一種新型轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒載體及其構(gòu)建方法、體內(nèi)含新型重組基因家蠶的培育方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種新型轉(zhuǎn)基因載體及其構(gòu)建、體內(nèi)含有新型重組基因家蠶培育方法，這種新型轉(zhuǎn)基因家蠶具有一種重組的含MMP酶切位點(diǎn)的絲素重鏈蛋白基因，這項(xiàng)發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)昆蟲(chóng)優(yōu)良品種培育利用領(lǐng)域；新型轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建流程圖見(jiàn)附圖；利用MMPs酶切位點(diǎn)可被MMPs酶切的特點(diǎn)，將MMPs酶切位點(diǎn)引入到家蠶絲素中，使家蠶絲素具有新的性能，達(dá)到通過(guò)生物學(xué)方法對(duì)家蠶絲素改性的目的；本專利將含有MMPs酶切位點(diǎn)的重組絲素蛋白基因克隆到PiggyBac轉(zhuǎn)座子載體上并將該載體通過(guò)顯微注射的方法注入家蠶蠶卵內(nèi)，蠶卵經(jīng)孵化后通過(guò)選擇眼睛發(fā)綠色熒光的個(gè)體確定培育成功的新型轉(zhuǎn)基因家蠶。
【專利說(shuō)明】一種新型轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒載體及其構(gòu)建方法、體內(nèi)含新型重組 基因家蠶的培育方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)昆蟲(chóng)優(yōu)良品種培育利用領(lǐng)域，具體涉及一種新型重組基因家蠶培 育方法領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 作為一種天然材料，蠶絲在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著強(qiáng)勁的優(yōu)勢(shì)，如生物相容性，安全 性，可降解性，良好的機(jī)械性能等。蠶絲作為醫(yī)用材料有著很多的要求，也會(huì)產(chǎn)生一些局限， 例如作為組織工程支架，它的降解速率要求和組織細(xì)胞的生長(zhǎng)速率相一致，但是現(xiàn)有蠶絲 不能更好地被控制在合適的時(shí)間里被降解；作為藥物輸送體系，藥物作用部位對(duì)蠶絲本身 的識(shí)別性很低，如果蠶絲具有更好的導(dǎo)向作用將在藥物輸送過(guò)程中發(fā)揮更大的作用；當(dāng)蠶 絲參與腫瘤等疾病的治療過(guò)程中，作為傳感器，快速的反應(yīng)時(shí)間還需要進(jìn)一步的探索研究。 目前使用的蠶絲多為天然蠶絲，而從基因水平利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)蠶絲蛋白進(jìn)行改造，使改 造后的蠶絲蛋白具有更好的生物相容性，降解性以及特有的藥物輸送靶向性等特性將有著 很好的潛在價(jià)值。
[0003] 基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs)是降解細(xì)胞外基質(zhì) (extra-cellular matrix, ECM)的最重要的酶系，占 ECM降解酶總活性的70%以上，MMPs的 活化被認(rèn)為是ECM降解的限速環(huán)節(jié)。利用MMPs酶切位點(diǎn)可被MMPs酶切的特點(diǎn)，已有相關(guān) 技術(shù)創(chuàng)新出現(xiàn)，如黃迪南等的發(fā)明專利：基質(zhì)金屬蛋白酶導(dǎo)向性重組人腫瘤壞死因子融合 蛋白及制備(專利申請(qǐng)?zhí)?2007100280375)。但目前還沒(méi)有關(guān)于將MMPs酶切位點(diǎn)引入重組 絲素重鏈蛋白，構(gòu)建新型家蠶絲素的報(bào)導(dǎo)。目前對(duì)家蠶絲素改性的方法有物理方法，如將蠶 絲制成微球/納米顆粒等，但物理方法改性不能改變絲素的生物化學(xué)特性。也有化學(xué)方法， 如絲素蛋白的接枝改性等?；瘜W(xué)方法對(duì)家蠶絲素進(jìn)行加工改性，需要消耗更多的能源，甚至 造成環(huán)境污染。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于培育一種新型轉(zhuǎn)基因家蠶，這種新型轉(zhuǎn)基因家蠶具有一種重組 的絲素重鏈蛋白基因，并且這種重組絲素重鏈蛋白含有MMP酶切位點(diǎn)，解決化學(xué)方法耗能 多，環(huán)境污染問(wèn)題，物理方法不能改變絲素的生物化學(xué)特性問(wèn)題
[0005] 發(fā)明技術(shù)方案：本專利將MMP酶切位點(diǎn)引入到重組絲素重鏈蛋白基因中，構(gòu)建一 種新型家蠶轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒載體，并將這種新型載體采用顯微注射法注入到產(chǎn)下一定時(shí)間內(nèi)的 蠶卵中，通過(guò)觀察蠶蛾眼部的熒光現(xiàn)象鑒定轉(zhuǎn)基因是否成功，培育一種新型轉(zhuǎn)基因家蠶，這 種新型轉(zhuǎn)基因家蠶的培育方法將成為用生物學(xué)方法改造家蠶絲素，使家蠶絲素蛋白具有 MMP酶切位點(diǎn)的基礎(chǔ)技術(shù)，達(dá)到絲素改性的目的。
