使用染料木黃酮提高牛冷凍精液精子運(yùn)動(dòng)性及體外受精率的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種使用染料木黃酮提高牛冷凍精液精子運(yùn)動(dòng)性及體外受精率的方法。具體在于：在牛冷凍精液的前期處理中使用的SP-TALP洗滌液洗滌時(shí)，或在第二階段受精前精液的獲能處理階段中向含有牛精液的IVF-TALP受精液和PHE獲能液的混合液內(nèi)，或在第三階段體外受精過程中制備含有卵母細(xì)胞的受精滴時(shí)加入含1‰DMSO的染料木黃酮；其中每支牛冷凍精液的受精過程中，前兩個(gè)階段中加入時(shí)，染料木黃酮加入的量均為10μmol/L，在第三個(gè)階段加入時(shí)，染料木黃酮在含有卵母細(xì)胞的受精滴與牛精液混合液中的終濃度為10μmol/L。本發(fā)明將染料木黃酮分別使用在體外受精的三個(gè)階段中大大提高精子的運(yùn)動(dòng)性，高精子的受精率。
【專利說明】使用染料木黃酮提高牛冷凍精液精子運(yùn)動(dòng)性及體外受精率的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種增加牛冷凍精液精子運(yùn)動(dòng)性和體外受精率的活性物質(zhì)及方法，屬于家畜胚胎工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是一種使用染料木黃酮提高牛冷凍精液精子運(yùn)動(dòng)性及體外受精率的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前牛的冷凍精液已經(jīng)進(jìn)入商業(yè)化生產(chǎn)，被廣泛應(yīng)用于人工受精技術(shù)。精液生產(chǎn)和使用中的冷凍解凍過程破壞了精子的活性氧(reactive oxygen species,R0S)在正常生理?xiàng)l件下的動(dòng)態(tài)平衡，導(dǎo)致精子ROS增加，引起精子膜的流動(dòng)性改變，產(chǎn)生氧化損傷，從而影響精子活力、質(zhì)膜完整性及形態(tài)等，降低了受精能力。同時(shí)ROS會(huì)損害細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)、核酸以及蛋白質(zhì)，使有關(guān)早期胚胎發(fā)育的蛋白質(zhì)沒有得到表達(dá)或蛋白結(jié)構(gòu)受到破壞，導(dǎo)致早期胚胎體外發(fā)育率較低。
[0003]染料木黃酮(Genistein，又稱染料木素)，化學(xué)名為4'，5，7_三羥異黃酮。來源于豆類植物和齒狀植物的異黃酮類化合物，是大豆異黃酮的主要活性成分，也可以通過化學(xué)方式合成。染料木黃酮一方面具有抗氧化功能，可以清除活性氧減少過氧化物引起的DNA損傷。Fraser等(2006)研究表明，l-100nmol/L Genistein與人類精子共孵育,可以加快精子獲能和頂體損傷；濃度為0.01-100 μ mol/L時(shí),可以顯著降低過氧化氫引起的DNA損傷(Sierens et al., 2002);濃度達(dá)到500 μ mol/L時(shí)，會(huì)導(dǎo)致精子ROS含量增加，但不會(huì)影響精子生存能力同時(shí)也不會(huì)引起DNA損傷(Bennetts et al.，2008)。另一方面染料木黃酮也是一種酪氨酸蛋白激酶(TPK)抑制劑。酪氨酸蛋白磷酸化是調(diào)控精子獲能、運(yùn)動(dòng)性能變化以及超活化的重要因素，抑制酪氨酸蛋白激酶(TPK)活性能降低精子的運(yùn)動(dòng)參數(shù)，但是不同劑量的染料木黃酮對精子 活力的影響不同。低劑量的染料木黃酮對鼠和人的精子活力無影響(Kum1-Diaka et al.，2001);但是在人精液解凍時(shí)添加10 μ mol/L染料木黃酮,可以輕微增加直線運(yùn)動(dòng)的精子活率和總體的精子活率(Martinez-Soto et al.，2010);當(dāng)劑量達(dá)到 400 μ mol/L,精子活率反而下降(Bajpai et al., 2003a;Bajpai et al.，2003b)。
[0004]利用染料木黃酮來改善人和老鼠精子運(yùn)動(dòng)能力的報(bào)道較多，并且研究結(jié)果一致表明，在含有血清白蛋白的HTF受精液和胎牛血清(FCS)培養(yǎng)基添加10 μ mol/L的染料木黃酮，可以降低ROS對人精子產(chǎn)生的過氧化損傷，提高精子活率，但是染料木黃酮對牛精子運(yùn)動(dòng)性的影響尚未見到報(bào)道。雖然通過分析精子的運(yùn)動(dòng)能力可以預(yù)測精子的受精能力，但是每種動(dòng)物的體外受精過程均不一樣，影響體外受精的因素也比較多，不同動(dòng)物的受精過程就會(huì)出現(xiàn)很大的差異，而且染料木黃酮雖然有在改善人和老鼠的運(yùn)動(dòng)能力報(bào)道過，但是如何使用該物質(zhì)來提高精子的運(yùn)動(dòng)性以及能否改善體外受精后胚胎的發(fā)育情況，特別是使用該物質(zhì)來提高牛冷凍精液的運(yùn)動(dòng)性及受精率，目前并沒有相關(guān)文件對其說明。
[0005]IFraser LR, Beyret E, Milligan SR, Adeoya-Osiguwa SA.Effectso f estrogenic xenobiotics on human and mouse spermatozoa.HumReprod.2006;21:1184-93.[0006]2Sierens Jj Hartley JA，Campbell MJj Leathern AJj Woodside JV.1n vitroisoflavone supplementation reduces hydrogen peroxide-1nduced DNA damage insperm.Teratogenesisj carcinogenesis, and mutagenesis.2002;22:227-34.[0007]3Bennetts LE, De Iuliis GN, Nixon B，Kime M，Zelski K，et al.1mpact ofestrogenic compounds on DNA integrity in human spermatozoa !evidence forcrosslinking and redox cycling activities.Mutat Res 2008;641:1-11.[0008]4Kum1-Diaka Jj Townsend J.Effects of Genistein Isoflavone (4 丨,5 f ，7-Trihydroxyisoflavone)and Dexamethasone on Functional Characteristics ofSpermatozoa.Journal of medicinal food.2001;4:39-47.[0009]5Martinez-Soto JC，de DiosHcade Jj Gutierrez-Adan A, Landeras JLj GadeaJ.Effect of genistein supplementation of thawing medium on characteristics offrozen human spermatozoa.Asian journal of andrology.2010;12:431-41.[0010]6Bajpai Mj Asin S，Doncel GF.Effect of tyrosine kinase inhibitors ontyrosine phosphorylation and motility parameters in human sperm.Archives ofandrology.2003;49:229-46.[0011]7Bajpai M，Doncel GF.1nvolvement of tyrosine kinase and cAMP-dependentkinase cross-talk in the regulation of human sperm motility.Reproduction2003:126:183-95.
