殺蟲基因及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種殺蟲基因及其用途，所述殺蟲基因的核苷酸序列包括：（a）具有SEQ?ID?NO:3所示的核苷酸序列；或（b）與（a）的核苷酸序列同類編碼，且不為SEQ?ID?NO:22；或（c）在嚴(yán)格條件下與（a）或（b）限定的核苷酸序列雜交且編碼具有殺蟲活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。本發(fā)明殺蟲基因特別適合在單子葉植物中表達(dá)，顯著提高了Vip3Aa-01殺蟲蛋白的表達(dá)量、穩(wěn)定性和毒力；同時本發(fā)明通過植物體內(nèi)產(chǎn)生能夠殺死大螟的Vip3A蛋白來控制大螟害蟲，對植物進(jìn)行全生育期、全植株的保護(hù)以防治大螟害蟲的侵害，且無污染、無殘留，效果穩(wěn)定、徹底，簡單、方便、經(jīng)濟(jì)。
【專利說明】殺蟲基因及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種殺蟲基因及其用途，特別是涉及一種改造的Vip3Aa-01殺蟲基因及Vip3A蛋白質(zhì)控制大螟害蟲的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]玉米和水稻是中國重要的糧食作物，每年因植物蟲害造成的糧食損失巨大,例如小地老虎、大螟等,更甚者影響到當(dāng)?shù)厝丝诘纳鏍顩r。大螟(Sesamia inferens)屬鱗翅目夜蛾科，為雜食性害蟲，除為害玉米外，還為害水稻、甘蔗、高梁等禾本科作物，廣泛分布于我國中部與東南部，特別是陜西、河南以南的大部稻區(qū)。大螟幼蟲蛀入作物莖內(nèi)為害，可造成枯心苗或整株死亡，其蛀孔一般較大，并有大量蟲糞排出莖外，以低洼地及麥套玉米地發(fā)生重，且夏玉米發(fā)生重于春玉米。為了防治大螟，人們通常采用的主要防治方法有:農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治和生物防治。
[0003]農(nóng)業(yè)防治是把整個農(nóng)田生態(tài)系多因素的綜合協(xié)調(diào)管理，調(diào)控作物、害蟲、環(huán)境因素、創(chuàng)造一個有利于作物生長而不利于大螟發(fā)生的農(nóng)田生態(tài)環(huán)境。如利用處理大螟越冬寄主、改革耕作制度、種 植抗大螟品種、種植誘集田和間作等措施降低大螟的危害。因農(nóng)業(yè)防治必須服從作物布局和增產(chǎn)的要求，應(yīng)用有一定的局限性，不能作為應(yīng)急措施，在大螟爆發(fā)時就顯得無能為力。
[0004]化學(xué)防治即農(nóng)藥防治，是利用化學(xué)殺蟲劑來殺滅害蟲，是大螟綜合治理的重要組成部分，它具有快速、方便、簡便和高經(jīng)濟(jì)效益的特點(diǎn)，特別是大螟大發(fā)生的情況下，是必不可少的應(yīng)急措施，它可以在大螟造成危害前將其消滅。目前化學(xué)防治方法主要有顆粒劑、撒毒土、藥液噴霧、封垛熏蒸秸桿垛內(nèi)越冬成蟲等。但化學(xué)防治也有其局限性，如使用不當(dāng)往往會導(dǎo)致農(nóng)作物發(fā)生藥害、害蟲產(chǎn)生抗藥性，以及殺傷天敵、污染環(huán)境，使農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)遭到破壞和農(nóng)藥殘留對人、畜的安全構(gòu)成威脅等不良后果。
[0005]生物防治是利用某些有益生物或生物代謝產(chǎn)物來控制害蟲種群數(shù)量，以達(dá)到降低或消滅害蟲的目的。其特點(diǎn)是對人、畜安全，對環(huán)境污染少，對某些害蟲可達(dá)到長期控制的目的；但是效果常不穩(wěn)定，并且不論大螟發(fā)生輕重均需同樣投資進(jìn)行。
[0006]為了解決農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治和生物防治在實(shí)際應(yīng)用中的局限性，科學(xué)家們經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)將編碼殺蟲蛋白的抗蟲基因轉(zhuǎn)入植物中，可獲得一些抗蟲轉(zhuǎn)基因植物以防治植物蟲害。Vip3A殺蟲蛋白是眾多殺蟲蛋白中的一種，是由蠟狀芽孢桿菌產(chǎn)生的特異性蛋白質(zhì)。
[0007]Vip3A蛋白通過激發(fā)凋亡類型的細(xì)胞程序性死亡對敏感性昆蟲具有毒殺效應(yīng)。Vip3A蛋白在昆蟲腸道內(nèi)被水解為4種主要蛋白產(chǎn)物，其中只有一種蛋白水解產(chǎn)物(33KD)為Vip3A蛋白的毒性核心結(jié)構(gòu)。Vip3A蛋白結(jié)合敏感昆蟲的中腸上皮細(xì)胞，啟動細(xì)胞程序性死亡，造成中腸上皮細(xì)胞的溶解導(dǎo)致昆蟲死亡。對非敏感昆蟲不產(chǎn)生任何病癥，不會導(dǎo)致中腸上皮細(xì)胞的凋亡和溶解。
[0008]已證明Vip3A蛋白可以抵擋小地老虎、草地貪夜蛾、玉米夜蛾等多種鱗翅目昆蟲害蟲侵害，且目前鮮有依據(jù)植物的偏好密碼子對Vip3A殺蟲蛋白的氨基酸和/或核苷酸序列進(jìn)行改造的研究，尤其是針對單子葉植物(如玉米)以提高其在植物中的表達(dá)水平和效果；同時至今尚無關(guān)于通過產(chǎn)生表達(dá)Vip3A蛋白的轉(zhuǎn)基因植株來控制大螟對植物危害的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的是提供一種殺蟲基因及其用途，其是依據(jù)玉米的偏好密碼子而進(jìn)行的優(yōu)化改造，使得Vip3Aa-01殺蟲蛋白在植物中(尤其為玉米和水稻)具有較高的表達(dá)量和毒力，同時表達(dá)Vip3A蛋白的轉(zhuǎn)基因植株具有控制大螟害蟲的用途，有效克服現(xiàn)有技術(shù)農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治和生物防治等技術(shù)缺陷。
[0010]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種殺蟲基因，其核苷酸序列包括:
[0011](a)具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；或
[0012](b)與(a)的核苷酸序列同類編碼，且不為SEQ ID NO: 22 ;或
[0013](c)在嚴(yán)格條件下與(a)或(b)限定的核苷酸序列雜交且編碼具有殺蟲活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
[0014]所述嚴(yán)格條件可為在6 X SSC (檸檬酸鈉)、0.5%SDS (十二烷基硫酸鈉)溶液中，在65°C下雜交，然后用2XSSC、0.1%SDS和I X SSC,0.1%SDS各洗膜I次。
[0015]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種表達(dá)盒，包含在有效連接的調(diào)控序列調(diào)控下的所述殺蟲基因。
[0016]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種包含所述殺蟲基因或所述表達(dá)盒的重組載體。
[0017]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種包含所述殺蟲基因或所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因宿主生物，包括植物細(xì)胞、動物細(xì)胞、細(xì)菌、酵母、桿狀病毒、線蟲或藻類。
[0018]進(jìn)一步地，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。
[0019]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生殺蟲蛋白質(zhì)的方法，包括:
[0020]獲得所述轉(zhuǎn)基因宿主生物的細(xì)胞；
[0021]在允許產(chǎn)生殺蟲蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)基因宿主生物的細(xì)胞；
[0022]回收所述殺蟲蛋白質(zhì)。
[0023]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種用于增加昆蟲靶范圍的方法，包括:將所述殺蟲基因編碼的殺蟲蛋白質(zhì)或所述表達(dá)盒編碼的殺蟲蛋白質(zhì)在植物中與至少一種不同于所述殺蟲基因編碼的殺蟲蛋白質(zhì)或所述表達(dá)盒編碼的殺蟲蛋白質(zhì)的第二種殺蟲核苷酸一起表達(dá)。
[0024]進(jìn)一步地，所述第二種殺蟲核苷酸可以編碼Cry類殺蟲蛋白質(zhì)、Vip類殺蟲蛋白質(zhì)、蛋白酶抑制劑、凝集素、α-淀粉酶或過氧化物酶。
[0025]可選擇地，所述第二種殺蟲核苷酸為抑制目標(biāo)昆蟲害蟲中重要基因的dsRNA。
[0026]在本發(fā)明中，Vip3Aa-01殺蟲蛋白在一種轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)可以伴隨著一個或多個Cry類殺蟲蛋白質(zhì)和/或Vip類殺蟲蛋白質(zhì)的表達(dá)。這種超過一種的殺蟲毒素在同一株轉(zhuǎn)基因植物中共同表達(dá)可以通過遺傳工程使植物包含并表達(dá)所需的基因來實(shí)現(xiàn)。另外，一種植物(第I親本)可以通過遺傳工程操作表達(dá)Vip3Aa-01殺蟲蛋白，第二種植物(第2親本)可以通過遺傳工程操作表達(dá)Cry類殺蟲蛋白質(zhì)和/或Vip類殺蟲蛋白質(zhì)。通過第I親本和第2親本雜交獲得表達(dá)引入第I親本和第2親本的所有基因的后代植物。
[0027]RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-stranded RNA, dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。因此可以使用RNAi技術(shù)特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)。
[0028]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生抗蟲植物的方法，包括:將所述殺蟲基因或所述表達(dá)盒或所述重組載體導(dǎo)入植物。
[0029]優(yōu)選地，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。
[0030]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種用于保護(hù)植物免受由昆蟲害蟲引起的損傷的方法，包括:將所述殺蟲基因或所述表達(dá)盒或所述重組載體導(dǎo)入植物，使導(dǎo)入后的植物產(chǎn)生足夠保護(hù)其免受昆蟲害蟲侵害量的殺蟲蛋白質(zhì)。
