基因進行突變，然后再表達出相應(yīng)的蛋白并檢測其功能。本發(fā)明的水稻抗稻瘟病基因0sWRKY19的核酸序列可以是其cDNA序列，也可以是基因組DNA序列，或者是與這些序列具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白的DNA序列。序列表中SEQ ID NO:2所示的是OsWRKY19基因的cDNA序列，其中第73位到903是編碼蛋白的CDS序列，SEQ ID NO:3所示的是OsWRKY19基因的基因組DNA序列。本發(fā)明還提供了包含上述核酸序列以及與該核酸序列操作性相連的表達調(diào)控序列的表達載體。在較佳的實施方案中，所述表達調(diào)控序列包括組成型高表達的調(diào)控序列，例如玉米Ubiquitinl啟動子。應(yīng)用0sWRKY19基因可提高植物的抗病性，包括對稻瘟病菌的抗性，其方法可以是將0sWRKY19基因?qū)胫参锛毎⒔M織或器官，再將被轉(zhuǎn)化的植物細胞、組織或器官培育成植株，使所述0sWRKY19基因在植物中表達，得到對稻瘟病抗性提高的轉(zhuǎn)基因植物。其中，0sWRKY19基因通過植物表達載體導(dǎo)入植物細胞、組織或器官。本發(fā)明將編碼0sWRKY19基因的核酸序列在水稻中過量表達，并接種水稻主要的真菌病害——稻瘟病菌，檢測后發(fā)現(xiàn)，0sWRKY19基因具有提高抗病性的功能，帶有0sWRKY19基因表達盒的轉(zhuǎn)基因水稻表 現(xiàn)出對稻瘟病的抗性增強。因此，本發(fā)明所提供的0sWRKY19基因在植物抗病性基因工程中有重要的應(yīng)用價值，利用該基因進行分子育種有望培育出具有實際生產(chǎn)應(yīng)用價值的抗稻瘟病水稻品種。


圖1顯示了實施例3中通過實時定量PCR檢測0sWRKY19基因在部分轉(zhuǎn)基因水稻植株中的表達情況。圖2顯示了實施例3中0sWRKY19轉(zhuǎn)基因水稻幼苗對稻瘟病菌的抗性鑒定和分子鑒定代表結(jié)果，其中A為TP309、OsffRKY19轉(zhuǎn)基因水稻6_1號株系和6_2號株系幼苗葉片接種稻瘟病菌96-4-la小種后7天的表型；B為接種稻瘟病菌小種96_4_la7天后，相應(yīng)OsffRKY19轉(zhuǎn)基因株系和野生型株系中代表性葉片中0sWRKY19基因相對表達量。
具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見:((Molecular Cloning:A Laboratory Manual)) (Sambrook, J.,Russell,David ff,MolecularCloning:A Laboratory Manual, 3rdedition, 2001, NY, Cold Spring Harbor)。實施例1、基因的克隆( — ) OsffRKY19 基因 cDNA 序列的克隆:OsffRKY19基因的基因組DNA序列、cDNA序列和氣基酸序列從MSU/TIGR水稻基因組數(shù)據(jù)庫中獲得(http: //rice, plantbiology.msu.edu/)。根據(jù)0sWRKY19基因的cDNA編碼序列設(shè)計基因特異的PCR引物:Fl:5/ -ATGGTGGAGCTCTGCGGC-3' (SEQ ID No:4);Rl:5/ -CAGATTCTGAATCTCCGATT-3' (SEQ ID No:5)。用這對引物從水稻粳稻(Oryza sativa L.ssp.Japonica)近等基因系品種IRBL22(由國際水稻所培育)的cDNA文庫克隆0sWRKY19基因的cDNA編碼序列。由于OsffRKY19基因的cDNA編碼序列中部分區(qū)域GC含量高達80%以上，用普通高保真酶克隆不至IJ，在多次實驗后，本發(fā)明者利用GC緩沖液I (TaKaRa)與Pfu高保真酶擴增得到0sWRKY19基因的全長cDNA編碼序列。PCR產(chǎn)物用T4連接酶連入pBluescript載體，篩選帶有正向插入片段(基因的ATG靠近T7測序引物)載體并測序，測序正確的質(zhì)粒命名為pBS-0sWRKY19用于構(gòu)建OsWRKY19基因的植物表達載體。( 二 ) OsWRKY19基因植物表達載體的構(gòu)建:為了構(gòu)建0sWRKY19基因的植物表達載體，本發(fā)明者改造了植物表達載體P麗101用于水稻轉(zhuǎn)化。具體的，將P麗101用Hindlll/Kpnl做酶切并回收酶切質(zhì)粒，將玉米Ubiquitinl啟動子序列克隆連入pBluescript載體，得到的pBS-pUbi載體用HindIII/BamHI酶切，回收帶有啟動子序列的DNA片斷。再將0sWRKY19基因的cDNA序列從pBS-0sffRKY19載體BamHI/Kpnl切下。