以玉米胚珠為受體的轉(zhuǎn)基因方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種以玉米胚珠為受體的轉(zhuǎn)基因方法，屬于植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，應(yīng)用農(nóng)桿菌侵染介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化原理，以授粉后的玉米胚珠為受體，在靠近珠孔的位置刺穿胚珠壁后，將含有目標(biāo)基因的農(nóng)桿菌侵染液滴入胚珠，經(jīng)過共培養(yǎng)、幼胚誘導(dǎo)、分化再生、生根、分子鑒定等步驟，最終獲得轉(zhuǎn)基因玉米植株。其不但可以有效解決傳統(tǒng)玉米轉(zhuǎn)基因方法存在的基因型有限、組織培養(yǎng)操作繁瑣、轉(zhuǎn)化周期長(zhǎng)等技術(shù)難題，而且具有轉(zhuǎn)基因植株可育性提高、目標(biāo)基因高效表達(dá)及穩(wěn)定遺傳等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)玉米基因工程的理論研究和遺傳育種實(shí)踐均具有重大意義。
【專利說明】以玉米胚珠為受體的轉(zhuǎn)基因方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明具體涉及一種以玉米胚珠為受體的轉(zhuǎn)基因方法，屬于植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]玉米是我國(guó)主要的糧食作物之一。一直以來，玉米產(chǎn)量的增長(zhǎng)很大程度上依賴于玉米育種水平的不斷提高，但是傳統(tǒng)育種技術(shù)已不能滿足當(dāng)前玉米生產(chǎn)對(duì)優(yōu)良品種的需求。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，利用轉(zhuǎn)基因方法將優(yōu)良性狀基因?qū)胗衩?，大大縮短育種時(shí)間，對(duì)玉米品種的遺傳改良具有重要意義(玉米科學(xué)，2011/19(5)//64飛7)。目前，以幼胚為受體的傳統(tǒng)玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系存在兩個(gè)技術(shù)難題:第一，玉米遺傳轉(zhuǎn)化僅限于H99、A188等少數(shù)幾個(gè)能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生胚性愈傷組織的基因型，并且這幾個(gè)適于轉(zhuǎn)化的自交系農(nóng)藝性狀較差，優(yōu)良性狀基因應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)需經(jīng)多代雜交及回交，這嚴(yán)重減緩了玉米轉(zhuǎn)基因育種進(jìn)程(Plant Cell Tiss Organ Cul，2007/91//201~214);第二，胚性愈傷組織的激素誘導(dǎo)、除草劑篩選等繁瑣的組培步驟會(huì)導(dǎo)致高水平的體細(xì)胞變異，造成轉(zhuǎn)基因的低水平表達(dá)和不穩(wěn)定遺傳(Mol Breed/2004/13//20r208)o為了解決上述技術(shù)難題，近年來開展了以受精卵細(xì)胞作為受體系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因研究。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，植物受精卵細(xì)胞處于未形成細(xì)胞壁的類似“原生質(zhì)體”狀態(tài)，此時(shí)DNA復(fù)制、分離和重組較為活躍，以此為受體開展遺傳轉(zhuǎn)化，不但易于外源基因整合，而且轉(zhuǎn)基因植株能夠隨受精卵發(fā)育直接再生，進(jìn)而縮短轉(zhuǎn)基因植株獲得、避免基因型限制的問題(GM Crops，2010/1//276^287 )。