[0031 ] 優(yōu)選地，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。
[0032]將所述的殺蟲基因或所述的表達(dá)盒或所述的重組載體導(dǎo)入植物，在本發(fā)明中為將外源DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞，常規(guī)轉(zhuǎn)化方法包括但不限于，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、微量發(fā)射轟擊、直接將DNA攝入原生質(zhì)體、電穿孔或晶須硅介導(dǎo)的DNA導(dǎo)入。
[0033]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種控制昆蟲害蟲的方法，包括:使昆蟲害蟲與抑制量的由所述殺蟲基因編 碼的昆蟲抑制性蛋白接觸。
[0034]優(yōu)選地，所述昆蟲害蟲是鱗翅目昆蟲害蟲。
[0035]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種由所述殺蟲基因編碼的昆蟲抑制性蛋白質(zhì)控制昆蟲害蟲的用途。
[0036]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種控制大螟害蟲的方法，包括將大螟害蟲與Vip3A蛋白接觸。
[0037]優(yōu)選地,所述Vip3A蛋白為Vip3Aa蛋白。
[0038]進(jìn)一步地,所述Vip3Aa蛋白存在于產(chǎn)生所述Vip3Aa蛋白的植物細(xì)胞中,所述大螟害蟲通過攝食所述植物細(xì)胞與所述Vip3Aa蛋白接觸。
[0039]更進(jìn)一步地,所述Vip3Aa蛋白存在于產(chǎn)生所述Vip3Aa蛋白的轉(zhuǎn)基因植物中,所述大螟害蟲通過攝食所述轉(zhuǎn)基因植物的組織與所述Vip3Aa蛋白接觸，接觸后所述大螟害蟲生長受到抑制并最終導(dǎo)致死亡，以實(shí)現(xiàn)對大螟危害植物的控制。
[0040]所述轉(zhuǎn)基因植物可以處于任意生育期。
[0041]所述轉(zhuǎn)基因植物的組織可以來自葉片、莖桿、雄穗、雌穗、花藥或花絲。
[0042]所述對大螟危害植物的控制不因種植地點(diǎn)的改變而改變。
[0043]所述對大螟危害植物的控制不因種植時間的改變而改變。
[0044]所述植物可以來自玉米、水稻、高粱、麥、粟、棉花、蘆葦、甘蔗、茭白、蠶豆或油菜。
[0045]所述接觸步驟之前的步驟為種植含有編碼所述Vip3Aa蛋白的多核苷酸的植物。
[0046]優(yōu)選地，所述Vip3Aa蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列。所述Vip3Aa蛋白的核苷酸序列具有SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列。
[0047]在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述植物還可以產(chǎn)生至少一種不同于所述Vip3Aa蛋白的第二種核苷酸。
[0048]進(jìn)一步地,所述第二種核苷酸可以編碼Cry類殺蟲蛋白質(zhì)、Vip類殺蟲蛋白質(zhì)、蛋白酶抑制劑、凝集素、α-淀粉酶或過氧化物酶。
[0049]優(yōu)選地,所述第二種核苷酸可以編碼CrylAb蛋白、CrylFa蛋白或CrylBa蛋白。
[0050]更進(jìn)一步地，所述第二種核苷酸包括SEQ ID Ν0:5或SEQ ID Ν0:6所示的核苷酸序列。
[0051]可選擇地，所述第二種核苷酸為抑制目標(biāo)昆蟲害蟲中重要基因的dsRNA。
[0052]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種Vip3A蛋白質(zhì)控制大螟害蟲的用途。
[0053]大螟(Sesamiainferens)與草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、小地老虎(Agrotis ypsilon Rottemberg)同屬鱗翅目夜蛾科,為雜食性害蟲,但明顯嗜好禾本科,最常為害玉米、水稻、高粱、甘蔗等。盡管如此，大螟與草地貪夜蛾、小地老虎在生物學(xué)上是清晰的、截然不同的物種，至少存在以下主要區(qū)別:
[0054]1、分布區(qū)域不同。大螟廣泛分布于我國中部與東南部，特別是陜西、河南以南的大部稻區(qū)及西南玉米產(chǎn)區(qū)；除中國外，大螟在東南亞種植水稻、玉米及甘蔗的國家也有分布，包括越南、老撾、印度等。而草地貪夜蛾主要分布在境外，包括美洲的加拿大、墨西哥、美國、阿根廷、玻利維亞、巴西、智利、哥倫比亞、厄瓜多爾、法屬圭亞那、圭亞那、巴拉圭、秘魯、蘇里南、烏拉圭、委內(nèi)瑞拉及整個中美洲和加勒比海地區(qū)，在中國未見有草地貪夜蛾存在的報道。而小地老虎是世界性的害蟲，在我國各地也均有分布，尤以雨量豐富、氣候濕潤的長江流域和東南沿海發(fā)生量大，東北地區(qū)多發(fā)生在東部和南部濕潤地區(qū)。
[0055]2、為害習(xí)性不同。大螟屬鉆蛀性害蟲，幼蟲蛀入作物莖內(nèi)為害，可造成枯心苗或整株死亡，其蛀孔一般較大，并 有大量蟲糞排出莖外，多夾在葉鞘和莖桿之間，受害后的葉片、葉鞘部都變?yōu)辄S色；剛孵化出的幼蟲，不分散，群集葉鞘內(nèi)側(cè)，蛀食葉鞘和幼莖；幼蟲3齡以后，分散遷害鄰株，可轉(zhuǎn)害5-6株不等，此時是大螟的嚴(yán)重為害期，早春10°C以上的溫度來得早，則大螟發(fā)生早；靠近村莊的低洼地及麥套玉米地發(fā)生重；春玉米發(fā)生偏輕，夏玉米發(fā)生較重。而草地貪夜蛾幼蟲取食葉片可造成落葉，其后轉(zhuǎn)移為害；有時大量幼蟲以切根方式為害，切斷種苗和幼小植株的莖；在大一些的作物上，如玉米穗，幼蟲可鉆入為害；取食玉米葉時，留有大量孔；低齡幼蟲取食后，葉脈成窗紗狀；老齡幼蟲同切根蟲一樣，可將30日齡的幼苗沿基部切斷；種群數(shù)量大時，幼蟲如行軍狀，成群擴(kuò)散；環(huán)境有利時，常留在雜草中。而小地老虎屬地下害蟲，1-2齡幼蟲晝夜均可群集于幼苗頂心嫩葉處取食危害；3齡后分散，幼蟲行動敏捷、有假死習(xí)性、對光線極為敏感、受到驚擾即卷縮成團(tuán)，白天潛伏于表土的干濕層之間，夜晚出土從地面將幼苗植株咬斷拖入土穴、或咬食未出土的種子，幼苗主莖硬化后改食嫩葉和葉片及生長點(diǎn)，食物不足或?qū)ふ以蕉瑘鏊鶗r，有遷移現(xiàn)象；高齡幼蟲剪苗率高，取食量大。
[0056]3、形態(tài)特征不同。
[0057]I)卵形態(tài)不同:大螟的卵扁圓形，初白色后變灰黃色，表面具細(xì)縱紋和橫線，聚生或散生，常排成2-3行；而草地貪夜蛾的卵半球形，卵塊聚產(chǎn)在葉片表面，每卵塊含卵100-300粒，有時成Z層，卵塊表面有雌蟲腹部灰色毛形成的帶狀保護(hù)層；而小地老虎的卵成饅頭形，具縱橫隆線，初產(chǎn)乳白色，漸變黃色，孵化前卵一頂端具黑點(diǎn)。
[0058]2)幼蟲形態(tài)不同:大螟末齡幼蟲體長約30mm，粗4頭紅褐色至暗褐色，腹部背面淡紫紅色，共5-7齡；而草地貪夜蛾幼蟲初孵時全身綠色，具黑線和斑點(diǎn)；生長時，仍保持綠色或成為淺黃色，并具黑色背中線和氣門線；如密集時(種群密度大，食物短缺時)，末齡幼蟲在遷移期幾乎為黑色；老熟幼蟲體長35-40_，在頭部具黃色倒Y型斑，黑色背毛片著生原生剛毛(每節(jié)背中線兩側(cè)有2根剛毛);腹部末節(jié)有呈正方形排列的4個黑斑；幼蟲有6個齡期，偶為5個；而小地老虎幼蟲圓筒形，老熟幼蟲體長37-50_，頭部褐色，具黑褐色不規(guī)則網(wǎng)紋，體灰褐至暗褐色，體表粗糙、布大小不一而彼此分離的顆粒，背線、亞背線及氣門線均黑褐色，前胸背板暗褐色，黃褐色臀板上具兩條明顯的深褐色縱帶，胸足與腹足黃褐色。
[0059]3)蛹形態(tài)不同:大螟的蛹長13-18mm，粗壯，紅褐色，腹部具灰白色粉狀物，臀棘有3根鉤棘；而草地貪夜蛾蛹棕色，有光澤，長18-20_;而小地老虎的蛹長18-24_，赤褐有光，口器與翅芽末端相齊，均伸達(dá)第4腹節(jié)后緣，腹部第4-7節(jié)背面前緣中央深褐色，且有粗大的刻點(diǎn)，兩側(cè)的細(xì)小刻點(diǎn)延伸至氣門附近，第5-7節(jié)腹面前緣也有細(xì)小刻點(diǎn)，腹末端具短臀棘I對。
[0060]4)成蟲形態(tài)不同:大螟成蟲雌蛾體長15mm，翅展約30mm，頭部、胸部淺黃褐色，腹部淺黃色至灰白色；觸角絲狀，前翅近長方形，淺灰褐色，中間具小黑點(diǎn)4個排成四角形；雄蛾體長約12mm，翅展27mm，觸角櫛齒狀；而草地貪夜蛾成蟲粗壯，灰棕色，翅展32_38mm ；雌蟲前翅灰色至灰棕色，但雄蟲前翅更黑，具黑斑和淺色暗紋；后翅白色，后翅翅脈棕色并透明；微蟲外生殖器抱握瓣正方形，抱器末端地抱器緣刻缺；雌蟲交配囊無交配片；而小地老虎成蟲體長17-23mm、翅展40_54mm，頭、胸部背面暗褐色，足褐色，前足脛、跗節(jié)外緣灰褐色，中后足各節(jié)末端有灰褐色環(huán)紋，前翅褐色，前緣區(qū)黑褐色，外緣以內(nèi)多暗褐色，基線淺褐色，黑色波浪形內(nèi)橫線雙線，黑色環(huán)紋內(nèi)有一圓灰斑，腎狀紋黑色具黑邊、其外中部有一楔形黑紋伸至外橫線，中橫線暗褐色波浪形，雙線波浪形外橫線褐色，不規(guī)則鋸齒形亞外緣線灰色、其內(nèi)緣在中脈間有三個尖齒，亞外緣線與外橫線間在各脈上有小黑點(diǎn)，外緣線黑色，外橫線與亞外緣線間淡褐色，亞外緣線以外黑褐色，后翅灰白色，縱脈及緣線褐色，腹部背面灰色。
[0061]4、生長習(xí)性和發(fā)生規(guī)律不同。大螟一年發(fā)生2-4代，隨海拔的升高而減少，隨溫度的升高而增加。如云貴高原年 生2-3代，江蘇、浙江年生3-4代，江西、湖南、湖北、四川年生4代，福建、廣西及云南開遠(yuǎn)年生4-5代，廣東南部、臺灣年生6-8代。在溫帶以老熟幼蟲在寄生殘體(如茭白、水稻等作物莖桿或根茬)內(nèi)或近地面的土壤中越冬，次年3月中旬(氣溫高于10°C)開始化蛹，15°C時羽化，4月上旬交尾產(chǎn)卵，3-5天達(dá)高峰期，4月下旬為孵化高峰期。成蟲白天潛伏，常棲息在株間，傍晚開始活動，趨光性較弱，壽命5天左右。雌蛾交尾后2-3天開始產(chǎn)卵，3-5天達(dá)高峰期，喜在玉米苗上和地邊產(chǎn)卵，多集中在玉米莖桿較細(xì)、葉鞘抱合不緊的植株靠近地面的第2節(jié)和第3節(jié)葉鞘的內(nèi)側(cè)，可占產(chǎn)卵量的80%以上。每雌可產(chǎn)卵240粒，卵歷期一代為12天，2、3代為5-6天；幼蟲期一代約30天，二代約28天，三代約32天；蛹期為10-15天。雌蛾飛翔力弱，產(chǎn)卵較集中，靠近蟲源的地方，蟲口密度大，為害重。而草地貪夜蛾成蟲可以遷飛，能自行擴(kuò)散相當(dāng)距離，蔬菜或水果夾帶幼蟲是重要的國際間傳播方式。