一種誘導糖尿病模型的建立方法
【專利摘要】本發(fā)明適用于醫(yī)學領域，提供了一種誘導糖尿病模型的建立方法，所述方法包括：實驗動物總量的5/6只雄性猴，年齡7-20歲，采食猴高脂飼料，主要成份為18％蛋白質，60％糖類，22％脂肪；實驗動物總量的1/6只雄性猴，年齡4-10歲，喂食猴標準飼料，主要成份為18％蛋白質，69％糖類，3％脂肪。本發(fā)明采用長期膳食誘導糖尿病的模型建立可以解決由藥物造模不能真正很好的模擬人類糖尿病發(fā)展的長期緩慢進程及由此引起的全身機體變化的問題，科學性較強。
【專利說明】一種誘導糖尿病模型的建立方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)學領域，尤其涉及一種誘導糖尿病模型的建立方法。
【背景技術】
[0002]目前，糖尿病的研究所采用的動物多為大、小鼠，造模方法有自發(fā)和化學誘導等方法。目前糖尿病研究多采用嚙齒類動物模型，但嚙齒類與人類的親緣關系較遠，且壽命短，因此，并不適于糖尿病機理及其并發(fā)癥的研究。在非靈長類動物中，無論是自發(fā)性、鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)化合物誘導、基因突變、或者其他途徑獲得的糖尿病模型都有I型和2型糖尿病動物模型的報道。所有種類的動物模型中，在非人靈長類動物模型中觀察到的血糖規(guī)律、病理特征與在人類糖尿病患者中觀察到的臨床特征最為相似。
[0003]現(xiàn)有技術中，在鏈脲霉素誘導高血糖動物模型中，選用動物，常用小鼠或大鼠，也可選用兔、犬及猴等，配制不同濃度或單一濃度的STZ水溶液，采用靜脈或腹腔注射方式單次或多次重復給藥。經(jīng)過不同處理時間后檢測是否成模。分別在注射STZ前，給藥后不同時間(一般2-6個月，有I年時間)進行血糖值測定、葡萄糖耐量實驗和血清胰島素或C肽檢測，頻率均有不同，并觀察記錄動物的體重變化和臨床癥狀。
[0004]在鏈脲霉素誘導高血糖動物模型中，存在以下問題:
[0005](1)采用的STZ在不同動物，甚至不同報道中誘導糖尿病所需要的劑量不盡相同，高劑量STZ會引起造模動物死亡，低劑量STZ難于成模，或者成模后很快就轉陰。另外，STZ注射方式(腹腔、靜脈注射)等對造模也有一定影響。因此，采用STZ造糖尿病動物模型時一定要選用適合的劑量和注射方式，一方面降低STZ的毒副作用；另一方面提高STZ成模的穩(wěn)定性。很難掌握，缺點突出。
[0006](2)由藥物STZ引起的胰島損傷并不能真正很好的模擬人類糖尿病發(fā)展的長期緩慢進程及由此引起的全身機體變化，因此用于相關研究的科學性尚不足。
[0007](3)目前報道的STZ誘導的非人靈長類動物糖尿病為I型糖尿病，未見誘導2型糖尿病的報道，且多用作胰腺細胞的異種移植受體，極少用于新藥評價中。
[0008](4)在非人靈長類動物糖尿病造模的時間上還不長，有待進行更長期的研究以確定模型的穩(wěn)定性與時相轉化。
[0009]另外，在食物誘導非人靈長類糖尿病模型中，Wagner等給45只食蟹猴飼喂高碳水化合物和低膽固醇的食物[18%蛋白、22%的脂肪、60%碳水化合物(果糖含量達20% )]。雖然大部分食蟹猴的空腹血糖值保持正常，但糖耐量檢測發(fā)現(xiàn)，其血糖濃度和胰島素含量在個體中的差別很大。那些具高胰島素(HyperinSul inemic, HI)的8只猴子或者糖耐量受損(impaired glucose tolerant, IGT)的10只猴子空腹血糖濃度和胰島素含量顯著地升高。同時具有高血糖和糖耐量受損的5只猴子(HI+IGT)出現(xiàn)肥胖，體重比對照組猴子多40%，這組猴子的廋素濃度也高。與正常食物飼喂的其他猴子相比，所有上述猴子具高血脂和低HDLC，其中HI+IGT組猴子的值最高。一年后，10只IGT猴子中的I只和5只HI+IGT猴子中的3只發(fā)展為糖尿病。[0010]在食物誘導非人靈長類糖尿病模型中，存在下述問題:
[0011](I)使用的動物為食蟹猴，該猴為熱帶猴，國內主要集中在廣西、廣東、海南三省，受氣候環(huán)境、資源條件的影響非常大。所以急需建立其他亞種的糖尿病模型動物。
[0012](2)現(xiàn)有技術造模的時間在I年內，還不能很好地觀察到模型的發(fā)展進程和變化。[0013](3)動態(tài)監(jiān)測的頻率還不夠，穩(wěn)定的模型需要不同時間段的更加穩(wěn)定的檢測指標來支持。
[0014](4)該類非人靈長類糖尿病模型在國內還未見報道。