[0003]在玉米轉(zhuǎn)基因方面，以受精卵細(xì)胞作為受體開展遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)展較大的是花粉管通道法和子房注射法，但由于牽涉到機(jī)制稍顯復(fù)雜的植物雙受精過程，轉(zhuǎn)化處理?xiàng)l件不易優(yōu)化，這使得這兩種轉(zhuǎn)化方法在外源基因?qū)爰罢戏矫婢哂幸欢ǔ潭鹊拿つ啃?，并且可重?fù)性不高(Plant Physiol，2`000/124//1540~1547)。解剖學(xué)研究表明受精卵細(xì)胞位于玉米胚珠頂部的珠孔端(In Vitro Cell Dev Biol Plant，2003/39//437~442)，以此為依據(jù)，將授粉后的離體玉米胚珠作為轉(zhuǎn)化受體，并直接在珠孔位置進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染，外源基因就可以準(zhǔn)確進(jìn)入胚珠并整合到受精卵基因組，因此更具有實(shí)用性和可操作性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種以玉米胚珠為受體的轉(zhuǎn)基因方法，其解決了傳統(tǒng)玉米轉(zhuǎn)基因方法存在的基因型有限、組織培養(yǎng)操作繁瑣、轉(zhuǎn)化周期長(zhǎng)等技術(shù)難題，而且具有轉(zhuǎn)基因植株可育性提高、目標(biāo)基因高效表達(dá)及穩(wěn)定遺傳等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)玉米基因工程的理論研究和遺傳育種實(shí)踐均具有重大意義。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:以玉米胚珠為受體的轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于具體步驟如下:
I)農(nóng)桿菌侵染液的制備:挑取含目標(biāo)基因的農(nóng)桿菌單菌落接種于YEP液體培養(yǎng)基中，在28°C，180rpm振蕩培養(yǎng)過夜，4000rpm，4°C離心IOmin后收集菌體，重懸于pH 5.2的侵染培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)菌液濃度至0D_ = 0.3-0.4后存于4°C備用；
2)玉米胚珠受體的分離:玉米雌穗抽絲前套袋，在花絲已抽出5-lOcm時(shí)自花授粉，于花絲授粉后24h取下雌穗，首先用70%酒精擦拭苞葉，并小心剝開內(nèi)部苞葉，然后把雌穗在
1.5%次氯酸鈉中浸泡15min，無菌水至少洗3次；在超凈工作臺(tái)上用解剖刀將雌穗在麥芽糖溶液(90 gl)中取下中部胚珠，用直徑為0.4mm的注射針在胚珠壁靠近珠孔的位置刺穿胚珠壁；
3)農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化與培養(yǎng):將10μ1農(nóng)桿菌侵染液置于胚珠表面,侵染5min后，吸除表面多余菌液；將農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化后的胚珠轉(zhuǎn)入PH 5.8的共培養(yǎng)培養(yǎng)基，每個(gè)培養(yǎng)皿約接種25個(gè)胚珠，23°C暗培養(yǎng)3天；共培養(yǎng)階段結(jié)束后，將胚珠轉(zhuǎn)移到pH 5.8的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，25°C光照培養(yǎng)1-2周，光/暗周期為16/8h，直至小苗出現(xiàn)主莖；將小苗轉(zhuǎn)移到pH 5.8的生根培養(yǎng)基，經(jīng)25°C光照培養(yǎng)2-4周，光/暗周期為16/8h，當(dāng)小苗長(zhǎng)至IOcm時(shí)，移栽至帶土的花盆中；
4)轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定:采用PCR或Southern雜交檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株，將陽性植株在溫室中培養(yǎng)至成熟。
[0006]所述的侵染培養(yǎng)基的組分如下:1/2 N6大量，1/2 B5微量，MS維生素，0.001 g/I水解酪蛋白，0.7 g/Ι脯氨酸，0.15 g/Ι肌醇，68.4 g/Ι蔗糖，36 g/Ι葡萄糖，0.5 g/12-N-嗎啉-乙基磺酸，0.001 g/Ι玉米素，0.01962 g/Ι乙酰丁香酮，0.1%植物表面活性劑Silwet-L77。
[0007]所述的共培養(yǎng)培養(yǎng)基的組分如下:1/2 N6大量，1/2 B5微量，MS維生素，0.001g/Ι水解酪蛋白，0.7 g/Ι脯氨酸，0.15 g/Ι肌醇，150 g/Ι蔗糖，0.5 g/1 2_N_嗎啉-乙基磺酸，0.001 g/Ι玉米素，0.03924 g/Ι乙酰丁香酮，3g/l植物凝膠。
`[0008]所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組分如下:N6大量，B5微量，MS維生素，I g/Ι水解酪蛋白，0.7 g/Ι 脯氨酸，0.15 g/Ι 肌醇，150 g/Ι 蔗糖，0.5 g/1 2_N_ 嗎啉-乙基磺酸，0.001 g/I玉米素，0.25 g/Ι羧芐青霉素，0.0015 g/Ι雙丙氨膦，3 g/Ι植物凝膠。