而小地老虎一年發(fā)生3-4代，老熟幼蟲或蛹在土內(nèi)越冬；早春3月上旬成蟲開始出現(xiàn)，一般在3月中下旬和4月上中旬會出現(xiàn)兩個發(fā)蛾盛期；成蟲白天不活動，傍晚至前半夜活動最盛，喜歡吃酸、甜、酒味的發(fā)酵物和各種花蜜，并有趨光性，幼蟲共分6齡，1、2齡幼蟲先躲伏在雜革或植株的心葉里，晝夜取食，這時食量很小，為害也不十分顯著；3齡后白天躲到表土下，夜間出來為害；5、6齡幼蟲食量大增，每條幼蟲一夜能咬斷菜苗4-5株，多的達(dá)10株以上；幼蟲3齡后對藥劑的抵抗力顯著增加；3月底到4月中旬是第I代幼蟲危害的嚴(yán)重時期；發(fā)生世代從10月到第2年4月都見發(fā)生和危害；西北地區(qū)二到三代，長城以北一般年二到三代，長城以南黃河以北年三代，黃河以南至長江沿岸年四代，長江以南年四到五代，南亞熱帶地區(qū)年六至七代；無論年發(fā)生代數(shù)多少，在生產(chǎn)上造成嚴(yán)重危害的均為第一代幼蟲；南方越冬代成蟲二月份出現(xiàn)，全國大部分地區(qū)羽化盛期在3月下旬至4月上、中旬，寧夏、內(nèi)蒙古為4月下旬；小地老虎成蟲多在下午3時至晚上10時羽化，白天潛伏于雜物及縫隙等處，黃昏后開始飛翔、覓食，3-4天后交配、產(chǎn)卵；卵散產(chǎn)于低矮葉密的雜草和幼苗上、少數(shù)產(chǎn)于枯葉、土縫中，近地面處落卵最多，每雌產(chǎn)卵800-1000粒、多達(dá)2000粒；卵期約5天左右，幼蟲6齡、個別7-8齡，幼蟲期在各地相差很大，但第一代約為30-40天；幼蟲老熟后在深約5cm土室中化蛹，蛹期約9-19天；高溫對小地老虎的發(fā)育與繁殖不利，因而夏季發(fā)生數(shù)量較少，適宜生存溫度為15°C -25°C ;冬季溫度過低，小地老虎幼蟲的死亡率增高；凡地勢低濕，雨量充沛的地方，發(fā)生較多；頭年秋雨多、土壤濕度大、雜草叢生有利于成蟲產(chǎn)卵和幼蟲取食活動，是第二年大發(fā)生的預(yù)兆；但降水過多，濕度過大，不利于幼蟲發(fā)育，初齡幼蟲淹水后很易死亡；成蟲產(chǎn)卵盛期土壤含水量在15-20%的地區(qū)危害較重；沙壤土，易透水、排水迅速，適于小地老虎繁殖，而重黏土和沙土則發(fā)生較輕。
[0062]綜合上述，可確定大螟與草地貪夜蛾、小地老虎是不同的害蟲，且親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，相互間無法交配產(chǎn)生后代。
[0063]本發(fā)明中所述的植物、植物組織或植物細(xì)胞的基因組，是指植物、植物組織或植物細(xì)胞內(nèi)的任何遺傳物質(zhì)，且包括細(xì)胞核和質(zhì)體和線粒體基因組。
[0064]本發(fā)明中所述的多核苷酸和/或核苷酸形成完整“基因”，在所需宿主細(xì)胞中編碼蛋白質(zhì)或多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易認(rèn)識到，可以將本發(fā)明的多核苷酸和/或核苷酸置于目的宿主中的調(diào)控序列控制下。
[0065]本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，DNA典型的以雙鏈形式存在。在這種排列中，一條鏈與另一條鏈互補(bǔ)，反之亦然。由 于DNA在植物中復(fù)制產(chǎn)生了 DNA的其它互補(bǔ)鏈。這樣，本發(fā)明包括對序列表中示例的多核苷酸及其互補(bǔ)鏈的使用。本領(lǐng)域常使用的“編碼鏈”指與反義鏈結(jié)合的鏈。為了在體內(nèi)表達(dá)蛋白質(zhì)，典型將DNA的一條鏈轉(zhuǎn)錄為一條mRNA的互補(bǔ)鏈，它作為模板翻譯出蛋白質(zhì)。mRNA實(shí)際上是從DNA的“反義”鏈轉(zhuǎn)錄的?！坝辛x”或“編碼”鏈有一系列密碼子(密碼子是三個核苷酸，一次讀三個可以產(chǎn)生特定氨基酸)，其可作為開放閱讀框(ORF)閱讀來形成目的蛋白質(zhì)或肽。本發(fā)明還包括與示例的DNA有相當(dāng)功能的RNA和PNA (肽核酸)。
[0066]本發(fā)明中核酸分子或其片段在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明殺蟲基因雜交。任何常規(guī)的核酸雜交或擴(kuò)增方法都可以用于鑒定本發(fā)明殺蟲基因的存在。核酸分子或其片段在一定情況下能夠與其他核酸分子進(jìn)行特異性雜交。本發(fā)明中，如果兩個核酸分子能形成反平行的雙鏈核酸結(jié)構(gòu)，就可以說這兩個核酸分子彼此間能夠進(jìn)行特異性雜交。如果兩個核酸分子顯示出完全的互補(bǔ)性，則稱其中一個核酸分子是另一個核酸分子的“互補(bǔ)物”。本發(fā)明中，當(dāng)一個核酸分子的每一個核苷酸都與另一個核酸分子的對應(yīng)核苷酸互補(bǔ)時，則稱這兩個核酸分子顯示出“完全互補(bǔ)性”。如果兩個核酸分子能夠以足夠的穩(wěn)定性相互雜交從而使它們在至少常規(guī)的“低度嚴(yán)格”條件下退火且彼此結(jié)合，則稱這兩個核酸分子為“最低程度互補(bǔ)”。類似地，如果兩個核酸分子能夠以足夠的穩(wěn)定性相互雜交從而使它們在常規(guī)的“高度嚴(yán)格”條件下退火且彼此結(jié)合，則稱這兩個核酸分子具有“互補(bǔ)性”。從完全互補(bǔ)性中偏離是可以允許的，只要這種偏離不完全阻止兩個分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)。為了使一個核酸分子能夠作為引物或探針，僅需保證其在序列上具有充分的互補(bǔ)性，以使得在所采用的特定溶劑和鹽濃度下能形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。
[0067]本發(fā)明中，基本同源的序列是一段核酸分子，該核酸分子在高度嚴(yán)格條件下能夠和相匹配的另一段核酸分子的互補(bǔ)鏈發(fā)生特異性雜交。促進(jìn)DNA雜交的適合的嚴(yán)格條件，例如，大約在45°C條件下用6.0X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)處理，然后在50°C條件下用
2.0XSSC洗滌，這些條件對本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。例如，在洗滌步驟中的鹽濃度可以選自低度嚴(yán)格條件的約2.0父55(:、501:到高度嚴(yán)格條件的約0.2\55(:、501:。此外，洗滌步驟中的溫度條件可以從低度嚴(yán)格條件的室溫約22°C，升高到高度嚴(yán)格條件的約65°C。溫度條件和鹽濃度可以都發(fā)生改變，也可以其中一個保持不變而另一個變量發(fā)生改變。優(yōu)選地，本發(fā)明所述嚴(yán)格條件可為在6XSSC、0.5%SDS溶液中，在65°C下與SEQ ID NO:1發(fā)生特異性雜交，然后用 2XSSC、0.1%SDS 和 I X SSC,0.1%SDS 各洗膜 I 次。
[0068]因此，具有抗蟲活性并在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明SEQ ID N0:3和/或SEQ ID NO:4雜交的序列包括在本發(fā)明中。這些序列與本發(fā)明序列至少大約40%-50%同源，大約60%、65%或 70% 同源，甚至至少大約 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更大的序列同源性。
[0069]當(dāng)核酸序列編碼的多肽與參照核酸序列編碼的多肽有相同的氨基酸序列時，該核酸序列與參照核酸序列是本發(fā)明所述的“同類編碼”。
[0070]本發(fā)明中所述的基因和蛋白質(zhì)不但包括特定的示例序列，還包括保存了所述特定示例的蛋白質(zhì)的殺蟲活性特征的部分和/片段(包括與全長蛋白質(zhì)相比在內(nèi)和/或末端缺失)、變體、突變體、取代物(有替代氨基酸的蛋白質(zhì))、嵌合體和融合蛋白。所述“變體”或“變異”是指編碼同一蛋白或編 碼有殺蟲活性的等價蛋白的核苷酸序列。所述“等價蛋白”是指與權(quán)利要求的蛋白具有相同或基本相同的抗小地老虎、大螟害蟲的生物活性的蛋白。
[0071]本發(fā)明中所述的DNA分子或蛋白序列的“片段”或“截短”是指涉及的原始DNA或蛋白序列(核苷酸或氨基酸)的一部分或其人工改造形式(例如適合植物表達(dá)的序列)，前述序列的長度可存在變化，但長度足以確保(編碼)蛋白質(zhì)為昆蟲毒素。
[0072]使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以修飾基因和容易的構(gòu)建基因變異體。例如，本領(lǐng)域熟知制造點(diǎn)突變的技術(shù)。又例如美國專利號5605793描述了在隨機(jī)斷裂后使用DNA重裝配產(chǎn)生其它分子多樣性的方法?？梢允褂蒙虡I(yè)化核酸內(nèi)切酶制造全長基因的片段，并且可以按照標(biāo)準(zhǔn)程序使用核酸外切酶。例如，可以使用酶諸如Bal31或定點(diǎn)誘變從這些基因的末端系統(tǒng)地切除核苷酸。還可以使用多種限制性內(nèi)切酶獲取編碼活性片段的基因?？梢允褂玫鞍酌钢苯荧@得這些毒素的活性片段。
[0073]本發(fā)明可以從B.t.分離物和/或DNA文庫衍生出等價蛋白和/或編碼這些等價蛋白的基因。有多種方法獲取本發(fā)明的殺蟲蛋白。例如，可以使用本發(fā)明公開和要求保護(hù)的殺蟲蛋白的抗體從蛋白質(zhì)混合物鑒定和分離其它蛋白。特別地，抗體可能是由蛋白最恒定和與其它B.t.蛋白最不同的蛋白部分引起的。然后可以通過免疫沉淀、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)或western印跡方法使用這些抗體專一地鑒定有特征活性的等價蛋白?？墒褂帽绢I(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)程序容易的制備本發(fā)明中公開的蛋白或等價蛋白或這類蛋白的片段的抗體。然后可以從微生物中獲得編碼這些蛋白的基因。[0074]由于遺傳密碼子的豐余性，多種不同的DNA序列可以編碼相同的氨基酸序列。產(chǎn)生這些編碼相同或基本相同的蛋白的可替代DNA序列正在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)水平內(nèi)。這些不同的DNA序列包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。所述“基本上相同的”序列是指有氨基酸取代、缺失、添加或插入但實(shí)質(zhì)上不影響殺蟲活性的序列，亦包括保留殺蟲活性的片段。
[0075]本發(fā)明中氨基酸序列的取代、缺失或添加是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，優(yōu)選這種氨基酸變化為:小的特性改變，即不顯著影響蛋白的折疊和/或活性的保守氨基酸取代；小的缺失，通常約1-30個氨基酸的缺失；小的氨基或羧基端延伸，例如氨基端延伸一個甲硫氨酸殘基；小的連接肽，例如約20-25個殘基長。