以上三個核酸片段回收純化后，用T4連接酶4°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，使用基因特異引物Fl和Rl進行PCR篩選，從篩選得到的陽性克隆中提取帶有0sWRKY19基因序列的P麗101載體質(zhì)粒，用BamHI酶切驗證正確后用于水稻的愈傷轉(zhuǎn)化。實施例2、組成型表達0sWRKY19基因的轉(zhuǎn)基因水稻的獲得(一 )水稻愈傷誘導(dǎo):選取飽滿的臺北309(ΤΡ309)水稻種子，剝?nèi)シN皮，滅菌洗滌后，均勻的點在帶有2毫克/升2，4-D的滅菌NB固體培養(yǎng)基，32°C持續(xù)光照5天誘導(dǎo)愈傷組織形成。( 二)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化:同時將帶有0sWRKY19基因的pWMlOl載體用熱激法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞，涂布于帶有50微克/升卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基上，28°C黑暗培養(yǎng)2天后，用基因特異引物Fl和Rl篩選陽性克隆。得到的陽性克隆在含有50毫克/升卡那霉素的固體AB培養(yǎng)基28°C黑暗培養(yǎng)3天，用于水稻轉(zhuǎn)化。
·
(三)水稻愈傷轉(zhuǎn)化:用過濾滅菌的含有100微摩爾/升乙酰丁香酮的液體轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基從AB培養(yǎng)基上將農(nóng)桿菌洗下，菌液濃度調(diào)至0D600在0.08左右。選取生長狀況良好的愈傷組織，在菌液中浸泡2分鐘，然后在無菌濾紙上晾干，再將愈傷組織移至含有100微摩爾/升乙酰丁香酮的NB共培養(yǎng)培養(yǎng)基，25 °C黑暗下共培養(yǎng)3天。(四)篩選水稻愈傷組織:共培養(yǎng)3天后，用無菌水洗滌愈傷組織5次，再用200毫升含有500毫克/升羧芐青霉素鈉的無菌水洗一遍，小心倒去液體，用無菌鑷子將愈傷組織夾取至無菌濾紙上，晾干后轉(zhuǎn)移至NB篩選培養(yǎng)基(含有2毫克/升的2，4-D、50毫克/升的潮酶素和400毫克/升的羧芐青霉素鈉)，32°C持續(xù)光照2周。(五)陽性愈傷的分化:選取生長良好呈嫩黃色的陽性愈傷組織，用無菌鑷子移至NB預(yù)分化培養(yǎng)基(含有I暈克/升NAA、5暈克/升ABA、2暈克/升kinetin、25暈克/升的潮酶素和200暈克/升的羧芐青霉素鈉)上，32°C持續(xù)光照培養(yǎng)。2周后挑選生長旺盛的愈傷組織轉(zhuǎn)入MS分化培養(yǎng)基(含有0.02毫克/升NAA、2毫克/升kinetin、50毫克/升的潮酶素和200毫克/升的羧芐青霉素鈉)，32°C持續(xù)光照培養(yǎng)。待分化出來的幼苗長至2-5毫米，轉(zhuǎn)入不含激素和抗生素的MS培養(yǎng)基培養(yǎng)2-3周，然后移入土中置于溫室中生長(溫度28-30°C，16小時光照/8小時黑暗)。
實施例3、組成型表達0sWRKY19基因增強水稻對稻瘟病的抗性(一 )轉(zhuǎn)基因水稻中0sWRKY19基因表達水平的檢測:剪取轉(zhuǎn)基因水稻幼苗的葉片，用Trizol試劑(Invitrogen)提取植物總RNA，DNase
I(TaKaRa)處理消化DNA后,用Invitrogen的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄,得到轉(zhuǎn)基因植株的cDNA。根據(jù)0sWRKY19基因的cDNA序列設(shè)計基因特異的實時定量PCR引物realF和realR，通過實時定量PCR檢測0sWRKY19基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達水平。內(nèi)參基因選用水稻的UBQ基因(引物使用realF2和realR2)，各引物序列如下:realF:5/ -GCCAGTTCAGCAGCGACTTC-3' (SEQ ID No:6)；realR:5/ -GTGCATTCGGCCACCTACAG-3' (SEQ ID No:7);realF2:5/ -GTGGCCAGTAAGTCCTCAGC-3(SEQ ID No:8)；realR2:5/ -ACAATGAAACGGGACACGAC-3' (SEQ ID No:9)。實時定量PCR檢測0sWRKY19基因在轉(zhuǎn)基因水稻植株中的表達情況如圖1所示；TP309代表未轉(zhuǎn)基因的臺北309水稻植株。