【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明是為了解決因牛冷凍精液解凍后精子活性氧增加，而導(dǎo)致的精液品質(zhì)降低以及體外受精后胚胎早期發(fā)育率低的問題，提供了使用染料木黃酮提高冷凍精子運(yùn)動(dòng)能力、及時(shí)清除體外受精環(huán)境中過量的自由基，從而提高牛早期胚胎發(fā)育率及體外受精率的方法。
[0013]本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:所述使用染料木黃酮提高牛冷凍精液精子運(yùn)動(dòng)性及體外受精率的方法，依次包括牛冷凍精液的前期處理、受精前精液的獲能處理和與加入卵母細(xì)胞的受精滴進(jìn)行體外受精三個(gè)階段，其特征在于:在第一階段牛冷凍精液的前期處理中使用的SP-TALP洗滌液洗滌時(shí)向含有牛精液的SP-TALP洗滌液中加入含有I %。DMSO的染料木黃酮，或在第二階段受精前精液的獲能處理階段中向含有牛精液的IVF-TALP受精液和PHE獲能液的混合液內(nèi)加入含有1%。DMSO的染料木黃酮，或在第三階段體外受精過程中制備含有卵母細(xì)胞受精滴時(shí)加入含有IXoDMSO的染料木黃酮；其中每支牛冷凍精液的受精過程中，前兩個(gè)階段中加入含有1%oDMSO的染料木黃酮，染料木黃酮在加入液體中的終濃度為為10 μ mol/L,在第三個(gè)階段加入含有1%。DMSO的染料木黃酮，染料木黃酮在含有卵母細(xì)胞的受精滴與牛精液混合液中的終濃度均為10 μ mol/L。本發(fā)明中所用的含有1%qDMS0的染料木黃酮是由Sigma公司提供染料木黃酮和DMSO (二甲基亞砜)配制而成，其中，染料木黃酮純度大于98%。
[0014]本發(fā)明提供的一種使用染料木黃酮提高牛冷凍精液精子運(yùn)動(dòng)性及體外受精率的方法，在第一階段牛冷凍精液的前期處理中加入含有1%oDMSO的染料木黃酮的具體過程是:取一支牛冷凍精液，將其解凍后收集至離心管中以1500-2000r/min的速度離心5-8min，棄上清液，然后按照1:1的體積比加入SP-TALP洗滌液中混合均勻，并向牛精液和SP-TALP洗滌液的混合液中加入含有1%。DMSO的染料木黃酮，致使染料木黃酮在含有牛精液的SP-TALP洗滌液中的終濃度為10 μ mol/L,然后放入37°C、5%C02和100%飽和蒸汽的培養(yǎng)箱中溫育2-3個(gè)小時(shí)，然后再次收集到離心管中以1500-1700r/min的速度離心5_10min，棄上清液，保留沉淀100-120 μ L，再用IVF-TALP受精液調(diào)整精子濃度為3 X IO6個(gè)/mL~
4X IO6個(gè)/mL，之后放入37 °C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養(yǎng)箱中備用，受精前將處理好的牛精液與PHE獲能液按照體積比17:13的比例混合后并與60 μ L含有5_6枚經(jīng)體外培養(yǎng)成熟牛卵母細(xì)胞的受精滴等體積混合放入38.5°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-20h完成體外受精。
[0015]本發(fā)明提供的一種使用染料木黃酮提高牛冷凍精液精子運(yùn)動(dòng)性及體外受精率的方法，在第二階段受精前精液的獲能處理中加入含有1%。DMSO的染料木黃酮的具體過程是:取一支牛冷凍精液，將其解凍后收集至離心管中以1500-2000r/min的速度離心5-8min，棄上清液，然后按照1:1的體積比加入SP-TALP洗滌液中混合均勻后放入37°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養(yǎng)箱中溫育2-3小時(shí)，再次收集到離心管中以1500-1700r/min的速度離心5-10min，棄上清液，保留沉淀100-120 μ L，然后加入IVF-TALP受精液中調(diào)整精子的濃度為3 X IO6個(gè)/mL~4X IO6個(gè)/mL放入37°C，5%C02培養(yǎng)箱中備用，受精前，將處理好的含有牛精液的IVF-TALP受精液與PHE獲能液按照17:13的比例混合形成含有牛精液的混合獲能液，向混合獲能液內(nèi)添加含有1%。DMSO的染料木黃酮，致使染料木黃酮在含有牛精液的混合獲能液中的終濃度為10 μ mol/L,之后將其放入37°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養(yǎng)箱中備用，待卵母細(xì)胞培養(yǎng)成熟后，并與60 μ L含有5-6枚經(jīng)體外培養(yǎng)成熟牛卵母細(xì)胞的受精滴等體積混合放入38.5°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18_20h完成體外受精。
[0016]本發(fā)明提供的一種使用染料木黃酮提高牛冷凍精液精子運(yùn)動(dòng)性及體外受精率的方法，在第三階段體外受精過程中制備加入含有1%。DMSO的染料木黃酮的具體過程是:(I)取一支牛冷凍精液，將其解凍后按照正常的前期處理程序，依次經(jīng)過第一次離心棄上清液、用SP-TALP洗滌液洗滌、第二次離心棄上清液、加入IVF-TALP受精液中調(diào)整精子的濃度為3 X IO6個(gè)/mL~4X IO6個(gè)/mL，將其放入37°C，5%C02培養(yǎng)箱中備用；