[0076]保守取代的實(shí)例是在下列氨基酸組內(nèi)發(fā)生的取代:堿性氨基酸(如精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(如谷氨酰胺、天冬酰胺)、疏水性氨基酸(如亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳香氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，以及小分子氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變特定活性的那些氨基酸取代在本領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的，并且已由，例如，N.Neurath和R.L.Hi 11在1979年紐約學(xué)術(shù)出版社(Academic Press)出版的《Protein》中進(jìn)行了描述。最常見的互換有Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thu/Ser, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 和 Asp/Gly,以及它們相反的互換。
[0077]對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言顯而易見地，這種取代可以在對分子功能起重要作用的區(qū)域之外發(fā)生，而且仍產(chǎn)生活性多肽。對于由本發(fā)明的多肽，其活性必需的并因此選擇不被取代的氨基酸殘基，可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變進(jìn)行鑒定(如參見，Cunningh am 和 Wells, 1989, Science244: 1081-1085)。后一技術(shù)是在分子中每一個帶正電荷的殘基處引入突變，檢測所得突變分子的抗蟲活性，從而確定對該分子活性而言重要的氨基酸殘基。底物-酶相互作用位點(diǎn)也可以通過其三維結(jié)構(gòu)的分析來測定，這種三維結(jié)構(gòu)可由核磁共振分析、結(jié)晶學(xué)或光親和標(biāo)記等技術(shù)測定(參見，如de Vos等，1992，Science255:306-312 ；Smith 等，1992，J.Mol.Biol224:899_904 ；fflodaver 等，1992，F(xiàn)EBSLetters309:59_64)。
[0078]在本發(fā)明中，Vip3A蛋白包括但不限于 Vip3Aal、Vip3Afl、Vip3Aall、Vip3Aal9、Vip3Ahl、Vip3Adl、Vip3Ael或Vip3Aa20蛋白，或者與上述蛋白的氨基酸序列具有至少70%同源性且對大螟具有殺蟲活性的殺蟲片段或功能區(qū)域。
[0079]因此，與序列I和/或2所示的氨基酸序列具有一定同源性的氨基酸序列也包括在本發(fā)明中。這些序列與本發(fā)明序列類似性/相同性典型的大于60%，優(yōu)選的大于75%，更優(yōu)選的大于80%，甚至更優(yōu)選的大于90%，并且可以大于95%。也可以根據(jù)更特定的相同性和/或類似性范圍定義本發(fā)明的優(yōu)選的多核苷酸和蛋白質(zhì)。例如與本發(fā)明示例的序列有49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的相同性和 / 或類似性。
[0080]本發(fā)明中所述調(diào)控序列包括但不限于啟動子、轉(zhuǎn)運(yùn)肽、終止子，增強(qiáng)子，前導(dǎo)序列，內(nèi)含子以及其它可操作地連接到所述殺蟲基因的調(diào)節(jié)序列。
[0081]所述啟動子為植物中可表達(dá)的啟動子，所述的“植物中可表達(dá)的啟動子”是指確保與其連接的編碼序列在植物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)的啟動子。植物中可表達(dá)的啟動子可為組成型啟動子。指導(dǎo)植物內(nèi)組成型表達(dá)的啟動子的示例包括但不限于，來源于花椰菜花葉病毒的35S啟動子、ubi啟動子、水稻G0S2基因的啟動子等。備選地，植物中可表達(dá)的啟動子可為組織特異的啟動子，即該啟動子在植物的一些組織內(nèi)如在綠色組織中指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)水平高于植物的其他組織(可通過常規(guī)RNA試驗(yàn)進(jìn)行測定)，如PEP羧化酶啟動子。備選地，植物中可表達(dá)的啟動子可為創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動子。創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動子或指導(dǎo)創(chuàng)傷誘導(dǎo)的表達(dá)模式的啟動子是指當(dāng)植物經(jīng)受機(jī)械或由昆蟲啃食引起的創(chuàng)傷時，啟動子調(diào)控下的編碼序列的表達(dá)較正常生長條件下有顯著提高。創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動子的示例包括但不限于，馬鈴薯和西紅柿的蛋白酶抑制基因(pin I和pin II)和玉米蛋白酶抑制基因(MPI)的啟動子。
[0082]所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽(又稱分泌信號序列或?qū)蛐蛄?是指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物到特定的細(xì)胞器或細(xì)胞區(qū)室，對受體蛋白質(zhì)來說，所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽可以是異源的，例如，利用編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列靶向葉綠體，或者利用‘KDEL’保留序列靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，或者利用大麥植物凝集素基因的CTPP靶向液泡。
[0083]所述前導(dǎo)序列包含但不限于，小RNA病毒前導(dǎo)序列，如EMCV前導(dǎo)序列(腦心肌炎病毒5’非編碼區(qū))；馬鈴薯Y病毒組前導(dǎo)序列，如MDMV (玉米矮縮花葉病毒)前導(dǎo)序列；人類免疫球蛋白質(zhì)重鏈結(jié)合蛋白質(zhì)(BiP);苜蓿花葉病毒的外殼蛋白質(zhì)mRNA的不翻譯前導(dǎo)序列(AMV RNA4);煙草花葉病毒(TMV)前導(dǎo)序列。
[0084]所述增強(qiáng)子包含但不限于，花椰菜花葉病毒(CaMV)增強(qiáng)子、玄參花葉病毒(FMV)增強(qiáng)子、康乃馨風(fēng)化環(huán)病毒(CERV)增強(qiáng)子、木薯脈花葉病毒(CsVMV)增強(qiáng)子、紫茉莉花葉病毒(MMV)增強(qiáng)子、夜香樹黃化曲葉病毒(CmYLCV)增強(qiáng)子、木爾坦棉花曲葉病毒(CLCuMV)、鴨跖草黃斑駁病毒(CoYMV)和花生褪綠線條花葉病毒(PCLSV)增強(qiáng)子。
[0085]對于單子葉植物 應(yīng)用而言，所述內(nèi)含子包含但不限于，玉米hsp70內(nèi)含子、玉米泛素內(nèi)含子、Adh內(nèi)含子1、蔗糖合酶內(nèi)含子或水稻Actl內(nèi)含子。對于雙子葉植物應(yīng)用而言，所述內(nèi)含子包含但不限于，CAT-1內(nèi)含子、pKANNIBAL內(nèi)含子、PIV2內(nèi)含子和“超級泛素”內(nèi)含子。
[0086]所述終止子可以為在植物中起作用的適合多聚腺苷酸化信號序列，包括但不限于，來源于農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂堿合成酶(NOS)基因的多聚腺苷酸化信號序列、來源于蛋白酶抑制劑II (pin II)基因的多聚腺苷酸化信號序列、來源于豌豆ssRUBISCO E9基因的多聚腺苷酸化信號序列和來源于α -微管蛋白(a -tubulin)基因的多聚腺苷酸化信號序列。
[0087]本發(fā)明中所述“有效連接”表示核酸序列的聯(lián)結(jié)，所述聯(lián)結(jié)使得一條序列可提供對相連序列來說需要的功能。在本發(fā)明中所述“有效連接”可以為將啟動子與感興趣的序列相連，使得該感興趣的序列的轉(zhuǎn)錄受到該啟動子控制和調(diào)控。當(dāng)感興趣的序列編碼蛋白并且想要獲得該蛋白的表達(dá)時“有效連接”表示:啟動子與所述序列相連，相連的方式使得得到的轉(zhuǎn)錄物高效翻譯。如果啟動子與編碼序列的連接是轉(zhuǎn)錄物融合并且想要實(shí)現(xiàn)編碼的蛋白的表達(dá)時，制造這樣的連接，使得得到的轉(zhuǎn)錄物中第一翻譯起始密碼子是編碼序列的起始密碼子。備選地，如果啟動子與編碼序列的連接是翻譯融合并且想要實(shí)現(xiàn)編碼的蛋白的表達(dá)時，制造這樣的連接，使得5’非翻譯序列中含有的第一翻譯起始密碼子與啟動子相連結(jié)，并且連接方式使得得到的翻譯產(chǎn)物與編碼想要的蛋白的翻譯開放讀碼框的關(guān)系是符合讀碼框的?？梢浴坝行нB接”的核酸序列包括但不限于:提供基因表達(dá)功能的序列(即基因表達(dá)元件，例如啟動子、5’非翻譯區(qū)域、內(nèi)含子、蛋白編碼區(qū)域、3’非翻譯區(qū)域、聚腺苷化位點(diǎn)和/或轉(zhuǎn)錄終止子)、提供DNA轉(zhuǎn)移和/或整合功能的序列(即T-DNA邊界序列、位點(diǎn)特異性重組酶識別位點(diǎn)、整合酶識別位點(diǎn))、提供選擇性功能的序列(即抗生素抗性標(biāo)記物、生物合成基因)、提供可計(jì)分標(biāo)記物功能的序列、體外或體內(nèi)協(xié)助序列操作的序列(即多接頭序列、位點(diǎn)特異性重組序列)和提供復(fù)制功能的序列(即細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn)、自主復(fù)制序列、著絲粒序列)。
[0088]本發(fā)明中所述的“殺蟲”是指對農(nóng)作物害蟲是有毒的。更具體地，目標(biāo)昆蟲是害蟲，例如，但不限于，大部分鱗翅目害蟲，如小地老虎、大螟等。
[0089]本發(fā)明中，所述殺蟲基因?yàn)閂ip3Aa_01基因序列，如序列表中SEQ ID N0:3所示。所述殺蟲基因?yàn)橛糜谥参?，特別是玉米和水稻轉(zhuǎn)化的DNA序列，除了包含由Vip3Aa-01基因序列編碼的蛋白質(zhì)的編碼區(qū)外，也可包含其他元件，例如編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的編碼區(qū)、編碼選擇性標(biāo)記的蛋白質(zhì)或賦予除草劑抗性的蛋白質(zhì)的編碼區(qū)。
[0090]本發(fā)明中Vip3Aa_01基因序列對危害玉米和水稻的大多數(shù)鱗翅目害蟲具有毒性。本發(fā)明中的植物，特別是玉米和水稻，在其基因組中含有外源DNA，所述外源DNA包含Vip3Aa-01基因序列，通過表達(dá)抑制量的該蛋白而保護(hù)其免受害蟲的威脅或控制害蟲。抑制量是指致死的或亞致死的劑量。同時，植物在形態(tài)上應(yīng)是正常的，且可在常規(guī)方法下培養(yǎng)以用于產(chǎn)物的消耗和/或生成。此外，該植物可基本消除對化學(xué)或生物殺蟲劑的需要(所述化學(xué)或生物殺蟲劑為針對由Vip3Aa-01基因序列編碼的蛋白質(zhì)所靶向的昆蟲的殺蟲劑)。