【發(fā)明內容】

[0015]本發(fā)明實施例提供了一種誘導糖尿病模型的建立方法，旨在解決現(xiàn)有技術藥物造模中毒副作用強，穩(wěn)定性差的問題。
[0016]本發(fā)明實施例是這樣實現(xiàn)的，一種誘導糖尿病模型的建立方法，所述方法包括:
[0017]實驗動物總量的5/6只雄性猴，年齡7-20歲，采食猴高脂飼料，主要成份為18 %蛋白質，60%糖類，22%脂肪；實驗動物總量的1/6只雄性猴，年齡4-10歲，喂食猴標準飼料，王要成份為18%蛋白質，69%糖類,3%脂肪。
[0018]本發(fā)明實施例采用長期膳食誘導糖尿病的模型建立可以解決由藥物造模不能真正很好的模擬人類糖尿病發(fā)展的長期緩慢進程及由此引起的全身機體變化的問題，科學性較強。
【具體實施方式】
[0019]為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0020]本發(fā)明實施例采用長期膳食誘導糖尿病的模型建立可以解決由藥物造模不能真正很好的模擬人類糖尿病發(fā)展的長期緩慢進程及由此引起的全身機體變化的問題，科學性較強。
[0021]在本發(fā)明實施例中，實驗動物為60只雄性恒河猴川西亞種(M.m.1asiotis)，普通級，年齡4-20歲，體重5-18kg，由國家(四川)實驗用獼猴種源基地提供，合格證號:22。喂食高脂飼料前，所有動物空腹血糖(FPG) ^ 5mmol/L.試驗前檢疫合格，內容包括體檢，2次結核桿菌試驗、寄生蟲、沙門氏菌、致賀氏菌和B病毒檢查。不銹鋼猴籠中飼養(yǎng)，4只/籠，飼養(yǎng)室溫度和濕度:19-26°C (66-79° F)和50±20% ;換氣次數(shù):10次/h，保證12( H )/12(夜)h的光照周期。
[0022]在本發(fā)明實施例中，試驗監(jiān)測周期為2年，每日上午自由攝取實驗猴飼料250g，下午4點給予I個蘋果或等量蔬菜。50只雄性猴，年齡7-20歲，采食猴高脂飼料(飼料詳細配方暫時略，需要再提供)，主要成份為18%蛋白質，60%糖類，22%脂肪；10只雄性猴，年齡4-10歲，喂食猴標準飼料，主要成份為18%蛋白質，69%糖類，3%脂肪。
[0023]在本發(fā)明實施例中，飲用水為自來水，經(jīng)自動飲水嘴自由攝取。水樣需分析可溶性固體總量、硬度、特殊微生物含量、選擇的元素、重金屬、有機物以及氯代烴含量。結果記錄在檔案中。動物福利符合“the Nat i onal Inst i tutes of Health Guide for theCare and Use of Laboratory Animal ”要求,所有實驗方案都經(jīng)過中心動物福利和使用委員會的審查和同意。
[0024]在本發(fā)明實施例中，采用的儀器為全自動生化分析儀(SYNCHRON CX4PR0)、Shimadzu CL-8000全自動生化分析儀、分光光度計，全自動高壓滅菌鍋(HVE-50，Hirayama) > Sigmal-15 普通離心機(Sigma 公司)、微量移液器(10 u L>200 u L> 1000 u L) >渦旋振蕩器、恒溫水浴鍋、低溫冰柜(海爾電器)>725型超低溫冰柜(Themo Forms公司)、梅特勒-托利多XK3123(METTLER TOLEDO)大動物天平等。
[0025]在本發(fā)明實施例中，誘導糖尿病模型的建立方法詳述如下:
[0026](1)體重和體重指數(shù)(BMI)檢查
[0027]在本發(fā)明實施例中，兩年試驗期，60只動物每日觀察一般狀況及飼料消耗情況；于高脂飼料誘導前，誘導后每月測定體重和體長變化。以體重除以體長平方計算BMI。本次試驗中采用人肥胖分級來診斷猴:偏瘦(BMI ( 18.5)、正常范圍(BMI:18.5-25)、偏胖(BMI:25-30)、肥胖(BMI ≥ 30)。
[0028](2)空腹血糖(FPG)、空腹血漿胰島素(FPI)和糖化血紅蛋白檢查
[0029]在本發(fā)明實施例中，60只動物于高脂飼料誘導前I次，誘導后第2月、3月、5月、7月、10月、11月、12月、15月、16月、18月、19月、20月、22月、24月于禁食后16小時后肢股靜脈采血，分析空腹血糖和空腹血漿胰島素水平；于高脂飼料誘導24月檢測HbAlc。
[0030]在本發(fā)明實施例中，空腹血糖(FPG)檢測采用貝克曼庫爾勒全自動生化分析儀(SYNCHRON CX4PR0)測定血糖，測定用血不抗凝，測定方法為過氧化酶終點法。