[0017](2)取40-45 μ L的IVF-TALP受精液制備成受精滴，放入38.5°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養(yǎng)箱中預(yù)孵2小時(shí)，加入5-6枚經(jīng)體外培養(yǎng)成熟的牛卵母細(xì)胞后，再加入含有1%。DMSO的染料木黃酮制備成60 μ L的受精滴，60 μ L的受精滴中染料木黃酮的濃度為20 μ mol/L,然后放入38.5°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養(yǎng)箱中備用；
[0018](3)將步驟(I)中處理的含有牛精液的IVF-TALP受精液與PHE獲能液按照17:13的比例混合形成含有牛精液的混合獲能液，之后將其放入37°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養(yǎng)箱中備用；
[0019](4)將步驟(3)中獲能處理后的含有牛精液的混合獲能液與步驟(2)制備的含有卵母細(xì)胞的受精滴等體積混合，致使含有IXoDMSO的染料木黃酮在含有卵母細(xì)胞的受精滴與牛精液混合液中的終濃度為lOymol/L，然后放入38.5°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-20h完成體外受精過程。[0020]本發(fā)明進(jìn)一步提供的技術(shù)方案為:在第一階段中的含有牛精液的SP-TALP洗滌液內(nèi)加入染料木黃酮時(shí)，將濃度為200 μ mol/L的染料木黃酮的濃儲液與常含有牛精液的SP-TALP洗滌液按照體積比1:19的比例混合加入，加入后SP-TALP洗滌液中染料木黃酮濃度為10 μ mol/L, DMSO終濃度為1%0。
[0021]本發(fā)明進(jìn)一步提供的技術(shù)方案為:在第二階段含有牛精液的IVF-TALP受精液和PHE獲能液的混合液內(nèi)加入染料木黃酮時(shí)，將濃度為200 μ mol/L的染料木黃酮濃儲液、常規(guī)的IVF-TALP受精液和PHE獲能液按照體積比1.5:15.5:13的比例混合，混合后染料木黃酮的濃度為10 μ mol/L,，DMSO終濃度為1%0。
[0022]本發(fā)明進(jìn)一步提供的技術(shù)方案為:第三階段體外受精過程中制備卵母細(xì)胞受精滴時(shí)加入染料木黃酮，是先取40-45 μ L的IVF-TALP受精液制備成受精滴，將其放入38.5°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養(yǎng)箱中預(yù)孵2小時(shí)，加入5-6枚經(jīng)體外培養(yǎng)成熟的牛卵母細(xì)胞后，將濃度為200 μ mol/L的染料木黃酮濃儲液按照體積比1:9加入，使加入后受精滴含染料木黃酮20 μ mol/L,體積為60 μ L，之后將含有精子的IVF-TALP受精液和PHE獲能液以17:13的比例混合后再與含有牛卵母細(xì)胞的受精滴等體積混合，致使染料木黃酮的終濃度為 10 μ mol/L, DMSO 終濃度為 1%0。
[0023]本發(fā)明最佳的技術(shù)方案為:所述的SP-TALP洗滌液的配制方法如下:在每IOOml的純水中加入0.579g氯化鈉，0.0230g氯化鉀，0.2104g碳酸氫鈉，0.0047g磷酸二氫鈉，
0.3612g乳酸鈉，0.2975gHEPES,0.0294g氯化鈣，0.0224g氯化鎂，并混合均勻后調(diào)PH值至
7.4,然后通過孔徑為0.22μηι的過濾器進(jìn)行過濾后,再向過濾液中添加0.6316g V級的血清白蛋白、5.263mL濃度為2.2mg/mL的丙酮酸和210.53uL濃度為5mg/mL的慶大霉素進(jìn)行混合，再將混合液通過孔徑為0.22 μ m的過濾器進(jìn)行過濾后形成SP-TALP洗滌液。所述的IVF-TALP受精液的配制方法如下:在每IOOml的純水中加入0.6665g氯化鈉，0.0235g氯化鉀，0.2104g碳酸氫鈉，0.0 047g磷酸二氫鈉，0.1116g乳酸鈉，0.0294g氯化鈣，0.0102g氯化鎂，并混合均勻后調(diào)PH值至7.4，然后通過孔徑為0.22 μ m的過濾器進(jìn)行過濾后，再向過濾液中添加0.6g血清白蛋白、ImL濃度為2.2mg/mL的丙酮酸、IOOuL濃度為5mg/mL的慶大霉素和500uL肝素并混合均勻，最后將混合液通過孔徑為0.22 μ m的過濾器進(jìn)行過濾制成IVF-TALP受精液。
[0024]所述PHE獲能液是由亞?；撬崛芤骸⑶嗝顾剽c溶液和腎上腺素溶液按照體積比5:
5:2混合均勻后，再用孔徑為0.22 μ m的過濾器過濾，分裝在_20°C的環(huán)境下永久保存；其中，所述亞牛磺酸溶液是在每IOml生理鹽水中溶解1.09mg亞?；撬嶂瞥桑磺嗝顾剽c溶液是在每IOml生理鹽水中溶解3mg青霉素鈉制成；腎上腺素溶液是在每IOml生理鹽水中溶解
1.83mg腎上腺素制成。