[0091]植物材料中殺蟲晶體蛋白(ICP)的表達(dá)水平可通過本領(lǐng)域內(nèi)所描述的多種方法進(jìn)行檢測，例如通過應(yīng)用特異引物對組織內(nèi)產(chǎn)生的編碼殺蟲蛋白質(zhì)的mRNA進(jìn)行定量，或直接特異性檢測產(chǎn)生的殺蟲蛋白質(zhì)的量。
[0092]可以應(yīng)用不同的試驗(yàn)測定植物中ICP的殺蟲效果。本發(fā)明中目標(biāo)昆蟲主要為鱗翅目害蟲，更具體地為小地老虎或大螟等。
[0093]此外，包含本發(fā)明殺蟲基因(Vip3Aa_01基因)序列的表達(dá)盒在植物中還可以與至少一種編碼除草劑抗性基因的蛋白質(zhì)一起表達(dá)，所述除草劑抗性基因包括但不限于，草胺膦抗性基因(如bar基因、pat基因)、苯敵草抗性基因(如pmph基因)、草甘膦抗性基因(如EPSPS基因)、溴苯腈(bromoxyniI)抗性基因、磺酰脲抗性基因、對除草劑茅草枯的抗性基因、對氨腈的抗性基因或谷氨酰胺合成酶抑制劑(如PPT)的抗性基因，從而獲得既具有高殺蟲活性、又具有除草劑抗性的轉(zhuǎn)基因植物。
[0094]本發(fā)明提供了一種殺蟲基因及其用途，具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0095]1、表達(dá)量高。本發(fā)明殺蟲基因Vip3Aa_01為依據(jù)玉米的偏好密碼子對殺蟲蛋白質(zhì)Vip3Aa-01進(jìn)行的優(yōu)化，同時去除了使mRNA不穩(wěn)定的序列、PolyA加尾信號和內(nèi)含子剪切類似位點(diǎn)，且提高了 GC含量，使得本發(fā)明殺蟲基因特別適合在單子葉植物中表達(dá)，尤其是玉米和水稻，其表達(dá)量高且穩(wěn)定性好。
[0096]2、毒力強(qiáng)。本發(fā)明殺蟲基因Vip3Aa_01為依據(jù)玉米的偏好密碼子對殺蟲蛋白質(zhì)Vip3Aa-01進(jìn)行的優(yōu)化，同時去除了使mRNA不穩(wěn)定的序列、PolyA加尾信號和內(nèi)含子剪切類似位點(diǎn)，且提高了 GC含量，使得本發(fā)明殺蟲基因不僅特別適合在單子葉植物中表達(dá)，尤其是玉米和水稻，而且還顯著增強(qiáng)了 Vip3Aa-01殺蟲蛋白對昆蟲害蟲的毒力，尤其是鱗翅目昆蟲害蟲。[0097]3、殺蟲譜廣。本發(fā)明殺蟲蛋白質(zhì)Vip3Aa_01蛋白不僅對小地老虎表現(xiàn)出較高的抗性，而且首次報道了本發(fā)明殺蟲蛋白質(zhì)Vip3Aa_01蛋白對大螟也具有較高的活性，因此在植物上應(yīng)用前景廣闊。
[0098]4、內(nèi)因防治?，F(xiàn)有技術(shù)主要是通過外部作用即外因來控制大螟害蟲的危害，如農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治和生物防治；而本發(fā)明是通過植物體內(nèi)產(chǎn)生能夠殺死大螟的Vip3A蛋白來控制大螟害蟲的，即通過內(nèi)因來防治。
[0099]5、無污染、無殘留?，F(xiàn)有技術(shù)使用的化學(xué)防治方法雖然對控制大螟害蟲的危害起到了一定作用，但同時也對人、畜和農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)帶來了污染、破壞和殘留；使用本發(fā)明Vip3A蛋白來控制大螟害蟲，可以消除上述不良后果。
[0100]6、全生育期防治。現(xiàn)有技術(shù)使用的控制大螟害蟲的方法都是階段性的，而本發(fā)明是對植物進(jìn)行全生育期的保護(hù)，轉(zhuǎn)基因植物(Vip3A蛋白)從發(fā)芽、生長，一直到開花、結(jié)果，都可以避免遭受大螟的侵害。
[0101]7、全植株防治。現(xiàn)有技術(shù)使用的控制大螟害蟲的方法大多是局部性的，如葉面噴施；而本發(fā)明是對整個植株進(jìn)行保護(hù)，如轉(zhuǎn)基因植物(Vip3A蛋白)的葉片、莖桿、雄穗、雌穗、花藥、花絲等都是可以抵抗大螟侵害的。
[0102]8、效果穩(wěn)定?，F(xiàn)有技術(shù)使用的生物殺蟲劑需要直接噴施到作物表面，因此造成有活性的結(jié)晶蛋白(包括Vip3A蛋白)在環(huán)境中被降解；本發(fā)明是使所述Vip3A蛋白在植物體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，有效地避免了生物殺蟲劑在自然界不穩(wěn)定的缺陷，且本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物(Vip3A蛋白)的防治效果在不同地點(diǎn)、不同時間、不同遺傳背景也都是穩(wěn)定一致的。
[0103]9、簡單、方便、 經(jīng)濟(jì)。現(xiàn)有技術(shù)使用的生物殺蟲劑在環(huán)境中易被降解，因此需要重復(fù)生產(chǎn)和重復(fù)應(yīng)用，并為在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的實(shí)際應(yīng)用帶來困難，大大地增加了成本；本發(fā)明只需種植能夠表達(dá)Vip3A蛋白的轉(zhuǎn)基因植物即可，而不需要采用其它措施，從而節(jié)省了大量人力、物力和財(cái)力。
[0104]10、效果徹底?，F(xiàn)有技術(shù)使用的控制大螟害蟲的方法，其效果是不徹底的，只起到減輕作用；而本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物(Vip3A蛋白)可以造成初孵大螟幼蟲的大量死亡，且對小部分存活幼蟲發(fā)育進(jìn)度造成極大的抑制，3天后幼蟲基本仍處于初孵狀態(tài)或介于初孵-陰性對照狀態(tài)之間，都是明顯的發(fā)育不良，且已停止發(fā)育，轉(zhuǎn)基因植物大體上只受到輕微損傷。
[0105]下面通過附圖和實(shí)施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0106]圖1為本發(fā)明殺蟲基因及其用途的含有Vip3Aa_01核苷酸序列的重組克隆載體DBNOl-T構(gòu)建流程圖；
[0107]圖2為本發(fā)明殺蟲基因及其用途的含有Vip3Aa_01核苷酸序列的重組表達(dá)載體DBN100066構(gòu)建流程圖；
[0108]圖3為本發(fā)明殺蟲基因及其用途的含有已知序列的重組表達(dá)載體DBN100066N構(gòu)建流程圖；
[0109]圖4為本發(fā)明殺蟲基因及其用途的轉(zhuǎn)基因玉米植株接種小地老虎的抗蟲效果圖；
[0110]圖5為本發(fā)明殺蟲基因及其用途的轉(zhuǎn)基因玉米植株接種大螟的抗蟲效果圖；[0111]圖6為本發(fā)明殺蟲基因及其用途的轉(zhuǎn)基因水稻植株接種大螟的抗蟲效果圖。【具體實(shí)施方式】
[0112]下面通過具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明殺蟲基因及其用途的技術(shù)方案。
[0113]第一實(shí)施例、Vip3A基因的獲得和合成
[0114]1、獲得Vip3A核苷酸序列
[0115]Vip3Aa-01殺蟲蛋白質(zhì)的氨基酸序列(789個氨基酸)，如序列表中SEQ ID NO:1所示；編碼相應(yīng)于所述Vip3Aa-01殺蟲蛋白質(zhì)的氨基酸序列(789個氨基酸)的Vip3Aa_01核苷酸序列(2370個核苷酸)，如序列表中SEQ ID N0:3所示。Vip3Aa_02殺蟲蛋白質(zhì)的氨基酸序列(789個氨基酸)，如序列表中SEQ ID NO: 2所示；編碼相應(yīng)于所述Vip3Aa_02殺蟲蛋白質(zhì)的氨基酸序列(789個氨基酸)的Vip3Aa-02核苷酸序列(2370個核苷酸)，如序列表中SEQ ID NO:4 所示。
[0116]2、獲得CrylA和CrylF核苷酸序列
[0117]編碼CrylAb殺蟲蛋白質(zhì)的氨基酸序列(615個氨基酸)的CrylAb核苷酸序列(1848個核苷酸)，如序列表中SEQ ID N0:5所示；編碼CrylFa殺蟲蛋白質(zhì)的氨基酸序列(605個氨基酸)的CrylFa核苷酸序列(1818個核苷酸)，如序列表中SEQ ID NO: 6所示。
[0118]3、合成上述核苷酸序列
[0119]所述Vip3Aa_01核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO: 3所示)、所述Vip3Aa_02核苷酸序列(如序列表中SEQ ID N0:4所示)、所述CrylAb核苷酸序列(如序列表中SEQ IDNO: 5所示)和所述CrylFa核 苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO:6所示)由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；合成的所述Vip3Aa-01核苷酸序列(SEQ ID NO: 3)的5’端還連接有ScaI酶切位點(diǎn)，所述Vip3Aa-01核苷酸序列(SEQ ID NO:3)的3’端還連接有SpeI酶切位點(diǎn)；合成的所述Vip3Aa-02核苷酸序列(SEQ ID N0:4)的5’端還連接有ScaI酶切位點(diǎn)，所述Vip3Aa-02核苷酸序列(SEQ ID NO:4)的3’端還連接有SpeI酶切位點(diǎn)；合成的所述CrylAb核苷酸序列(SEQ ID NO: 5)的5’端還連接有NcoI酶切位點(diǎn)，所述CrylAb核苷酸序列(SEQ ID NO: 5)的3’端還連接有BamHI酶切位點(diǎn)；合成的所述CrylFa核苷酸序列(SEQID NO:6)的5’端還連接有AscI酶切位點(diǎn)，所述CrylFa核苷酸序列(SEQ ID N0:6)的3，端還連接有BamHI酶切位點(diǎn)。
[0120]第二實(shí)施例、重組表達(dá)載體的構(gòu)建及重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
[0121]1、構(gòu)建含有Vip3A基因的重組克隆載體
[0122]將合成的Vip3Aa_01核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T (Promega, Madison, USA,CAT:A3600)上，操作步驟按Promega公司產(chǎn)品pGEM_T載體說明書進(jìn)行，得到重組克隆載體DBN01-T，其構(gòu)建流程如圖1所示(其中，Amp表示氨芐青霉素抗性基因；fl表示噬菌體fl的復(fù)制起點(diǎn)；LacZ為LacZ起始密碼子；SP6為SP6RNA聚合酶啟動子；T7為T7RNA聚合酶啟動子；Vip3Aa-01為Vip3Aa-01核苷酸序列(SEQ ID NO: 3) ；MCS為多克隆位點(diǎn))。