( 二)轉(zhuǎn)基因水稻的稻瘟病接種實驗:選擇稻瘟病菌毒性小種96-4-la，對轉(zhuǎn)基因水稻幼苗進行活體葉片接種。稻瘟病菌96-4-la在燕麥培養(yǎng)基上28°C黑暗培養(yǎng)I周左右，用無菌水洗下表面菌絲，涂布到一塊新的燕麥培養(yǎng)基上，2 8°C培養(yǎng)I天后，用無菌棉簽輕輕刮去表面菌絲，置于日光燈下生產(chǎn)孢子。24小時后用含有0.02% Tween-20的無菌水洗下孢子，用血球計數(shù)板計算孢子濃度，將孢子濃度調(diào)整至IXlO5孢子/毫升。取四葉期水稻幼苗，進行稻瘟病菌孢子的噴霧接種，每株苗噴霧2-4mL，待所有幼苗的葉片表面均勻的覆蓋有一層細小的孢子懸浮液滴后，將其置于100%濕度，26°C的黑暗培養(yǎng)箱中24h。一天后恢復(fù)正常光周期培養(yǎng)，7天后觀察表型。結(jié)果如圖2所示，過表達0sWRKY19基因的轉(zhuǎn)基因水稻幼苗對稻瘟病小種96-4-la的抗性增強。由此可以得出結(jié)論，OsffRKYlQ基因的組成型表達增強了水稻對稻瘟病的抗性。本發(fā)明通過轉(zhuǎn)化水稻愈傷，獲得0sWRKY19基因的過表達轉(zhuǎn)基因水稻，通過接菌試驗發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)基因水稻對稻瘟病的抗性增強。該基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物為植物轉(zhuǎn)錄因子，該基因的產(chǎn)物可以提高植物的抗病能力，具有用于培育抗稻瘟病水稻的應(yīng)用價值。
權(quán)利要求
1.水稻0SWRKY19基因在提高植物抗病性中的應(yīng)用，所述0SWRKY19基因編碼下述蛋白質(zhì)⑴或(ii): (i)序列表中的SEQ ID No:1所不氣基酸序列的蛋白質(zhì)； ( )序列表中的SEQ ID No:1氨基酸序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而衍生的蛋白質(zhì)，并且所衍生的蛋白質(zhì)具有相同的功能。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述OsWRKY19基因的序列是該基因的cDNA序列或基因組DNA序列。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述OsWRKY19基因的核苷酸序列，如序列表中 SEQ ID No:2 或 SEQ ID No:3 所示。
4.如權(quán)利要求1 3任一所述的應(yīng)用，其特征在于，將所述OsWRKY19基因?qū)胫参锛毎⒔M織或器官， 再將被轉(zhuǎn)化的植物細胞、組織或器官培育成植株，使所述OsWRKY19基因在植物中表達，得到抗稻瘟病性提高的轉(zhuǎn)基因植物。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述OsWRKY19基因通過植物表達載體導(dǎo)入植物細胞、組織或器官。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述植物表達載體包含所述OsWRKY19基因序列和與該基因序列操作性相連的表達調(diào)控序列。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用,其特征在于，所述植物表達載體中，用玉米Ubiquitinl啟動子驅(qū)動所述OsWRKY19基因的表達。
8.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述植物為水稻。
9.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述抗病性是指對稻瘟病菌的抗性。
全文摘要
本發(fā)明提供了抗稻瘟病菌的水稻基因OsWRKY19及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的抗稻瘟病基因，編碼序列表中SEQ IDNo1所示氨基酸序列的植物轉(zhuǎn)錄因子或其同功能的衍生蛋白質(zhì)。在水稻中表達該基因可以提高植株對稻瘟病菌的抗性。OsWRKY19基因在植物抗病性基因工程中有重要的應(yīng)用價值，利用該基因進行分子育種有望培育出具有實際生產(chǎn)應(yīng)用價值的抗稻瘟病水稻品種。
文檔編號A01H5/00GK103243110SQ201310193499
公開日2013年8月14日 申請日期2013年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月23日
發(fā)明者瞿禮嘉, 秦跟基, 魏桐, 顧紅雅, 郭冬姝 申請人:北京大學(xué)