[0025]本發(fā)明將10 μ mol/L的染料木黃酮(含I %。DMSO )分別使用在牛冷凍精液的受精前處理、體外獲能和體外受精的三個(gè)過程中，有效清除多余的自由基，減少對精子的抗氧化損傷，維持胚胎發(fā)育體系內(nèi)自由基的動(dòng)態(tài)平衡，促進(jìn)早期胚胎發(fā)育。添加在含有牛精液的SP-TALP洗滌液中，可以在5h內(nèi)維持精子活率無顯著變化；同時(shí)直線運(yùn)動(dòng)精子活率、平均路徑速度、曲線運(yùn)動(dòng)速度、直線運(yùn)動(dòng)速度和鞭打頻率均也不同程度的增加。添加在含有牛精液的IVF-TALP受精液和PHE獲能液的混合液中，可以不同程度提高直線運(yùn)動(dòng)精子活率、平均路徑速度、曲線運(yùn)動(dòng)速度、鞭打頻率和擺動(dòng)性；在體外受精的過程中添加該物質(zhì)，8-16細(xì)胞胚胎發(fā)育率比對照組提高了 9.46個(gè)百分點(diǎn)，卵裂率提高了 8.5個(gè)百分點(diǎn)，囊胚率提高了
5.22個(gè)百分點(diǎn)。
[0026]本發(fā)明將染料木黃酮在牛精子體外受精中進(jìn)行了應(yīng)用研究，在體外受精的三個(gè)階段中分別Ιθμπιο?/L的染料木黃酮，分析其對精子運(yùn)動(dòng)能力的影響，其結(jié)果表明三個(gè)階段中均可以大大提聞精子的運(yùn)動(dòng)性，精子的運(yùn)動(dòng)性是影響受:精率的關(guān)鍵，提聞了精子的運(yùn)動(dòng)性，便可以提聞精子的受:精率。
【具體實(shí)施方式】
[0027]以下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。對于本發(fā)明提供的技術(shù)方案分別提出給出三個(gè)實(shí)施例，每個(gè)實(shí)施例均以一支牛冷凍精液(采用常規(guī)的牛冷凍精液HBQ13201001，每支牛冷凍精液的體積為250 μ L)，在進(jìn)行具體實(shí)施例之前，先配制好以下物質(zhì)備用:
[0028]濃度為200 μ mol/L的染料木黃酮濃儲液的配制:取13.5mg純度大于98%的染料木黃酮(由Sigma公司提供)溶于5mL DMS0，從中取200uL溶液溶于IOmL超純水，配成200umol/L的染料木黃酮濃儲液，分裝到1.5mL的EP管中，冷凍保存。
[0029]配制SP-TALP洗滌液:稱取氯化鈉0.579g，氯化鉀0.0230g,碳酸氫鈉0.2104g,磷酸二氫鈉 0.0047g,乳酸鈉 0.3612g，HEPES0.2975g，氯化鈣 0.0294g,氯化鎂 0.0224g,超純水lOOmL，調(diào)PH值至7.4，并0.22 μ m過濾，過濾后向?yàn)V液中添加血清白蛋白(V級)0.6316g,丙酮酸5.263mL(濃度為2.2mg/mL)，慶大霉素210.53 μ L (濃度5mg/mL)，混合后再0.22 μ m過濾放在4°C的環(huán)境下保存。
[0030]配制IVF-TALP受精液:稱取氯化鈉0.6665g，氯化鉀0.0235g,碳酸氫鈉0.2104g,磷酸二氫鈉0.0047g,乳酸鈉0.1116g，氯化鈣0.0294g,氯化鎂0.0102g,超純水IOOmL,調(diào)PH值至7.4，使用孔徑為0.22 μ m的過濾器進(jìn)行過濾后，向過濾液中添加血清白蛋白(EFAF)0.6g,丙酮酸ImL (濃度為2.2mg/mL),慶大霉素100 μ L(濃度為5mg/mL),肝素500 μ L，配制成常規(guī)IVF-TALP受精液，過濾，4°C保存。
[0031]卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備:(1)從武漢市武昌區(qū)紅旗村國強(qiáng)畜禽屠宰場采集母牛卵巢，母牛宰殺后割下卵巢放入37°C含有1%雙抗的運(yùn)輸鹽(稱取9g NaCl溶于IL雙蒸水中，IOml100X雙抗制備而成，然后在4°C環(huán)境下在l_3h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，再用37°C運(yùn)輸鹽清洗若干次，放入500ml燒杯中封口，37 °C水浴保存；
[0032](2)抽卵和檢卵，抽卵時(shí)，先用滅菌紗布吸干卵巢表面的水珠，再用帶有18G針頭的IOml注射器吸取約Iml提前溫浴的檢卵液，然后抽取直徑為3_8_的卵泡，盡量避免多次穿針，抽取完后，將注射器緩慢注入提前溫浴的IOml離心管，靜止5min后，用巴氏管吸取離心管底部的沉淀物，然后注入60mm的大皿中，再加入適量的檢卵液稀釋，搖勻，最后，在40X體視鏡下優(yōu)先挑選有多層卵丘細(xì)胞包圍的卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，裸卵和深黑色卵母細(xì)胞復(fù)合體棄去；檢卵液(OCM)的配制:溶解TCM199粉末10L，稱取3.5g NaHCO3到9L雙蒸水中，加入100ml 100X雙抗，pH=7.2~7.4，定容至10L，0.22 μ m過濾，4°C永久保存。
[0033](3)體外成熟培養(yǎng)，將上述卵母細(xì)胞復(fù)合體,用卵母細(xì)胞成熟液洗滌4-5次，然后移入提前在CO2培養(yǎng)箱平衡不少于2h的成熟微滴中，每100 μ L滴放入20-30枚，38.5°C,5%C02和100%飽和蒸汽的成熟培養(yǎng)22h，成熟培養(yǎng)后觀察，在正常情況下，卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞貼壁擴(kuò)展，周圍可見成片的貼壁生長的單層顆粒體細(xì)胞。卵母細(xì)胞成熟液(OMM)的配制:量取88ml TCM199到IOOml燒杯中，分別加入22mg丙酮酸鈉，IOml FBS，Iml雙抗，0.1mg 17 β-E2 和適量的 EGF，F(xiàn)SH, 0.22 μ m 過濾，4°C保存。