[0123]然后將重組克隆載體DBNOl-T用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Tl感受態(tài)細(xì)胞(Transgen, Beijing, China, CAT:CD501 )，其熱激條件為:50 μ I大腸桿菌Tl感受態(tài)細(xì)胞、10 μ I質(zhì)粒DNA(重組克隆載體DBN01-T)，42°C水浴30秒；37°C水浴I小時(IOOrpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動)，在表面涂有IPTG (異丙基硫代-D-半乳糖苷)和X-gal (5-溴-4-氯-3- Π引哚-β -D-半乳糖苷)的氨芐青霉素(100毫克/升)的LB平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L，瓊脂15g/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L，氨芐青霉素100mg/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)中于溫度37°C條件下培養(yǎng)過夜。堿法提取其質(zhì)粒:將菌液在12000rpm轉(zhuǎn)速下離心Imin,去上清液,沉淀菌體用100 μ I冰預(yù)冷的溶液I (25mM Tris-HCl, IOmM EDTA(乙二胺四乙酸)，50mM葡萄糖，pH8.0)懸??；加入150μ I新配制的溶液II (0.2Μ NaOH,1%SDS(十二烷基硫酸鈉))，將管子顛倒4次，混合，置冰上3-5min ;加入150 μ I冰冷的溶液III (4Μ醋酸鉀，2Μ醋酸)，立即充分混勻，冰上放置5-10min ;于溫度4°C、轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心5min，在上清液中加入2倍體積無水乙醇，混勻后室溫放置5min ;于溫度4V、轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心5min，棄上清液，沉淀用濃度(V/V)為70%的乙醇洗滌后晾干；加入 30μ I 含 RNase (20μ g/ml)的 TE (IOmM Tris-HCl, ImM EDTA，PH8.0)溶解沉淀；于溫度37°C下水浴30min，消化RNA ;于溫度_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0124]提取的質(zhì)粒經(jīng)EcoRV和SphI酶切鑒定后，對陽性克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證，結(jié)果表明重組克隆載體DBN01-T中插入的所述Vip3Aa-01核苷酸序列為序列表中SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列，即Vip3Aa-01核苷酸序列正確插入。
[0125]按照上述構(gòu)建重組克隆載體DBN01-T的方法，將合成的所述Vip3Aa_02核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T上，得到重組克隆載體DBN02-T，其中，Vip3Aa_02為Vip3Aa_02核苷酸序列(SEQ ID N0:4)。酶切和測序驗(yàn)證重組克隆載體DBN02-T中所述Vip3Aa-02核苷酸序列正確插入。
[0126]按照上述構(gòu)建重組克隆載體DBN01-T的方法，將合成的所述CrylAb核苷酸序列連入克隆載體PGEM-T上，得到重組克隆載體DBN03-T，其中，CrylAb為CrylAb核苷酸序列(SEQ ID N0:5)。酶切和測序驗(yàn)證重組克隆載體DBN03-T中所述CrylAb核苷酸序列正確插入。
[0127]按照上述構(gòu)建重 組克隆載體DBN01-T的方法，將合成的所述CrylFa核苷酸序列連入克隆載體PGEM-T上，得到重組克隆載體DBN04-T，其中，CrylFa為CrylFa核苷酸序列(SEQ ID N0:6)。酶切和測序驗(yàn)證重組克隆載體DBN04-T中所述CrylFa核苷酸序列正確插入。
[0128]2、構(gòu)建含有Vip3A基因的重組表達(dá)載體
[0129]用限制性內(nèi)切酶ScaI和SpeI分別酶切重組克隆載體DBN01-T和表達(dá)載體DBNBC-01 (載體骨架:pCAMBIA2301 (CAMBIA機(jī)構(gòu)可以提供))，將切下的Vip3Aa_01核苷酸序列片段插到表達(dá)載體DBNBC-01的ScaI和SpeI位點(diǎn)之間，利用常規(guī)的酶切方法構(gòu)建載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，構(gòu)建成重組表達(dá)載體DBN100066，其構(gòu)建流程如圖2所示(Kan:卡那霉素基因；RB:右邊界；Ub1:玉米Ubiquitin (泛素)基因啟動子(SEQ ID NO: 7);Vip3Aa-01:Vip3Aa-01核苷酸序列(SEQ ID NO: 3) ;Nos:胭脂堿合成酶基因的終止子(SEQID NO:8) ；PM1:磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(SEQ ID NO:9) ；LB:左邊界)。
[0130]將重組表達(dá)載體DBN100066用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Tl感受態(tài)細(xì)胞，其熱激條件為:50μ I大腸桿菌Tl感受態(tài)細(xì)胞、10 μ I質(zhì)粒DNA (重組表達(dá)載體DBN100066)，42°C水浴30秒；37°C水浴I小時(IOOrpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動);然后在含50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的LB固體平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L，瓊脂15g/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)上于溫度37°C條件下培養(yǎng)12小時，挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)中于溫度37°C條件下培養(yǎng)過夜。堿法提取其質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶ScaI和SpeI酶切后鑒定，并將陽性克隆進(jìn)行測序鑒定，結(jié)果表明重組表達(dá)載體DBN100066在ScaI和SpeI位點(diǎn)間的核苷酸序列為序列表中SEQ ID N0:3所示核苷酸序列，即Vip3Aa-01核苷酸序列。
[0131]按照上述構(gòu)建重組表達(dá)載體DBN100066的方法，將ScaI和Spe1、NcoI和BamHI酶切重組克隆載體DBNOl-T和DBN03-T切下的所述Vip3Aa_01核苷酸序列和CrylAb核苷酸序列插入表達(dá)載體DBNBC-Ol，得到重組表達(dá)載體DBN100003。酶切和測序驗(yàn)證重組表達(dá)載體DBN100003中的核苷酸序列含有為序列表中SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:5所示核苷酸序列，即Vip3Aa-01核苷酸序列和CrylAb核苷酸序列。
[0132]按照上述構(gòu)建重組表達(dá)載體DBN100066的方法，將ScaI和Spe1、AscI和BamHI酶切重組克隆載體DBN02-T和DBN04-T切下的所述Vip3Aa_02核苷酸序列和CrylFa核苷酸序列插入表達(dá)載體DBNBC-Ol，得到重組表達(dá)載體DBN100276。酶切和測序驗(yàn)證重組表達(dá)載體DBN100276中的核苷酸序列含有為序列表中SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:6所示核苷酸序列，即Vip3Aa-02核苷酸序列和CrylFa核苷酸序列。
[0133]3、構(gòu)建含有已知序列的重組表達(dá)載體DBN100066N
[0134]按照本發(fā)明第二實(shí)施例中I所述的構(gòu)建含有Vip3Aa_01核苷酸序列的重組克隆載體DBNOl-T的方法，利用已知序列(SEQ ID NO:22)構(gòu)建含有已知序列的重組克隆載體DBNOIR-To對陽性克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證，結(jié)果表明重組克隆載體DBNOlR-T中插入的已知序列為序列表中SEQ ID N0:22所示的核苷酸序列，即已知序列正確插入。
[0135]按照本發(fā)明第二實(shí)施例中2所述的構(gòu)建含有Vip3Aa_01核苷酸序列的重組表達(dá)載體DBN100066的方法，利用 已知序列構(gòu)建含有已知序列的重組表達(dá)載體DBN100066N，其構(gòu)建流程如圖3所示(載體骨架:pCAMBIA2301 (CAMBIA機(jī)構(gòu)可以提供)；Kan:卡那霉素基因；RB:右邊界；Ub1:玉米Ubiquitin (泛素)基因啟動子(SEQ ID NO: 7);mN:已知序列(SEQ IDN0:22);NOS:胭脂堿合成酶基因的終止子(SEQ ID N0:8)；PM1:磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(SEQID N0:9) ;LB:左邊界)。對陽性克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證，結(jié)果表明重組表達(dá)載體DBN100066N中在ScaI和SpeI位點(diǎn)間插入的已知序列為序列表中SEQ ID NO: 22所示的核苷酸序列，即已知序列正確插入。
[0136]4、重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
[0137]對己經(jīng)構(gòu)建正確的重組表達(dá)載體DBN100066、DBN100003、DBN100276和DBN100066N (已知序列)用液氣法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌 LBA4404 (Invitrgen, Chicago, USA, CAT:18313-015)中，其轉(zhuǎn)化條件為:10(^1^農(nóng)桿菌1^44404、3 4 1^質(zhì)粒0嫩(重組表達(dá)載體)；置于液氮中10分鐘，37°C溫水浴10分鐘；將轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌LBA4404接種于LB試管中于溫度28°C、轉(zhuǎn)速為200rpm條件下培養(yǎng)2小時，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和IOOmg/L的卡那霉素(Kanamycin)的LB平板上直至長出陽性單克隆，挑取單克隆培養(yǎng)并提取其質(zhì)粒,用限制性內(nèi)切酶StyI和AatII對DBN100066、DBN100003和DBN100276酶切后進(jìn)行酶切驗(yàn)證，用限制性內(nèi)切酶AhdI和ApaLI對DBN100066N (已知序列)酶切后進(jìn)行酶切驗(yàn)證，結(jié)果表明重組表達(dá)載體DBN100066、DBN100003、DBN100276和DBN100066N (已知序列)結(jié)構(gòu)完全正確。[0138]第三實(shí)施例、轉(zhuǎn)入Vip3A基因的玉米植株的獲得及驗(yàn)證