[0006] 本發(fā)明第1個(gè)目的是采用基因克隆技術(shù)構(gòu)建一種新型家蠶轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒載體，這種 質(zhì)粒載體具有一種重組的絲素重鏈蛋白基因，并且這種重組絲素重鏈蛋白含有MMP酶切位 點(diǎn)，通過(guò)以下方案實(shí)現(xiàn)：
[0007] 首先采用乙醇沉淀法提取家蠶(菁松）基因組，然后利用設(shè)計(jì)的引物PCR擴(kuò)增出家 蠶重鏈N端和C端基因序列片段，接著運(yùn)用pMD-18T simple載體連接技術(shù)，PCR技術(shù)，酶 切技術(shù)，T4DNA連接酶技術(shù)構(gòu)建新型家蠶轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒載體(構(gòu)建流程圖見(jiàn)圖1)。
[0008] 本發(fā)明第2個(gè)目的是將已構(gòu)建的新型家蠶轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒載體采用顯微注射法注入 到產(chǎn)下一定時(shí)間內(nèi)的蠶卵中，通過(guò)觀察蠶蛾眼部的熒光現(xiàn)象鑒定轉(zhuǎn)基因是否成功，培育一 種新型轉(zhuǎn)基因家蠶，這種家蠶基因組具有一種重組的絲素重鏈蛋白基因，并且這種重組絲 素重鏈蛋白含有MMP酶切位點(diǎn)，通過(guò)以下方案實(shí)現(xiàn)：
[0009] 首先將已構(gòu)建的新型家蠶轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒載體pBac[3XP3-EGFPafm]-FibH-GS-site 與Piggybac Help Plasmid進(jìn)行等量混合，采用顯微注射法將混合質(zhì)粒注入產(chǎn)下一定時(shí)間 內(nèi)的蠶卵中。通過(guò)觀察后代蠶蛾眼部的熒光現(xiàn)象鑒定轉(zhuǎn)基因是否成功，并通過(guò)基因組PCR 法及測(cè)序鑒定獲得新型轉(zhuǎn)基因家蠶。
[0010] 本發(fā)明的有益效果是：
[0011] 1、本發(fā)明提供的技術(shù)中將家蠶(菁松)基因組中絲素重鏈的N端和C端基因以及基 質(zhì)金屬蛋白酶的酶切位點(diǎn)基因序列克隆進(jìn)PiggyBac載體中，采用顯微注射的方法進(jìn)行家 蠶蠶卵的轉(zhuǎn)基因，達(dá)到了培育一種新型轉(zhuǎn)基因家蠶的效果。這種新型轉(zhuǎn)基因家蠶具有一種 重組的絲素重鏈蛋白基因，并且這種重組絲素重鏈蛋白含有MMP酶切位點(diǎn)。
[0012] 2、本發(fā)明提供的技術(shù)中將眼特異啟動(dòng)子3XP3啟動(dòng)子調(diào)控下轉(zhuǎn)錄的綠色熒光蛋 白基因置于PiggyBac載體中與重組絲素重鏈蛋白基因一同轉(zhuǎn)入家蠶蠶卵中。達(dá)到了直觀 分離培育成功的新型轉(zhuǎn)基因家蠶的效果。
[0013] 3、生物學(xué)方法改造家蠶絲素，可減少絲素產(chǎn)品加工的步驟，從而減少能源的消耗。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1用于構(gòu)建一種新型家蠶轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒載體的流程圖
[0015] 圖2新型家蠶轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒載體的PCR驗(yàn)證
[0016] 圖3體視顯微鏡下觀察對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組蠶蛾
[0017] 圖4PCR擴(kuò)增檢測(cè)轉(zhuǎn)基因蠶蛾基因組
[0018] 圖5轉(zhuǎn)基因蠶蛾基因組中片段Fib H-GS-site的測(cè)序結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0019] 本發(fā)明結(jié)合具體實(shí)施例作進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明目的，而不 用于限制本發(fā)明范圍。
[0020] 實(shí)施例1
[0021] 本發(fā)明采用基因克隆技術(shù)構(gòu)建一種新型家蠶轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒載體，這種質(zhì)粒載體具有 一種重組的絲素重鏈蛋白基因，并且這種重組絲素重鏈蛋白含有MMP酶切位點(diǎn)。具體步驟 如下：
[0022] 1，設(shè)計(jì)新型家蠶轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒載體構(gòu)建流程