[0034](4)成熟卵母細(xì)胞準(zhǔn)備，先將卵母細(xì)胞復(fù)合體移入提前溫浴的HEPES-TALP洗卵液中，用檢卵針反復(fù)吹打直至卵母細(xì)胞周圍僅有3-4層顆粒體細(xì)胞，在進(jìn)行體外受精過程時(shí)再移入在CO2培養(yǎng)箱平衡不少于2h的受精滴中，每60 μ L滴中放入5-6個(gè)卵母細(xì)胞，并移入CO2培養(yǎng)箱中備用。
[0035]實(shí)施例一:所述一種使用染料木黃酮提高牛冷凍精液精子運(yùn)動(dòng)性及體外受精率的方法，依次包括以下步驟:(I)取一支牛冷凍精液，將其解凍后收集至離心管中第一次離心并棄上清液，然后按照1:1的體積比加入之前配制好的SP-TALP洗滌液中混合均勻，然后將含有牛精液的SP-TALP洗滌液和濃度為200 μ mol/L的染料木黃酮濃儲液(含有I %。DMSO)按照體積比19:1的比例混合均勻，使含有牛精液的SP-TALP洗滌液中染料木黃酮的終濃度為lOymol/UDMSO的終濃度為1%。，然后放入37°C，5%C02培養(yǎng)箱中溫育2-3小時(shí)，其中第一次離心的離心速度為1500_2000r/min,離心時(shí)間5_8min ；
[0036](2)將步驟(I)中溫育處理后的混合液放入離心管中第二次離心并棄上清液，然后向二次離心后的留取的牛精液沉淀混合物中加入提前配制好的IVF-TALP受精液，調(diào)整精子的濃度為3X IO6個(gè)/mL~4X IO6個(gè)/mL，之后放入37°C，5%C02培養(yǎng)箱中儲存?zhèn)溆茫黄渲械诙坞x心的離心速度為1500-1700r/min，離心時(shí)間為5-10min，二次離心棄上清后留取的牛精液沉淀混合物為100-120 μ L ；
[0037](3)將步驟(2)中準(zhǔn)備的含有精子的IVF-TALP受精液與提前配制好的PHE獲能液按照17:13的比例混合后形成含有牛精液的混合獲能液，并放入37°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養(yǎng)箱中備用；
[0038](4)取40-45 μ L提前配制好的IVF-TALP受精液制備成受精滴，加入5_6枚經(jīng)體外培養(yǎng)成熟的牛卵母細(xì)胞并使受精滴體積為60 μ L，并放入溫度為38.50C，濕度為5%的CO2的培養(yǎng)箱備用；
[0039](5)將步驟(4)中制備的受精滴與步驟(3)中獲能處理后的含有牛精液的混合獲能液按照體積比1:1的比例混合后放入38.50C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-20h,并觀察記錄其精子的運(yùn)動(dòng)性和受精率。
[0040]實(shí)施例二:所述一種提高牛冷凍精液精子運(yùn)動(dòng)性及體外受精率的體外受精方法，依次包括以下步驟:(I)取一支牛冷凍精液，將其解凍后放入離心管中第一次離心并棄上清液，然后按照1:1的體積比加入提前準(zhǔn)備好的SP-TALP洗滌液中混合均勻后放入37°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養(yǎng)箱中溫育2-3小時(shí)；其中第一次離心的離心速度為1500-2000r/min,離心時(shí)間 5_8min ；
[0041](2)同實(shí)施例一；
[0042](3)將步驟(2)中準(zhǔn)備是將含有精子的IVF-TALP受精液、PHE獲能液、濃度為200 μ mol/L的染料木黃酮濃儲液按照體積比15.5:13:1.5合均勻，使混合后的獲能液中染料木黃酮的濃度為10 μ mol/L, DMSO終濃度為1%。，之后將其放入37°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養(yǎng)箱中備用；
[0043](4),(5)均同實(shí)施例一；[0044]實(shí)施例三:所述一種提高牛冷凍精液精子運(yùn)動(dòng)性及體外受精率的體外受精方法，依次包括以下步驟:(I)取一支牛冷凍精液，將其解凍后放入離心管中第一次離心并棄上清液，然后按照1:1的體積比加入提前準(zhǔn)備好的SP-TALP洗滌液中混合均勻后放入37°C，5%C02培養(yǎng)箱中溫育2-3小時(shí)；其中第一次離心的離心速度為1500-2000r/min，離心時(shí)間5_8min ；
[0045]步驟(2)、步驟(3)均同實(shí)施例一；
[0046](4 )取40-45 μ L的IVF-TALP受精液制備成受精滴，將其放入38.5 °C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養(yǎng)箱中預(yù)孵2小時(shí)，加入5-6枚經(jīng)體外培養(yǎng)成熟的牛卵母細(xì)胞后，將濃度為200 μ mol/L的染料木黃酮濃儲液按照體積比1:9加入，使加入后受精滴含染料木黃酮20 μ mol/L,體積為60 μ L，放入38.5°C，5%的CO2培養(yǎng)箱中備用；