[0139]1、獲得轉(zhuǎn)入Vip3A基因的玉米植株
[0140]按照常規(guī)采用的農(nóng)桿菌侵染法，將無菌培養(yǎng)的玉米品種綜31 (Z31)的幼胚與第二實(shí)施例中4所述的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，以將第二實(shí)施例中2和3構(gòu)建的重組表達(dá)載體DBN100066、DBN100003、DBN100276 和 DBN100066N (已知序列)中的 T-DNA (包括玉米Ubiquitin基因的啟動子序列、Vip3Aa_01核苷酸序列、Vip3Aa_02核苷酸序列、CrylAb核苷酸序列、CrylFa核苷酸序列、已知序列、PMI基因和Nos終止子序列)轉(zhuǎn)入到玉米染色體組中，獲得了轉(zhuǎn)入Vip3Aa-01核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入Vip3Aa_01_CrylAb核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入Vip3Aa-02-CrylFa核苷酸序列的玉米植株和轉(zhuǎn)入已知序列的玉米植株；同時以野生型玉米植株作為對照。
[0141]對于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化，簡要地，從玉米中分離未成熟的幼胚，用農(nóng)桿菌懸浮液接觸幼胚，其中農(nóng)桿菌能夠?qū)ip3A基因傳遞至幼胚之一的至少一個細(xì)胞(步驟1:侵染步驟)。在此步驟中，幼胚優(yōu)選地浸入農(nóng)桿菌懸浮液(OD66tl=0.4-0.6，侵染培養(yǎng)基(MS鹽
4.3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、鹿糖68.5g/L、葡萄糖36g/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D) lmg/L，pH5.3))中以啟動接種。幼胚與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)一段時期(3天)(步驟2:共培養(yǎng)步驟)。優(yōu)選地，幼胚在侵染步驟后在固體培養(yǎng)基(MS鹽4.3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、鹿糖20g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮(AS) 100mg/L、2, 4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D) lmg/L、瓊脂8g/L，pH5.8)上培養(yǎng)。在此共培養(yǎng)階段后，可以有一個選擇性的“恢復(fù)”步驟。在“恢復(fù)”步驟中，恢復(fù)培養(yǎng)基(MS鹽4.3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、鹿糖30g/L、2, 4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D) lmg/L、瓊脂8g/L, pH5.8)中至少存在一種己知抑制農(nóng)桿菌生長的抗生素(頭孢霉素)，不添加植物轉(zhuǎn)化體的選擇劑(步驟3:恢復(fù)步驟)。優(yōu)選地，幼胚在有抗生素但沒有選擇劑的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以消除農(nóng)桿菌并為侵染細(xì)胞提供恢復(fù)期。接著，接種的幼胚在含 選擇劑(甘露糖)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)并選擇生長著的轉(zhuǎn)化愈傷組織(步驟4:選擇步驟)。優(yōu)選地，幼胚在有選擇劑的篩選固體培養(yǎng)基(MS鹽4.3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、鹿糖5g/L、甘露糖12.5g/L、2, 4- 二氯苯氧乙酸(2，4_D) lmg/L、瓊脂8g/L，pH5.8)上培養(yǎng)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的細(xì)胞選擇性生長。然后，愈傷組織再生成植物(步驟5:再生步驟)，優(yōu)選地，在含選擇劑的培養(yǎng)基上生長的愈傷組織在固體培養(yǎng)基(MS分化培養(yǎng)基和MS生根培養(yǎng)基)上培養(yǎng)以再生植物。
[0142]篩選得到的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到所述MS分化培養(yǎng)基(MS鹽4.3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、6-芐基腺嘌呤2mg/L、甘露糖5g/L、瓊脂8g/L，pH5.8)上，25°C下培養(yǎng)分化。分化出來的小苗轉(zhuǎn)移到所述MS生根培養(yǎng)基(MS鹽2.15g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、吲哚-3-乙酸lmg/L、瓊脂8g/L，pH5.8)上，25°C下培養(yǎng)至約IOcm高，移至溫室培養(yǎng)至結(jié)實(shí)。在溫室中，每天于28°C下培養(yǎng)16小時，再于20°C下培養(yǎng)8小時。
[0143]2、用TaqMan驗(yàn)證轉(zhuǎn)入Vip3A核苷酸序列的玉米植株
[0144]分別取轉(zhuǎn)入Vip3Aa_01核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入Vip3Aa_01_CrylAb核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入Vip3Aa-02-CrylFa核苷酸序列的玉米植株和轉(zhuǎn)入已知序列的玉米植株的葉片約IOOmg作為樣品，用Qiagen的DNeasy Plant Maxi Kit提取其基因組DNA,通過Taqman探針熒光定量PCR方法檢測Vip3A基因、CrylA基因和CrylF基因的拷貝數(shù)。同時以野生型玉米植株作為對照，按照上述方法進(jìn)行檢測分析。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，取平均值。[0145]檢測Vip3A基因、CrylA基因和CrylF基因拷貝數(shù)的具體方法如下:
[0146]步驟11、分別取轉(zhuǎn)入Vip3Aa_01核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入Vip3Aa_01_CrylAb核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入Vip3Aa-02-CrylFa核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入已知序列的玉米植株和野生型玉米植株的葉片各lOOmg，分別在研缽中用液氮研成勻漿，每個樣品取3個重復(fù)；
[0147]步驟12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述樣品的基因組DNA,具體方法參考其產(chǎn)品說明書；
[0148]步驟13、用NanoDrop2000 (Thermo Scientific)測定上述樣品的基因組DNA濃度；
[0149]步驟14、調(diào)整上述樣品的基因組DNA濃度至同一濃度值，所述濃度值的范圍為80_100ng/μ I ；
[0150]步驟15、采用Taqman探針熒光定量PCR方法鑒定樣品的拷貝數(shù)，以經(jīng)過鑒定已知拷貝數(shù)的樣品作為標(biāo)準(zhǔn)品，以野生型玉米植株的樣品作為對照，每個樣品3個重復(fù)，取其平均值；熒光定量PCR引物和探針序列分別是:
[0151]以下引物和探針用來檢測Vip3Aa_01核苷酸序列:
[0152]引物I (VFl):ATTCTCGAAATCTCCCCTAGCG 如序列表中 SEQ ID NO: 10 所示；
[0153]引物2 (VRl):GCTGCCAGTGGATGTCCAG 如序列表中 SEQ ID NO: 11 所示；
[0154]探針I(yè) (VPl):CTCCTGAGCCCCGAGCTGATTAACACC 如序列表中 SEQ ID NO: 12 所示；
[0155]以下引物和探針用來檢測Vip3Aa_02核苷酸序列:
[0156]引物3 (VF2):ATTCTCGAAATCTCCCCTAGCG 如序列表中 SEQ ID NO: 13 所示；
[0157]引物4 (VR2):GCTGCCAGTGGATGTCCAG 如序列表中 SEQ ID NO: 14 所示；
[0158]探針2 (VP2):CTCCTGAGCCCCGAGCTGATTAACACC 如序列表中 SEQ ID NO: 15 所示；
[0159]以下引物和探針用來檢測CrylAb核苷酸序列:
[0160]引物5 (CFl):TGCGTATTCAATTCAACGACATG 如序列表中 SEQ ID NO: 16 所示；
[0161]引物6 (CRl):CTTGGTAGTTCTGGACTGCGAAC 如序列表中 SEQ ID NO: 17 所示；
[0162]探針3 (CPl):CAGCGCCTTGACCACAGCTATCCC 如序列表中 SEQ ID NO: 18 所示；
[0163]以下引物和探針用來檢測CrylFa核苷酸序列:
[0164]引物7 (CF2):CAGTCAGGAACTACAGTTGTAAGAGGG 如序列表中 SEQ ID NO: 19 所示；
[0165]引物8 (CR2):ACGCGAATGGTCCTCCACTAG 如序列表中 SEQ ID NO: 20 所示；
[0166]探針4 (CP2):CGTCGAAGAATGTCTCCTCCCGTGAAC 如序列表中 SEQ ID NO: 21 所示；
[0167]以下引物和探針用來檢測已知序列:
[0168]引物9 (VF3):CACCAACAACAACCTGGAGGAC 如序列表中 SEQ ID NO: 23 所示；
[0169]引物10 (VR3):AGGATCAGGTACACGCCCTTC 如序列表中 SEQ ID NO: 24 所示；
[0170]探針5 (VP3):CAGACCATCAACAAGCGCTTCACCAC 如序列表中 SEQ ID NO: 25 所示；
[0171]PCR反應(yīng)體系為:
[0172]JumpStan? Taq ReadyMix?(Sigma) I Ομ?
50x引物/探針混合物Ιμ?