[0031]在本發(fā)明實施例中，空腹血漿胰島素(FPI)檢測采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法。
[0032]①自備物品:酶標儀提前預熱，微量加液器及吸頭、EP管、蒸餾水和濾紙。
[0033]②樣品處理:全血標本于室溫放置2小時后1000 Xg離心20分鐘，取上清，蒸餾水稀釋10倍待測。
[0034]③操作步驟:
[0035]a.96孔板分別設空白孔、標準孔和待測樣品孔，分別加入IOOyl樣品稀釋液、標準品和待測樣品，加覆膜37°C溫育2小時；
[0036]b.棄去上清，甩干，每孔加檢測液A工作液lOOiU，加覆膜37°C溫育I小時；
[0037]c.棄去上清，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約每孔400 U 1，甩干；
[0038]d.每孔加檢測液B工作液100 U 1，加覆膜37°C溫育I小時；
[0039]e.棄去上清，甩干，洗板5次，同步驟c ；
[0040]f.每孔加底物溶液90 U 1，加覆膜37°C避光顯色15-30分鐘，當標準孔的前3_4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔梯度不明顯時即可終止；
[0041 ] g.每孔加終止溶液50 ill，此時藍色立刻轉變成黃色，反應終止；
[0042]h.立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的OD值。
[0043]④計算方法:取標準品OD值扣除空白孔OD值后作七點圖，以標準品的濃度為縱坐標(對數(shù)坐標)，OD值為橫坐標(對數(shù)坐標)用curve expertl.3繪制標準曲線；以標準品的濃度與OD值計算標準曲線的回歸方程，將樣品OD值代入方程式，計算樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)得樣品實際濃度。
[0044]在本發(fā)明實施例中，糖化血紅蛋白(HbAlc)檢測中采用Shimadzu CL_8000fullself-biochemical測定,測定用血用肝素鈉抗凝。
[0045](3)靜脈注射葡萄糖耐受試驗[0046]在本發(fā)明實施例中，高脂飼料誘導后24月，60只動物進行靜脈注射葡萄糖耐受試驗(IVGTT)診斷糖耐量損傷(IGT)。以每千克體重0.5ml服用50 %右旋葡萄糖，使最終劑量達到每千克體重0.25g葡萄糖。先在基線水平檢測血糖水平，然后在空腹16小時以后靜脈注射葡萄糖分別在1、5、10、15、20和60分鐘測定血糖水平。用以下公式計算葡萄糖清除率(Ke):KG = In(5分鐘血糖水平)-1n(20分鐘血糖水平)/15分鐘100%。[0047]在本發(fā)明實施例中，采用IVGTT試驗分析餐后胰島素分泌敏感性。高脂飼料誘導后24月，挑選6只FPG正常，2只處于IFG或IGT階段和I只顯性糖尿病階段猴進行。檢測時間點為:先在基線水平檢測胰島素水平，然后在空腹16小時以后靜脈注射葡萄糖(方式同前)分別在1、3、5、7、10、15、30、45和60分鐘測定胰島素。血漿胰島素(FPI)檢測采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法。
[0048]在本發(fā)明實施例中，在16小時空腹即將結束之前給猴子提供含0.33g/ml葡萄糖的飲料。飲料量以猴子體重來計算供給，猴子只有在20分鐘之內喝掉90%的量算試驗成功，共服用葡萄糖量大約為每千克體重2g，實際消耗量需經(jīng)計算。撤走飲料2小時后，采集血液檢查2小時胰島素和血糖水平。
[0049]在本發(fā)明實施例中，采用美國糖尿病學會(ADA)和WH02006年糖尿病診斷標準，具體診斷標準為:
[0050]a.典型糖尿病癥狀(多尿、多飲和不能解釋的體重下降)，任意血糖≤11.1mmol/L或空腹血糖(FPG)≤7.0mmoI/L,為糖尿??；
[0051]b.空腹血糖(FPG) < 6.llmmol/L 并且餐后 2h 血糖(2hPG) < 7.77mmol/L,為正常；
[0052]c.餐后 2h 血糖(2hPG) > 1.77臟01/1，但< 11.lmmol/L 時為糖耐量損傷(IGT)；
[0053]d.空腹血糖(FPG)≤6.11臟01/1，但< 6.99mmo/L時為空腹血糖損傷。