[0047](5)將步驟(4)中制備的受精滴與步驟(3)中獲能處理后的含有牛精液的獲能混合液等體積混合，致使染料木黃酮終濃度為lOymol/L，DMSO終濃度為1%。，然后放入38.5°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18_20h，并觀察記錄其精子的運(yùn)動(dòng)性和受精率。
[0048]以上三個(gè)實(shí)施例通過觀察和記錄，精子直線運(yùn)動(dòng)精子活率、曲線運(yùn)動(dòng)速度、擺動(dòng)性和鞭打頻率均有不同程度的提高，而且體外受精的結(jié)果8-16細(xì)胞胚胎發(fā)育率比不添加該物質(zhì)提高了 9.46個(gè)百分點(diǎn)，卵裂率提高了 8.5個(gè)百分點(diǎn)，囊胚率提高了 5.22個(gè)百分點(diǎn)。
[0049]針對上述三個(gè)實(shí)施例，本發(fā)明做了關(guān)于三個(gè)階段的對比試驗(yàn)。
[0050]第一階段對比試驗(yàn) :本實(shí)驗(yàn)設(shè)定四組對比試驗(yàn)，每組對比試驗(yàn)均以一支常規(guī)冷凍精液HBQ13201001來完成整個(gè)受精過程:
[0051]第一組(對照組):按照實(shí)施例一中的步驟，不添加任何物質(zhì)完成體外受精；
[0052]第二組(染料木黃酮):按照實(shí)施例一的步驟完成體外受精；
[0053]第三組(谷胱甘肽):按照實(shí)施例一的步驟，將含有1%。DMSO的染料木黃酮替換為純度大于98%谷胱甘肽，添加量為5mmol/L ；
[0054]第四組(咖啡因):按照實(shí)施例一的步驟，將含有1%。DMSO的染料木黃酮替換為純度大于98%咖啡因，咖啡因添加量為5mmol/L ；
[0055]第二階段對比試驗(yàn):也設(shè)定四組對比試驗(yàn)，每組對比試驗(yàn)均以一支常規(guī)冷凍精液HBQ13201001來完成整個(gè)受精過程:
[0056]第一組(對照組):與對比試驗(yàn)一的對照組相同；
[0057]第二組(染料木黃酮):按照實(shí)施例二的步驟完成體外受精；
[0058]第三組(谷胱甘肽):按照實(shí)施例二的步驟，將含1%。DMSO的染料木黃酮替換為純度大于98%谷胱甘肽，添加量為5mmol/L ；
[0059]第四組(咖啡因):按照實(shí)施例二的步驟，將含1%。DMSO的染料木黃酮替換為純度大于98%咖啡因，添加量為5mmol/L ；
[0060]第三階段對比試驗(yàn):也設(shè)定四組對比試驗(yàn)，每組對比試驗(yàn)均以一支常規(guī)冷凍精液HBQ13201001來完成整個(gè)受精過程:
[0061]第一組(對照組):與對比試驗(yàn)一的對照組相同；
[0062]第二組(染料木黃酮):按照實(shí)施例三的步驟完成體外受精；
[0063]第三組(谷胱甘肽):按照實(shí)施例三的步驟，將含1%。DMSO的染料木黃酮替換為純度大于98%谷胱甘肽，添加量為5mmol/L ；
[0064]第四組(咖啡因):按照實(shí)施例三的步驟，將含1%qDMS0的染料木黃酮替換為純度大于98%咖啡因，添加量為5mmol/L。
[0065]并將三個(gè)對比試驗(yàn)的每組試驗(yàn)中體外受精后的合子用輸卵管合成液mSOF (由SOF基礎(chǔ)液加入1%雙抗和3mg/mLBSA (EFAF) ,0.22 μ m的過濾器過濾后得到，并在4°C保存。)洗滌3-5次，然后轉(zhuǎn)入與處理組對應(yīng)的在CO2培養(yǎng)箱中平衡不少于2h的胚胎發(fā)育微滴中培養(yǎng)。受精當(dāng)天記為DayO，受精后Day2統(tǒng)計(jì)卵裂率和胚胎發(fā)育滴中加入5%FBS，Day6_Day9統(tǒng)計(jì)
囊胚胎率。
[0066]在以上試驗(yàn)過程中，通過儀器對實(shí)施例一和兩個(gè)對比試驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，檢測出以下參數(shù):直線運(yùn)動(dòng)精子活率(%)、A級精子百分率(%)、B級精子百分率(%)、C級精子百分率(%)、D級精子百分率(%)、曲線運(yùn)動(dòng)速度(VCL，μ m/s)、直線運(yùn)動(dòng)速度(VSL，μ m/s)、平均路徑速度(VAP，μ m/s)、直線性 LIN (VSL/VCL, %)、擺動(dòng)性 WOB (VAP/VCL, %)、前向性 STR (VSL/VAP, %)、平均移動(dòng)角度(MAD，° )、側(cè)擺幅度(ALH，μ m)、鞭打頻率(BCF，Hz)。
[0067]第一階段對比試驗(yàn)中的四組對比試驗(yàn)中精子的活率見表1:
[0068]表1谷胱甘肽、咖啡因和染料木黃酮添加在含有牛精液的SP-TALP洗滌液中的精
子活率
[0069]
【權(quán)利要求】