基因組DNA3μ1
水(CldH2O)6μΙ
[0173]所述50Χ引物/探針混合物包含ImM濃度的每種引物各45 μ 1，100 μ M濃度的探針50μ I和860 μ IlXTE緩沖液，并且在4°C，貯藏在琥珀試管中。
[0174]PCR反應(yīng)條件為:
[0175]
步驟溫度時間
21950C5 分鐘
2295 0C30 秒
2360°CI 分鐘
24回到步驟22,重復(fù)40次
[0176]利用SDS2.3 軟件(Applied Biosystems)分析數(shù)據(jù)。
[0177]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Vip3Aa-01核苷酸序列、Vip3Aa-01_CrylAb核苷酸序列、Vip3Aa-02-CrylFa核苷酸序列和已知序列均己整合到所檢測的玉米植株的染色體組中，而且轉(zhuǎn)入Vip3Aal9-01核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入Vip3Aa-01-CrylAb核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入Vip3Aa-02-CrylFa核苷酸序列的玉米植株和轉(zhuǎn)入已知序列的玉米植株均獲得了含有單拷貝Vip3A基因、CrylA基因和/或CrylF基因的轉(zhuǎn)基因玉米植株。
[0178]第四實(shí)施例、轉(zhuǎn)基因玉米植株的殺蟲蛋白質(zhì)的含量檢測
[0179]1、轉(zhuǎn)基因玉米植株的殺蟲蛋白質(zhì)的含量檢測
[0180]本實(shí)驗(yàn)中涉及的溶液如下:
[0181]萃取緩沖液:8g/LNaCl, 0.2g/L KH2PO4, 2.9g/L Na2HPO4.12H20，0.2g/L KCl,5.5ml/L 吐溫 20 (Tween-20), pH7.4 ；
[0182]洗滌緩沖液PBST:8g/L NaCl，0.2g/L KH2PO4, 2.9g/L Na2HPO4.12H20，0.2g/L KCl，0.5ml/L 吐溫 20 (Tween-20), pH7.4 ；
[0183]終止液:IMHCl。
[0184]分別取3mg轉(zhuǎn)入Vip3Aa_01核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入Vip3Aa_01_CrylAb核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入Vip3Aa-02-CrylFa核苷酸序列的玉米植株和轉(zhuǎn)入已知序列的玉米植株的新鮮葉片作為樣品，液氮研磨后加入800μ I所述萃取緩沖液，4000rpm的轉(zhuǎn)速下離心lOmin，取上清液用所述萃取緩沖液稀釋40倍，取80 μ I稀釋后的上清液用于ELISA檢測。用ELISA (酶聯(lián)免疫吸附測定法)試劑盒(ENVIRL0GIX公司，Vip3A試劑盒、CrylAb/CrylAc試劑盒和CrylFa試劑盒)對樣品中殺蟲蛋白質(zhì)(Vip3A蛋白、CryIAb蛋白和CrylFa蛋白)量占葉片鮮重的比例進(jìn)行檢測分析，具體方法參考其產(chǎn)品說明書。
[0185]同時以野生型玉米植株和經(jīng)Taqman鑒定為非轉(zhuǎn)基因的玉米植株作為對照，按照上述方法進(jìn)行檢測分析。轉(zhuǎn)入Vip3Aa-01核苷酸序列的共3個株系(S1、S2和S3)，轉(zhuǎn)入Vip3Aa-01-CrylAb核苷酸序列的共3個株系(S4、S5和S6)，轉(zhuǎn)入Vip3Aa_02_CrylFa核苷酸序列的共3個株系(S7、S8和S9)，轉(zhuǎn)入已知序列的共3個株系(S19、S20和S21)，經(jīng)Taqman鑒定為非轉(zhuǎn)基因的(NGMl)共I個株系，野生型的(CKl)共I個株系；從每個株系選3株進(jìn)行測試，每株重復(fù)6次。
[0186]表1、轉(zhuǎn)基因玉米植株的Vip3Aa蛋白表達(dá)量測定平均結(jié)果
[0187]
【權(quán)利要求】
1.一種殺蟲基因，其特征在于，其核苷酸序列包括: Ca)具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；或 (b)與(a)的核苷酸序列同類編碼，且不為SEQID NO: 22 ;或 (c)在嚴(yán)格條件下與(a)或(b)限定的核苷酸序列雜交且編碼具有殺蟲活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
2.一種表達(dá)盒，其特征在于，包含在有效連接的調(diào)控序列調(diào)控下的權(quán)利要求1所述殺蟲基因。
3.一種包含權(quán)利要求1所述殺蟲基因或權(quán)利要求2所述表達(dá)盒的重組載體。
4.一種包含權(quán)利要求1所述殺蟲基因或權(quán)利要求2所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因宿主生物，其特征在于，包括植物細(xì)胞、動物細(xì)胞、細(xì)菌、酵母、桿狀病毒、線蟲或藻類。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述轉(zhuǎn)基因宿主生物，其特征在于，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。
6.—種產(chǎn)生殺蟲蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，包括: 獲得權(quán)利要求4或5所述轉(zhuǎn)基因宿主生物的細(xì)胞； 在允許產(chǎn)生殺蟲蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)基因宿主生物的細(xì)胞； 回收所述殺蟲蛋白質(zhì)。
7.一種用于增加昆蟲靶范圍的方法，其特征在于，包括:將權(quán)利要求1所述殺蟲基因編碼的殺蟲蛋白質(zhì)或權(quán)利要求2所述表達(dá)盒編碼的殺蟲蛋白質(zhì)在植物中與至少一種不同于權(quán)利要求1所述殺蟲基因編碼的殺蟲蛋白質(zhì)或權(quán)利要求2所述表達(dá)盒編碼的殺蟲蛋白質(zhì)的第二種殺蟲核苷酸一起表達(dá)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述用于增加昆蟲靶范圍的方法，其特征在于，所述第二種殺蟲核苷酸可以編碼Cry類殺蟲蛋白質(zhì)、Vip類殺蟲蛋白質(zhì)、蛋白酶抑制劑、凝集素、α _淀粉酶或過氧化物酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述用于增加昆蟲靶范圍的方法，其特征在于，所述第二種殺蟲核苷酸為抑制目標(biāo)昆蟲害蟲中重要基因的dsRNA。
10.一種產(chǎn)生抗蟲植物的方法，其特征在于，包括:將權(quán)利要求1所述殺蟲基因或權(quán)利要求2所述表達(dá)盒或權(quán)利要求3所述重組載體導(dǎo)入植物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述產(chǎn)生抗蟲植物的方法，其特征在于，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。
12.一種用于保護(hù)植物免受由昆蟲害蟲引起的損傷的方法，其特征在于，包括:將權(quán)利要求I所述殺蟲基因或權(quán)利要求2所述表達(dá)盒或權(quán)利要求3所述重組載體導(dǎo)入植物，使導(dǎo)入后的植物產(chǎn)生足夠保護(hù)其免受昆蟲害蟲侵害量的殺蟲蛋白質(zhì)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述用于保護(hù)植物免受由昆蟲害蟲引起的損傷的方法，其特征在于，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。
14.一種控制昆蟲害蟲的方法,其特征在于,包括:使昆蟲害蟲與抑制量的由權(quán)利要求1所述殺蟲基因編碼的昆蟲抑制性蛋白接觸。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述控制昆蟲害蟲的方法，其特征在于，所述昆蟲害蟲是鱗翅目昆蟲害蟲。
16.一種由權(quán)利要求1所述殺蟲基因編碼的昆蟲抑制性蛋白質(zhì)控制昆蟲害蟲的用途。
17.—種控制大螟害蟲的方法，其特征在于，包括將大螟害蟲與Vip3A蛋白接觸。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的控制大螟害蟲的方法，其特征在于，所述Vip3A蛋白為Vip3Aa 蛋白 ο
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的控制大螟害蟲的方法，其特征在于，所述Vip3Aa蛋白存在于產(chǎn)生所述Vip3Aa蛋白的植物細(xì)胞中，所述大螟害蟲通過攝食所述植物細(xì)胞與所述Vip3Aa蛋白接觸。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的控制大螟害蟲的方法，其特征在于，所述Vip3Aa蛋白存在于產(chǎn)生所述Vip3Aa蛋白的轉(zhuǎn)基因植物中，所述大螟害蟲通過攝食所述轉(zhuǎn)基因植物的組織與所述Vip3Aa蛋白接觸，接觸后所述大螟害蟲生長受到抑制并最終導(dǎo)致死亡，以實(shí)現(xiàn)對大螟危害植物的控制。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的控制大螟害蟲的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因植物可以處于任意生育期。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的控制大螟害蟲的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因植物的組織可以為葉片、莖桿、雄穗、雌穗、花藥或花絲。
23.根據(jù)權(quán)利要求20所述的控制大螟害蟲的方法，其特征在于，所述對大螟危害植物的控制不因種植地點(diǎn)的改變而改變。
24.根據(jù)權(quán)利要求20所述的控制大螟害蟲的方法，其特征在于，所述對大螟危害植物的控制不因種植時間的改變而改變。
25.根據(jù)權(quán)利要求19至24任一項(xiàng)所述的控制大螟害蟲的方法，其特征在于，所述植物可以來自玉米、水稻、高粱、麥、粟、棉花、蘆葦、甘蔗、茭白、蠶豆或油菜。
26.根據(jù)權(quán)利要求19至25任一項(xiàng)所述的控制大螟害蟲的方法，其特征在于，所述接觸步驟之前的步驟為種植含有編碼所述Vip3Aa蛋白的多核苷酸的植物。
27.根據(jù)權(quán)利要求18至26任一項(xiàng)所述的控制大螟害蟲的方法，其特征在于，所述Vip3Aa蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID ΝΟ:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的控制大螟害蟲的方法，其特征在于，所述Vip3Aa蛋白的核苷酸序列具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
29.根據(jù)權(quán)利要求19至28任一項(xiàng)所述的控制大螟害蟲的方法，其特征在于，所述植物還可以產(chǎn)生至少一種不同于所述Vip3Aa蛋白的第二種核苷酸。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的控制大螟害蟲的方法，其特征在于，所述第二種核苷酸可以編碼Cry類殺蟲蛋白質(zhì)、Vip類殺蟲蛋白質(zhì)、蛋白酶抑制劑、凝集素、α _淀粉酶或過氧化物酶。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的控制大螟害蟲的方法，其特征在于，所述第二種核苷酸可以編碼CrylAb蛋白、CrylFa蛋白或CrylBa蛋白。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的控制大螟害蟲的方法，其特征在于，所述第二種核苷酸包括SEQ ID ΝΟ:5或SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。
33.根據(jù)權(quán)利要求29所述的控制大螟害蟲的方法，其特征在于，所述第二種核苷酸為抑制目標(biāo)昆蟲害蟲中重要基因的dsRNA。
34.一種Vip3A蛋白質(zhì) 控制大螟害蟲的用途。
【文檔編號】A01N47/44GK103509808SQ201310289850
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年7月11日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月5日
【發(fā)明者】韓超, 龐潔, 丁德榮, 康越景, 王利君, 梁燕龍, 劉雁華, 錢盈佳, 楊秋妹, 田康樂, 趙曉娜 申請人:北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司, 北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司生物技術(shù)中心