[0023] 設(shè)計(jì)用于構(gòu)建一種新型家蠶轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒載體的流程，見(jiàn)圖1。其中fibroin H指絲 素重鏈基因，PCR指聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，F(xiàn)ibH-N指絲素重鏈蛋白N端基因序列，A，B，F(xiàn)分 別指 Asc I，BamH I，F(xiàn)se I 酶切位點(diǎn)，pMD-FibH-N 指克隆有 FibH-N 的 pMD-18T simple 載 體(購(gòu)于Takara公司），F(xiàn)ibH-GS-site-C指帶有MMPs酶切位點(diǎn)的絲素重鏈蛋白C端基因序 列。
[0024] 2,家蠶(菁松）基因組提取
[0025] 取家蠶(菁松）5齡三天蠶的中腸，放入預(yù)冷的研缽中，加入液氮快速研磨 成粉狀；將粉末刮入I. 5ml EP管中，加入抽提緩沖液（IOMm Tris-Cl (PH8. 0)，0. IM EDTA(PH8. 0)，0. 5%SDS) 700 μ 1，室溫放置lh，再加入蛋白酶K至終濃度為500 μ g/mL，同時(shí) 加入RNase至終濃度為50 μ g/ml，放置于56°C水浴鍋中水浴5h (每隔Ih搖晃一次）；取出 消化后的樣品，加入等體積苯酚，搖勻后，12000rpm離心IOmin,取上清650 μ 1至新的I. 5ml EP管中；加入等體積的酚/氯仿/異戊醇（25 :24 :1)，搖勻后，12000rpm離心lOmin，取上清 600 μ 1至新的I. 5ml EP管中；加入等體積的酚/氯仿（1 :1)，搖勻后，12000rpm離心IOmin, 取上清550μl至新的1.5mlEP管中；加入等體積的氯仿，搖勻后，12000rpm離心10min，取 上清500 μ 1至新的I. 5ml EP管中；加入900 μ 1預(yù)冷的無(wú)水乙醇，再加入100 μ 13M NaAC (ΡΗ5. 2)，置于-20°C冰箱中冰凍15min ;12000rpm離心lOmin，沉淀DNA，棄上清；用lml70% 冰乙醇洗滌沉淀2次，然后盡量棄上清，自然晾干，使乙醇揮發(fā)殆盡；加入40μ1 dd H20滅 菌dd H20,溶解沉淀2h或者4°C過(guò)夜，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0026] 3,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)擴(kuò)增絲素重鏈蛋白基因目的序列
[0027] (1)引物設(shè)計(jì)
[0028] 以家蠶(菁松）基因組為模板，利用Primer Premier5. O設(shè)計(jì)以下引物：
[0029] Asc ! ： Fib-H-p I i^iictiGGCGCGCCtucmuatcaiigaaaaat^-.V X O O O O C5 CO O GGCGCGCC Fib-H-p2 51-cgC3GATCCtgcaccgactgcagcactagtg-3 5 BaniH i: GGATCC 5'-c ^GCj ATCCgetgetgetgiittccccattii Ligtttutauuc Big-o-p3 ^ ---- ' ' 一 BamH i： GGATCC tggtggtggtggttccagcgtcagttacggagcrgg-S5 Fse I : Fib-H-p4 5,-ucgGGCCGGCCtataiitattcttauttiiau-3 , GGCCGGCC
[0030] 其中Fib-H-Pl和Fib-H-p2是用來(lái)擴(kuò)增家蠶絲素重鏈N端基因的引物對(duì)， Fib-H-pl和Fib-H-p2分別為上游引物和下游引物。Big-〇-p3和Fib-H-p4是用來(lái)擴(kuò)增家蠶 絲素重鏈C端基因的引物對(duì)，Big-〇-p3和Fib-H-p4分別為上游引物和下游引物，Big-〇-p3 引物中含有MMPs酶切位點(diǎn)序列。
[0031] (2)PCR擴(kuò)增：利用設(shè)計(jì)的引物對(duì)提取的家蠶基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得家蠶絲素重 鏈N端和C端基因序列片段。PCR擴(kuò)增體系如下 ：
[0032]

【權(quán)利要求】
1. 一種新型家蠶轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒載體，其特征在于，質(zhì)粒載體含有重組絲素重鏈蛋白基因， 重組絲素重鏈蛋白含有基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs)酶切位點(diǎn)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種新型家蠶轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒載體，其特征在于，質(zhì)粒載體為 PiggyBac轉(zhuǎn)座子載體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種新型家蠶轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒載體，其特征在于，PiggyBac轉(zhuǎn)座 子含有眼特異啟動(dòng)子3XP3啟動(dòng)的綠色熒光蛋白基因。