1.使用染料木黃酮提高牛冷凍精液精子運(yùn)動(dòng)性及體外受精率的方法，依次包括牛冷凍精液的前期處理、受精前精液的獲能處理和與加入卵母細(xì)胞的受精滴進(jìn)行體外受精三個(gè)階段，其特征在于:在第一階段牛冷凍精液的前期處理中使用的SP-TALP洗滌液洗滌時(shí)向含有牛精液的SP-TALP洗滌液中加入含有1%。DMSO的染料木黃酮，或在第二階段受精前精液的獲能處理階段中向含有牛精液的IVF-TALP受精液和PHE獲能液的混合液內(nèi)加入含有1%。DMSO的染料木黃酮，或在第三階段體外受精過程中制備含有卵母細(xì)胞的受精滴時(shí)加入含有IXqDMSO的染料木黃酮；其中每支牛冷凍精液的受精過程中，前兩個(gè)階段中加入含有1% DMSO的染料木黃酮時(shí)，染料木黃酮在加入液體中的終濃度為10 μ mol/L ;在第三個(gè)階段加入含有IXf5DMSO的染料木黃酮時(shí)，染料木黃酮在含有卵母細(xì)胞的受精滴與牛精液混合液中的終濃度為10 μ mol/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述使用染料木黃酮提高牛冷凍精液精子運(yùn)動(dòng)性及體外受精率的方法，其特征在于在第一階段牛冷凍精液的前期處理中加入染料木黃酮的具體過程是:取一支牛冷凍精液，將其解凍后收集至離心管中以1500-2000r/min的速度離心5_8min，棄上清液，然后按照1:1的體積比加入SP-TALP洗滌液中混合均勻，并向牛精液和SP-TALP洗滌液的混合液中加入含有1%。DMSO的染料木黃酮，致使染料木黃酮在含有牛精液的SP-TALP洗滌液中的終濃度為lOymol/L，然后放入37°C、5%C02和100%飽和蒸汽的培養(yǎng)箱中溫育2-3個(gè)小時(shí)，然后再次收集到離心管中以1500-1700r/min的速度離心5_10min，棄上清液，保留沉淀100-120 μ L，再用IVF-TALP受精液調(diào)整精子濃度為3Χ IO6個(gè)/mL~4Χ IO6個(gè)/mL，之后放入37°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養(yǎng)箱中儲存?zhèn)溆?，受精前，將處理好的牛精液與PHE獲能液按照體積比17:13的比例混合后并與含有5-6枚經(jīng)體外培養(yǎng)成熟牛卵母細(xì)胞的受精滴等體積混合按照正常的受精過程進(jìn)行體外受精。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用染料木黃酮提高牛冷凍精液精子運(yùn)動(dòng)性及體外受精率的方法，其特征在于在第二階段受精前精液的獲能處理中加入含有染料木黃酮的具體過程是:取一支牛冷凍.精液，將其解凍后收集至離心管中以1500-2000r/min的速度離心5-8min，棄上清液，然后按照1:1的體積比加入SP-TALP洗滌液中混合均勻后放入37°C，5%C02培養(yǎng)箱中溫育2-3小時(shí)，再次收集到離心管中以1500-1700r/min的速度離心5-10min，棄上清液，保留沉淀100-120 J，然后加入IVF-TALP受精液中調(diào)整精子的濃度為3X IO6個(gè)/mL~4X IO6個(gè)/mL放入37°C，5%C02培養(yǎng)箱中備用，受精前，將處理好的含有牛精液的IVF-TALP受精液與PHE獲能液按照17:13的比例混合形成含有牛精液的混合獲能液，向混合獲能液內(nèi)添加含有IXoDMSO的染料木黃酮，致使染料木黃酮在含有牛精液的混合獲能液中的終濃度為10 μ mol/L,之后將其放入37°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養(yǎng)箱中備用，待卵母細(xì)胞培養(yǎng)成熟后，便可與含有5-6枚經(jīng)體外培養(yǎng)成熟牛卵母細(xì)胞的受精滴等體積混合后按照正常的受精過程進(jìn)行體外受精。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用染料木黃酮提高牛冷凍精液精子運(yùn)動(dòng)性及體外受精率的方法，其特征在于在第三階段體外受精過程中制備加入染料木黃酮的具體過程是:(I)取一支牛冷凍精液，將其解凍后按照正常的前期處理程序，依次經(jīng)過第一次離心棄上清液、用SP-TALP洗滌液洗滌、第二次離心棄上清液、加入IVF-TALP受精液中調(diào)整精子的濃度為3X IO6個(gè)/mL~4X IO6個(gè)/mL，將其放入37°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養(yǎng)箱中備用； (2 )取40-45 μ L的IVF-TALP受精液制備成受精滴，放入38.5 °C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養(yǎng)箱中預(yù)孵2小時(shí)，加入5-6枚經(jīng)體外培養(yǎng)成熟的牛卵母細(xì)胞，然后添加含有1% DMSO的染料木黃酮，制備成染料木黃酮濃度為20 μ mol/L的含有牛卵母細(xì)胞的受精滴，受精滴的體積為60uL，并放入38.50C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養(yǎng)箱中備用； (3)將步驟(I)中處理的含有牛精液的IVF-TALP受精液與PHE獲能液按照17:13的比例混合形成含有牛精液的混合獲能液，之后將其放入37°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養(yǎng)箱中備用； (4)將步驟(3)中獲能處理后的含有牛精液的混合獲能液與步驟(2)制備的含有卵母細(xì)胞的受精滴等體積混合后，致使染料木黃酮在含有卵母細(xì)胞的受精滴與牛精液混合液中的終濃度為10 μ mol/L,然后放入38.5°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18_20h完成體外受精過程。