[0009]所述的再生培養(yǎng)基的組分如下:N6大量，B5微量，MS維生素，0.25 g/Ι水解酪蛋白，0.7 g/Ι脯氨酸，0.15 g/Ι肌醇，60 g/Ι蔗糖，0.5 g/1 2_N_嗎啉-乙基磺酸，0.001g/Ι玉米素，0.003 g/Ι雙丙氨膦，3 g/Ι植物凝膠。
[0010]所述的生根培養(yǎng)基的原料組成如下:N6大量，B5微量，MS維生素，0.25 g/Ι水解酪蛋白，30 g/Ι蔗糖，0.5 g/1 2-N-嗎啉-乙基磺酸，0.003 g/Ι雙丙氨膦，3g/l植物凝膠。
[0011]本發(fā)明的積極效果是1、以授粉后胚珠作為受體的玉米轉(zhuǎn)基因方法不受基因型限制、適用性較廣，解決了以幼胚為受體的玉米轉(zhuǎn)基因方法僅限于少數(shù)幾個(gè)基因型的技術(shù)難題，顯著縮短玉米轉(zhuǎn)基因周期，加快玉米轉(zhuǎn)基因育種進(jìn)程；
2、轉(zhuǎn)化受體玉米胚珠能夠直接形成幼胚并再生分化出高質(zhì)量轉(zhuǎn)基因植株，有效避開了以幼胚為受體玉米轉(zhuǎn)基因操作的組織培養(yǎng)周期較長(zhǎng)、體細(xì)胞變異水平較高等問題，具有轉(zhuǎn)基因植株可育性提聞、目標(biāo)基因聞效表達(dá)及穩(wěn)定遺傳等優(yōu)點(diǎn)；
3、由于玉米的珠孔位于胚珠頂端，而卵細(xì)胞恰恰位于珠孔端，因此直接在珠孔位置進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化，能夠顯著增加外源基因?qū)氩⒄现潦芫鸦蚪M的概率，降低花粉管通道法、子房注射法等玉米轉(zhuǎn)基因方法在外源基因?qū)爰罢戏矫娴拿つ啃裕?、操作步驟簡(jiǎn)便高效易于掌握，省時(shí)省力可重復(fù)性高，無需昂貴儀器設(shè)備，適于大規(guī)模、產(chǎn)業(yè)化玉米轉(zhuǎn)基因育種。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1玉米子房(a)與胚珠(b)剖面圖箭頭所指為胚珠壁靠近珠孔的刺穿位置。
[0013]圖2農(nóng)桿菌侵染玉米胚珠3 (a)、9 (b)、15 (c)、21 (d)天后幼胚的發(fā)育與轉(zhuǎn)基因過程。
[0014]圖3農(nóng)桿菌侵染玉米胚珠后獲得的幼胚再生分化為轉(zhuǎn)基因植株。
[0015]圖4轉(zhuǎn)基因植株的PCR分子鑒定結(jié)果M:marker ;+:pTF102質(zhì)粒(陽性對(duì)照)；-:未轉(zhuǎn)化植株(陰性對(duì)照)；1-16:轉(zhuǎn)基因植株(To-19,36,43,97,106,111,151,200,226,229,231，248，259，261，265，267)，其中 2、3、8、9、11、15 為轉(zhuǎn)基因陰性植株，1、4、5、6、7、10、12、13、14、16為轉(zhuǎn)基因陽性植株。
[0016]圖5轉(zhuǎn)基因植株的Southern雜交分子鑒定結(jié)果 WT:未轉(zhuǎn)化植株(陰性對(duì)照)；
1-4:隨機(jī)選擇的4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系。
【具體實(shí)施方式】
[0017]通過以下實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，并不以任何方式限制本發(fā)明，在不背離本發(fā)明的技術(shù)解決方案的前提下，對(duì)本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實(shí)現(xiàn)的任何改動(dòng)或者改變都將落入本發(fā)明的權(quán)利要求范圍內(nèi)。
[0018]實(shí)施例:利用以玉米胚珠`為受體的轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)化自交系
(I)培養(yǎng)基的配制
本發(fā)明所用的培養(yǎng)基列在表1中。
[0019]表1以玉米胚珠為受體的轉(zhuǎn)基因方法涉及到的培養(yǎng)基
【權(quán)利要求】
