Eat1基因的應(yīng)用及恢復(fù)eat1基因缺失導(dǎo)致水稻雄性不育的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】中EAT1基因的應(yīng)用及恢復(fù)EAT1基因缺失導(dǎo)致水稻雄性不育的方法；所述的EAT1基因編碼如SEQ?ID?NO.3所示的氨基酸，所述的應(yīng)用是：通過基因變異或抑制表達(dá)獲得水稻雄性不育株系并可以用來生產(chǎn)種子；本發(fā)明還涉及一種恢復(fù)EAT1基因缺失導(dǎo)致水稻雄性不育的方法，通過引物擴(kuò)增EAT1基因，使用遺傳轉(zhuǎn)化手段轉(zhuǎn)化突變體植株，能夠使得突變體恢復(fù)到野生型表型。本發(fā)明獲得的水稻突變體營養(yǎng)生長階段沒有任何異常，但純合體植株完全不育。如果應(yīng)用于雜交育種中，可以免除母本去雄的工作，大大提高生產(chǎn)效率，降低人工成本，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有重要的應(yīng)用。
【專利說明】EAT1基因的應(yīng)用及恢復(fù)EAT1基因缺失導(dǎo)致水稻雄性不育的方法
[0001]本申請是申請?zhí)枮?01210223656.0,申請日為2012.6.29，發(fā)明名稱為《水稻雄性不育株系創(chuàng)制的方法及其用途》的分案申請。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及的是一種生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】中的水稻株系創(chuàng)制的方法，具體是一種EATl基因的應(yīng)用及恢復(fù)EATl基因缺失導(dǎo)致水稻雄性不育的方法。
【背景技術(shù)】
[0003]水稻是世界上主要的糧食作物之一，更是我國最重要的糧食作物。中國是世界上最大的稻米生產(chǎn)國和消費(fèi)國，約有60%以上的國人以稻米為主食。我國水稻年播種面積超過3000萬公頃，占世界的20%，占全國糧食作物播種面積的30%;2011年，水稻總產(chǎn)量1.987億噸，占糧食總產(chǎn)量的42%，單位面積產(chǎn)量比所有糧食作物平均單產(chǎn)高出45%以上；單位面積產(chǎn)量6.35噸/公頃，比全球平均產(chǎn)量3.85噸/公頃高65%。其中一個重要因素就是雜交水稻的廣泛種植。
[0004]雄性不育系:是指一種雄性退化(主要是花粉退化)但雌蕊正常的母水稻，由于花粉無力生活，不能自花授粉結(jié)實，只有依靠外來花粉才能受精結(jié)實，因此借助這種母水稻作為遺傳工具，通過人工輔助授粉的方法，就能產(chǎn)生大量雜交種子。從育種戰(zhàn)略上看，雜交水稻的發(fā)展可以分為三系法、兩系法和一系法三個發(fā)展階段。每進(jìn)入一個新階段，都是育種上的一次突破，從而會把水稻的產(chǎn)量提高到一個新臺階?，F(xiàn)在生產(chǎn)上用的雜交水稻屬于三系法品種間雜交優(yōu)勢利用的范疇，這種三系雜交稻一般要比常規(guī)水稻增產(chǎn)20%左右，當(dāng)前仍處于方興未艾時期。但是，三系法雜交水稻種子優(yōu)勢表現(xiàn)復(fù)雜，受恢復(fù)系和保持系關(guān)系限制，使優(yōu)良組合的篩選比較困難。因此，科學(xué)家一直在篩選和培育新的不育系，以期擴(kuò)展細(xì)胞質(zhì)背景，為遠(yuǎn)緣雜交和雜種優(yōu)勢的利用奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種EATl基因的應(yīng)用及恢復(fù)EATl基因缺失導(dǎo)致水稻雄性不育的方法；本發(fā)明利用EATl基因及其蛋白參與調(diào)控水稻雄性生殖的特點，及其利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)控制水稻雄性生殖發(fā)育，通過突變該蛋白序列或抑制該蛋白的表達(dá)產(chǎn)生新的水稻雄性不育株系，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有十分重要的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明是通過以下的技術(shù)方案實現(xiàn)的，
[0007]第一發(fā)明，本發(fā)明涉及一種EATl基因的應(yīng)用，所述的EATl基因編碼如SEQ IDN0.3所示的氨基酸，所述的應(yīng)用是:通過基因變異或抑制表達(dá)獲得水稻雄性不育株系并可以用來生產(chǎn)種子。
[0008]第二方面，本發(fā)明還涉及一種恢復(fù)EATl基因缺失導(dǎo)致水稻雄性不育的方法，通過引物擴(kuò)增EATl基因，使用遺傳轉(zhuǎn)化手段轉(zhuǎn)化突變體植株，能夠使得突變體恢復(fù)到野生型表型。
[0009]優(yōu)選地，所述的EATl基因編碼如SEQ ID N0.3所示的氨基酸。
[0010]優(yōu)選地，所述方法包括如下步驟:
[0011]將含EATl互補(bǔ)構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105轉(zhuǎn)入所述水稻雄性不育株系，培育，即得；其中EATl互補(bǔ)構(gòu)建含有編碼如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；具體包括如下步驟:
[0012](a)提供攜帶表達(dá)EATl互補(bǔ)構(gòu)建載體的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens) EHA105 ；
[0013](b)將水稻細(xì)胞或組織或器官與步驟(a)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使編碼如SEQ IDN0.3所示氨基酸的核苷酸轉(zhuǎn)入水稻細(xì)胞，并且整合到水稻細(xì)胞的染色體上；
[0014](c)選擇轉(zhuǎn)入所述核苷酸的水稻細(xì)胞或組織，再生，獲得水稻植株。
[0015]本發(fā)明具有如下的有益效果:本發(fā)明通過控制水稻HLH結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子EATl基因及其編碼蛋白獲得水稻雄性生殖發(fā)育的變異株，實現(xiàn)控制水稻生殖過程；本發(fā)明獲得的水稻突變體在營養(yǎng)期與來源親本無明顯差異，進(jìn)入生殖生長階段后雄性生殖發(fā)育異常，花粉敗育，得到完全不育的植株，在雜交水稻構(gòu)建和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有十分重要的應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為pHB載體及EATl干擾構(gòu)建示意圖。
[0017]圖2為eatl突`變體植株的形態(tài)學(xué)觀察示意圖。
[0018]圖3為互補(bǔ)突變體得到野生型表型示意圖。
【具體實施方式】
[0019]下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如 Sambrook 等分子克隆:實驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
[0020]所述EATl基因為編碼如SEQ ID N0.3所示氨基酸序列的核苷酸序列。
[0021]實施例1、水稻雄性不育株系創(chuàng)制的方法
[0022]1.1通過基因工程或其他手段創(chuàng)制eatl水稻雄性不育株系
[0023]本實施例中EATl基因的編碼區(qū)序列如SEQ ID N0.3所示。本實施例的eatl突變材料是由常規(guī)粳稻品種武育粳7號(又名9522)經(jīng)過對EATl基因的RNA干擾或者序列變異獲得。
[0024]1.2水稻育性控制蛋白基因的克隆
[0025]利用發(fā)明人構(gòu)建的包含育性控制蛋白基因EATl及其突變基因eatl組成的、本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員清楚的水稻基因定位克隆(map-based cloning或position cloning)群體，按分子標(biāo)記定位于I個小的基因組片段內(nèi)，例如IOOKb內(nèi)。在此基礎(chǔ)上，用常規(guī)方法分離包含該片段的基因組DNA克隆。經(jīng)測序和進(jìn)一步的雜交鑒定確定其中一個含完整水稻雄性生殖發(fā)育控制蛋白EATI。
[0026]經(jīng)全核苷酸序列分析結(jié)果表明:水稻雄性育性EATl基因全長為3433bp (SEQ IDN0.6，包含調(diào)控區(qū)和內(nèi)含子)。經(jīng)軟件分析和cDNA克隆，其ORF如SEQ ID N0.2所示，編碼全長為464個氨基酸的水稻雄性生殖發(fā)育控制蛋白，其序列如SEQ ID N0.3所示。
[0027]1.3水稻育性控制蛋白基因的點突變
[0028]本實施例的eatl突變材料是由常規(guī)粳稻品種武育粳7號(又名9522)經(jīng)過對EATl基因的序列變異獲得，經(jīng)過對EATl突變基因eatl的序列比較，水稻雄性生殖發(fā)育控制蛋白的移碼和提前終止會使得水稻雄性生殖器官不能正常發(fā)育，造成植株不育；本實施例EATl突變基因是在編碼區(qū)的2個堿基對缺失(其序列如SEQ ID N0.4所示)引起水稻雄性生殖發(fā)育控制蛋白翻譯得提前終止和功能喪失。
[0029]1.4通過RNAi手段降低水稻品種中的EATl的表達(dá)水平
[0030]為了對EATl蛋白進(jìn)行應(yīng)用，構(gòu)建了 EATl基因RNAi的載體，并轉(zhuǎn)化野生型9522植株，以期降低EATl的表達(dá)，從而達(dá)到改變水稻育性的目的。
[0031]從水稻cDNA克隆(EAT1_EST clone)中用引物
[0032]EATl-R1-F: 5，AAGAGCTCGAATTCCCACCTTCAACATCAACTAGA3，和