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的使用染料木黃酮提高牛冷凍精液精子運(yùn)動(dòng)性及體外受精率的方法，其特征在于:在第一階段中的含有牛精液的SP-TALP洗滌液內(nèi)加入染料木黃酮時(shí)，將濃度為200 μ mol/L的染料木黃酮的濃儲液與含有牛精液的SP-TALP洗滌液按照體積比I:19的比例混合加入，加入后SP-TALP洗滌液中染料木黃酮濃度為10 μ mol/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的使用染料木黃酮提高牛冷凍精液精子運(yùn)動(dòng)性的方法，其特征在于:在第二階段含有牛精液的IVF-TALP受精液和PHE獲能液的混合液內(nèi)加入染料木黃酮時(shí)，將濃度為200 μ mol/L的染料木黃酮濃儲液、常規(guī)的IVF-TALP受精液和PHE獲能液按照體積比1.5:15.5:13的比例混合，混合后染料木黃酮的濃度為10 μ mol/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的使用染料木黃酮提高牛冷凍精液精子運(yùn)動(dòng)性的方法，其特征在于:第三階段體外受精過程中制備卵母細(xì)胞受精滴時(shí)加入染料木黃酮是先取40-45 μ L的IVF-TALP受精液制備成受精滴，將其放入38.5°C，5%C02和100%飽和蒸汽的培養(yǎng)箱中預(yù)孵2小時(shí)，加入5-6枚經(jīng)體外培養(yǎng)成熟的牛卵母細(xì)胞后，將濃度為200 μ mol/L的染料木黃酮濃儲液按照體積比1:9加入，加入后受精滴的體積為60 μ L，之后將含有精子的IVF-TALP受精液和PHE獲能液以17:13的比例混合后再與含有牛卵母細(xì)胞的受精滴等體積混合，致使染料木黃酮的終濃度為10 μ mol/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的使用染料木黃酮提高牛冷凍精液精子運(yùn)動(dòng)性及體外受精率的方法，其特征在于所述的SP-TALP洗滌液的配制方法如下:在每100ml的純水中加入0.579g氯化鈉，0.0230g氯化鉀，0.2104g碳酸氫鈉，0.0047g磷酸二氫鈉，0.3612g乳酸鈉，0.2975gHEPES，0.0294g氯化鈣，0.0224g氯化鎂，并混合均勻后調(diào)PH值至7.4，然后通過孔徑為0.22 μ m的過濾器進(jìn)行過濾后，再向過濾液中添加0.6316g V級的血清白蛋白、5.263mL濃度為2.2mg/mL的丙酮酸和210.53uL濃度為5mg/mL的慶大霉素進(jìn)行混合，再將混合液通過孔徑為0.22 μ m的過濾器進(jìn)行過濾后形成SP-TALP洗滌液。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4使用染料木黃酮提高牛冷凍精液精子運(yùn)動(dòng)性及體外受精率的方法，其特征在于所述的IVF-TALP受精液的配制方法如下:在每100ml的純水中加入0.6665g氯化鈉，0.0235g氯化鉀，0.2104g碳酸氫鈉，0.0047g磷酸二氫鈉，0.1116g乳酸鈉，0.0294g氯化鈣，0.0102g氯化鎂，并混合均勻后調(diào)PH值至7.4，然后通過孔徑為.0.22 μ m的過濾器進(jìn)行過濾后，再向過濾液中添加0.6g血清白蛋白、ImL濃度為2.2mg/mL的丙酮酸、IOOuL濃度為5mg/mL的慶大霉素和500uL肝素并混合均勻,最后將混合液通過孔徑為0.22 μ m的過濾器進(jìn)行過濾制成IVF-TALP受精液。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4使用染料木黃酮提高牛冷凍精液精子運(yùn)動(dòng)性及體外受精率的方法，其特征在于:所述PHE獲能液是由亞?；撬崛芤?、青霉素鈉溶液和腎上腺素溶液按照體積比5:5:2混合均勻后，再用孔徑為0.22 μ m的過濾器過濾，分裝在_20°C的環(huán)境下永久保存；其中，所述亞?；撬崛芤菏窃诿縄Oml生理鹽水中溶解1.09mg亞牛磺酸制成；青霉素鈉溶液是在每IOml生理鹽水中溶解3mg青霉素鈉制成；腎上腺素溶液是在每IOml生理鹽水中溶解1.83mg腎上.腺素制成。
【文檔編號】A61D19/02GK103462724SQ201310380474
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年8月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月28日
【發(fā)明者】程蕾, 陳洪波, 胡修忠, 辛友東, 凌明湖, 劉曉華, 高揚(yáng)澤, 王定發(fā), 夏瑜 申請人:武漢市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所