[0054]在本發(fā)明實施例中，所有數(shù)據(jù)都采用均值土標準差顯示。正態(tài)分布的數(shù)據(jù)經(jīng)過Tukey-Kramer多重比較檢驗，差異采用單因素方差分析(ANOVA)進行評估。正態(tài)分布數(shù)據(jù)各組間的差異則采用Kruskal-Wallis非參數(shù)檢驗。所有數(shù)據(jù)分析都采用NCSS2000軟件(NCSS, Kaysvil I e，UT)，所有分析P值小于0.05都認為差異無統(tǒng)計學意義。
[0055]⑷結果分析
[0056]本發(fā)明實施例結果為:50只猴采食含22%脂肪飼料24月，8只發(fā)展成顯性糖尿病，26只猴表現(xiàn)為糖耐量損傷或空腹血糖受損，16只猴表現(xiàn)為空服血糖水平正常；10只喂食含3%脂肪的猴標準飼料24月，空服血糖水平正常。恒河猴川西亞種糖耐量損傷和2型糖尿病發(fā)病早期階段特征表現(xiàn)為肥胖，F(xiàn)PI代償性增加，餐后葡萄糖清除速度(KGluc5-20)顯著降低，餐后胰島素分泌敏感性下降，第一時相胰島素分泌減少，第二時相胰島素分泌延遲；HbAlc隨著血糖水平增加而上升；慢性高血糖晚期猴表現(xiàn)為瘦弱、多尿多飲,空腹血糖可大于10mmol/l，HbAlc水平可達8.9%,FPI顯著降低,餐后半小時胰島素分泌增加后迅速降低。HbAlc在4.5-5%之間有發(fā)展成2型糖尿病的高風險可能。
[0057]本發(fā)明實施例采用長期(2年期)膳食誘導糖尿病的模型建立，符合人類糖尿病發(fā)展的長期緩慢進程及由此引起的全身機體變化，且成模后更安全穩(wěn)定，進行相關研究具有更強的科學性。選用的獼猴川西亞種在四川西部廣泛分布，且具有品系純正，和體型小型化特點，可面向國際國內提供動物模型。[0058]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本【技術領域】的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以作出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。
【權利要求】
1.一種誘導糖尿病模型的建立方法，其特征在于，所述方法包括: 實驗動物總量的5/6只雄性猴，年齡7-20歲，采食猴高脂飼料，主要成份為18%蛋白質，60%糖類，22%脂肪；實驗動物總量的1/6只雄性猴，年齡4-10歲，喂食猴標準飼料，主要成份為18%蛋白質，69%糖類,3%脂肪。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括: 試驗監(jiān)測周期為2年，每日上午自由攝取實驗猴飼料250g，下午4點給予I個蘋果或等量蔬菜。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法還包括: 兩年試驗期，所有實驗動物每日觀察一般狀況及飼料消耗情況，并于高脂飼料誘導前、后每月測定體重和體長變化。
4. 如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法還包括: 所有實驗動物于高脂飼料誘導前I次，誘導后第2月、3月、5月、7月、10月、11月、12月、15月、16月、18月、19月、20月、22月、24月于禁食后16小時后肢股靜脈采血，分析空腹血糖和空腹血漿胰島素水平，并于高脂飼料誘導24月檢測糖化血紅蛋白。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法還包括: 高脂飼料誘導后24月，所有實驗動物進行靜脈注射葡萄糖耐受試驗診斷糖耐量損傷。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法還包括: 采用美國糖尿病學會和WH02006年糖尿病診斷標準。
7.如權利要求1-6所述的方法，其特征在于，所述實驗動物選用國家實驗用獼猴種源基地的獼猴川西亞種。
【文檔編號】A01K67/02GK103478071SQ201310275715
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年6月28日 優(yōu)先權日:2013年6月28日
【發(fā)明者】羅啟慧, 陳正禮, 曾文, 程安春, 龔立, 畢鳳君, 曾利才 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學