[0033]EATl-R1-R:5’ AAACTAGTCTGCAGCAATAATCACATCTCGTTCGT3’
[0034]擴(kuò)增出EATl基因編碼區(qū)序列的第197位至第688位共491bp的特異性片段；將這個片段分別通過EcoRI/PstI和Sacl/Spel正反向插入連入加入含有水稻Intron序列的pBluescript SK載體；測序驗證正確，再用EcoRI和SpeI酶切切下含有EATl正反向特異性片段和Intron和片段，連入經(jīng)同樣酶切的pHB載體中(圖1)。再次測序檢驗核苷酸序列是否正確，成功構(gòu)建pHB-EATl-RNAi質(zhì)粒。
`[0035]將含有EATl基因RNA干擾構(gòu)建的農(nóng)桿菌在含有Kan (50 μ g/ μ I)的YEB平板上劃線，獲的單菌落。挑單菌落接種到3ml含抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中于28°C振蕩培養(yǎng)過夜，第2天按1%接種量轉(zhuǎn)接入50ml含抗生素的AB液體培養(yǎng)基中，200rpm繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6至0.8左右時，將新鮮的農(nóng)桿菌菌液于5000rpm、4離心5分鐘，收集并重懸于1/3體積的AAM液體培養(yǎng)基中，此時即可用于轉(zhuǎn)化水稻各種受體材料。
[0036]本實施例采用常規(guī)的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化水稻9522的幼胚愈傷。取授粉后12_15天的9522未成熟種子經(jīng)70%乙醇浸泡I分鐘后，于NaClO溶液中(與水1:3混合，加2_3滴吐溫20)消毒90分鐘以上，用無菌水沖洗4-5次，然后用解剖刀和鑷子挑出幼胚并接種月N6D2培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織，在26± I°C、避光條件下培育，4天后可用于轉(zhuǎn)化。將幼胚愈傷浸泡入新鮮的AAM農(nóng)桿菌菌液中并不時搖動，20分鐘后將水稻材料移出，在無菌濾紙上吸去過多的菌液，隨即轉(zhuǎn)移到N6D2C培養(yǎng)基上，于26°C共培養(yǎng)3天。共培養(yǎng)時，在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入乙酰丁香酮，使用濃度為ΙΟΟμΜ。3天后，從共培養(yǎng)培養(yǎng)基上取出愈傷組織，切去胚芽并轉(zhuǎn)入含有25mg/L Hyg的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇培養(yǎng)。7_12天后將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)到含有50mg/L Hyg的選擇培養(yǎng)基上繼續(xù)篩選。10-12天后生長旺盛的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到預(yù)分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)一周左右，再移至分化培養(yǎng)基上分化(12小時光照/天)。再生的小苗在1/2Μ\Η培養(yǎng)基上生根壯苗，隨后移入人工氣候室營養(yǎng)液栽培。
[0037]獲得的再生植株移栽成活后以除草劑再次篩選轉(zhuǎn)化植株；陽性植株提取葉片總DNA，經(jīng)PCR進(jìn)一步鑒定轉(zhuǎn)化植株。RT-PCR分析陽性植株中EATl基因的表達(dá)水平，表達(dá)水平降低到野生型20%以下為有效RNA干擾植株。
[0038]1.5ΕΑΤ1蛋白活性喪失或表達(dá)水平導(dǎo)致水稻雄性發(fā)育異常[0039]對eatl突變體植株的形態(tài)學(xué)觀察。如圖2，野生型和突變型eatl的表型對比顯示，野生型花藥發(fā)育成熟期花藥呈黃色(B)，其中含有豐富的淀粉粒可被I2/KI染成藍(lán)色(Α，B,C)，而eatl突變型花藥較野生型略小，呈淡黃色；與野生型花藥成熟期相對應(yīng)的時期已經(jīng)幾乎觀察不到花粉粒，剖開藥室腔只能看到少數(shù)退化的小孢子殘留物，更無法被I2/KI著色。
[0040]1.6EATl 表達(dá)特征
[0041]利用eatl突變株的來源親本9522各個器官組織，提取RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA第一鏈，利用熒光定量PCR的方法確定EATl基因的表達(dá)模式(如圖3)，發(fā)現(xiàn)EATl基因在水稻雄性生殖發(fā)育時期有著廣泛且顯著的表達(dá)；除此之外，營養(yǎng)發(fā)育過程中的根、莖和葉中也有極微弱的表達(dá)。
[0042]1.7EAT1基因在創(chuàng)制其他水稻品系雄性不育株系中的應(yīng)用