4. 一種新型家蠶轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒載體構(gòu)建方法，其特征在于，步驟如下： A :采用沉淀法提取家蠶基因組； B :PCR擴(kuò)增絲素重鏈蛋白基因目的序列； C、構(gòu)建新型家蠶轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒載體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的新型家蠶轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒載體構(gòu)建方法，其特征在于，PCR擴(kuò)增絲 素重鏈蛋白基因目的序列過(guò)程，先PCR引物設(shè)計(jì)，以家蠶(菁松)基因組為模板，利用Primer Premier5. O設(shè)計(jì)引物，引物中含有MMPs酶切位點(diǎn)序列。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的新型家蠶轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒載體構(gòu)建方法，其特征在于，構(gòu)建新型 家蠶轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒載體，其載體構(gòu)建方法如下： (1) 構(gòu)建質(zhì)粒：將引物Fib-H-pl和Fib-H-p2的PCR產(chǎn)物直接連接至pMD-18T simple 載體中，構(gòu)建質(zhì)粒pMD-FibH-N ; (2) 制備感受態(tài)細(xì)胞； (3) 轉(zhuǎn)化、存菌； (4) 質(zhì)粒提?。? (5) DNA的瓊脂糖凝膠電泳及膠回收； (6 )對(duì)提取好的質(zhì)粒pMD-FibH-N和經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳及膠回收的PCR產(chǎn)物 FibH-GS-site-C進(jìn)行雙酶切；酶切后膠回收FibH-N序列和FibH-GS-site-C序列，并用 T4DNAligase 連接； (7) 第6步連接產(chǎn)物膠回收后以引物對(duì)Fib-H-pl和Fib-H-p4PCR擴(kuò)增含MMPs酶切位 點(diǎn)的重組絲素重鏈蛋白基因； (8) 對(duì)第7步PCR產(chǎn)物的膠回收產(chǎn)物和轉(zhuǎn)基因載體質(zhì)粒pBac[3XP3-EGFPafm]進(jìn)行雙 酶切； (9) 酶切后膠回收目的序列，并用T4DNA Iigase連接，構(gòu)建新型家蠶轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒載體， 并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中。
7. -種新型轉(zhuǎn)基因家蠶的培育方法，其特征在于，將已構(gòu)建的新型家蠶轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒載 體采用顯微注射法注入到產(chǎn)下一定時(shí)間內(nèi)的蠶卵中，通過(guò)觀察蠶蛾眼部的熒光現(xiàn)象鑒定出 已經(jīng)成功進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的家蠶，并通過(guò)基因組PCR法及測(cè)序鑒定獲得的轉(zhuǎn)基因家蠶進(jìn)行培 育，其步驟如下： (1) 質(zhì)粒提取：將已構(gòu)建的PiggyBac轉(zhuǎn)座載體提取待用； (2) 顯微注射：將PiggyBac轉(zhuǎn)座載體注入蠶卵內(nèi)的方法是在PiggyBac轉(zhuǎn)座子載體與 Help質(zhì)?；旌虾螅?. 4 μ g/μ 1注射到非滯育的早期胚胎中； (3) 家蠶飼育； (4) 突光篩選：篩選具有PiggyBac轉(zhuǎn)座載體的家蠶； (5) 轉(zhuǎn)基因蠶蛾的PCR擴(kuò)增測(cè)序：進(jìn)一步檢測(cè)篩選出的家蠶是否具有轉(zhuǎn)基因。 (6) 家蠶培育：對(duì)具有轉(zhuǎn)基因的家蠶進(jìn)行常規(guī)培育。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的新型轉(zhuǎn)基因家蠶的培育方法，其特征在于，PiggyBac轉(zhuǎn)座子 載體與Help質(zhì)粒體積比例為1 :1。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的新型轉(zhuǎn)基因家蠶的培育方法，其特征在于，注射量為15-20ng (10-15nl)DNA。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的新型轉(zhuǎn)基因家蠶的培育方法，其特征在于，早期胚胎為產(chǎn)卵 后1?3h〇
【文檔編號(hào)】A01K67/04GK104212833SQ201310209747
【公開(kāi)日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2013年5月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月30日
【發(fā)明者】黃國(guó)平, 孫春鳳, 陳克平, 姚勤, 陳慧卿, 張春霞, 張志燕 申請(qǐng)人:江蘇大學(xué)