[0043]將eat I突變體與秈稻品種9311、龍?zhí)馗驈V陸矮4號水稻品系雜交，在F2代中具有秈型特征的植株中均出現(xiàn)了雄性不育株系，符合3:1分離規(guī)律，進(jìn)而證明EATl基因在其他水稻品種中發(fā)生核苷酸序列變化時，同樣可以產(chǎn)生雄性不育植株。[0044]實施例2eatl突變體在水稻制種中的用途
[0045]將eatl突變體作為父本與三系或兩系雜交組合中的不育親本雜交，得到Fl代。在F2代中篩選同時具有雄性不育及不育特征的植株，將該植株與原不育親本對應(yīng)的保持系雜交。再次在F2代中篩選同時具有雄性不育及不育特征的植株與保持系雜交，經(jīng)多代雜交篩選后獲得新的雄性不育不育系，適宜作為雜交組合中的母本。
[0046]實施例3恢復(fù)eatl突變體雄性不育性狀的方法
[0047]將編碼EATl基因的基因組核苷酸序列轉(zhuǎn)入突變體eatl植株，能夠使突變體恢復(fù)到野生型表型。
[0048]從水稻日本晴BAC克隆(0SJNba0093F12)中用引物:
[0049]EATl-COM-F: 5，AAAAGTCGACCCGAACTGCCGTCTTAATGT3，和
[0050]EAT1-COM-R: 5，AAAAGGTGACCGCAGTGACCAGATTGAGATAAC3，
[0051]擴(kuò)增出EATl基因的5225bp的基因組序列片段。
[0052]將該片段通過SalI和BstEII插入到用于轉(zhuǎn)化水稻的雙元載體pCAMBIA1301載體中；測序驗證正確，該載體通過電擊導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105，得到EATl互補(bǔ)根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105,使用遺傳轉(zhuǎn)化手段轉(zhuǎn)化突變體eatl和野生型9522成熟胚愈傷，以觀察是否會使突變體恢復(fù)到野生型表型。Ttl代獲得互補(bǔ)植株，Ttl代互補(bǔ)植株可以產(chǎn)生花粉，并被I2/KI染色，即表現(xiàn)出的野生型表型。
[0053]綜上所述，本發(fā)明通過控制水稻HLH結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子EATl基因及其編碼蛋白獲得水稻雄性生殖發(fā)育異常的變異株，實現(xiàn)控制水稻雄性生殖發(fā)育和育性；本發(fā)明獲得的水稻突變體在營養(yǎng)生長時期與來源親本無明顯差異，進(jìn)入生殖生長階段后，雄性生殖器官發(fā)育異常、花粉敗育引起植株不育，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有十分重要的應(yīng)用。
【權(quán)利要求】
1.一種EATl基因的應(yīng)用，其特征在于，所述的EATl基因編碼如SEQ ID N0.3所示的氨基酸，所述的應(yīng)用是:通過基因變異或抑制表達(dá)獲得水稻雄性不育株系并可以用來生產(chǎn)種子。
2.一種恢復(fù)EATl基因缺失導(dǎo)致水稻雄性不育的方法，其特征在于，通過引物擴(kuò)增EATl基因，使用遺傳轉(zhuǎn)化手段轉(zhuǎn)化突變體植株，能夠使得突變體恢復(fù)到野生型表型。
3.如權(quán)利要求2所述的恢復(fù)EATl基因缺失導(dǎo)致水稻雄性不育的方法，其特征在于，所述的EATl基因編碼如SEQ ID N0.3所示的氨基酸。
4.如權(quán)利要求2所述的恢復(fù)EATl基因缺失導(dǎo)致水稻雄性不育的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟:
將含EATl互補(bǔ)構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105轉(zhuǎn)入所述水稻雄性不育株系，培育，即得；其中EATl互補(bǔ)構(gòu)建含有編碼如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；具體包括如下步驟: (a)提供攜帶表達(dá)EATl互補(bǔ)構(gòu)建載體的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105 ； (b)將水稻細(xì)胞或組織或器官與步驟(a)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使編碼如SEQID N0.3所示氨基酸的核苷酸轉(zhuǎn)入水稻細(xì)胞，并且整合到水稻細(xì)胞的染色體上； (c)選擇轉(zhuǎn)入所述核苷酸的水稻細(xì)胞或組織，再生，獲得水稻植株。
【文檔編號】A01H5/00GK103602657SQ201310383378
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2012年6月29日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月29日
【發(fā)明者】張大兵, 牛寧寧, 羅治靖, 陳明姣, 袁政, 梁婉琪 申請人:上海交通大學(xué)