1.以玉米胚珠為受體的轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于具體步驟如下: 1)農(nóng)桿菌侵染液的制備:挑取含目標(biāo)基因的農(nóng)桿菌單菌落接種于YEP液體培養(yǎng)基中，在28°C，180rpm振蕩培養(yǎng)過夜，4000rpm，4°C離心IOmin后收集菌體，重懸于pH 5.2的侵染培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)菌液濃度至OD_ = 0.3-0.4后存于4°C備用； 2)玉米胚珠受體的分離:玉米雌穗抽絲前套袋，在花絲已抽出5-lOcm時(shí)自花授粉，于花絲授粉后24h取下雌穗，首先用70%酒精擦拭苞葉，并小心剝開內(nèi)部苞葉，然后把雌穗在1.5%次氯酸鈉中浸泡15min，無菌水至少洗3次；在超凈工作臺(tái)上用解剖刀將雌穗在麥芽糖溶液(90 gl)中取下中部胚珠，用直徑為0.4mm的注射針在胚珠壁靠近珠孔的位置刺穿胚珠壁； 3)農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化與培養(yǎng):將10μ1農(nóng)桿菌侵染液置于胚珠表面,侵染5min后，吸除表面多余菌液；將農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化后的胚珠轉(zhuǎn)入PH 5.8的共培養(yǎng)培養(yǎng)基，每個(gè)培養(yǎng)皿約接種25個(gè)胚珠，23°C暗培養(yǎng)3天；共培養(yǎng)階段結(jié)束后，將胚珠轉(zhuǎn)移到pH 5.8的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，25°C光照培養(yǎng)1-2周，光/暗周期為16/8h，直至小苗出現(xiàn)主莖；將小苗轉(zhuǎn)移到pH 5.8的生根培養(yǎng)基，經(jīng)25°C光照培養(yǎng)2-4周，光/暗周期為16/8h，當(dāng)小苗長(zhǎng)至IOcm時(shí)，移栽至帶土的花盆中； 4)轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定:采用PCR或Southern雜交檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株，將陽性植株在溫室中培養(yǎng)至成熟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以玉米胚珠為受體的轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于所述的侵染培養(yǎng)基的組分如下:1/2 N6大量，1/2 B5微量，MS維生素，0.001 g/Ι水解酪蛋白，0.7 g/1脯氨酸，0.15 g/Ι肌醇，68.4 g/Ι蔗糖，36 g/Ι葡萄糖，0.5 g/1 2_N_嗎啉-乙基磺酸，0.001 g/Ι玉米素，0.01962 g/Ι乙酰丁香酮，0.1%植物表面活性劑Silwet_L77。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以玉米胚珠為受體的轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于所述的共培養(yǎng)培養(yǎng)基的組分如下:1/2 N6大量，1/2 B5微量，MS維生素，0.001 g/Ι水解酪蛋白，0.7 g/I脯氨酸，0.15 g/Ι肌醇，150 g/Ι蔗糖，0.5 g/1 2_N_嗎啉-乙基磺酸，0.001 g/Ι玉米素，0.03924 g/Ι乙酰丁香酮，3g/l植物凝膠。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以玉米胚珠為受體的轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組分如下:N6大量，B5微量，MS維生素，I g/Ι水解酪蛋白，0.7 g/Ι脯氨酸，0.15g/Ι肌醇，150 g/Ι蔗糖，0.5 g/1 2-N-嗎啉-乙基磺酸，0.001 g/Ι玉米素，0.25 g/Ι羧芐青霉素，0.0015 g/Ι雙丙氨膦，3 g/Ι植物凝膠。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以玉米胚珠為受體的轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于所述的再生培養(yǎng)基的組分如下:N6大量，B5微量，MS維生素，0.25 g/Ι水解酪蛋白，0.7 g/Ι脯氨酸，0.15 g/Ι 肌醇，60 g/Ι 蔗糖，0.5 g/1 2-N-嗎啉-乙基磺酸，0.001 g/Ι 玉米素，0.003g/Ι雙丙氨膦，3 g/Ι植物凝膠。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以玉米胚珠為受體的轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于所述的生根培養(yǎng)基的原料組成如下:N6大量，B5微量，MS維生素，0.25 g/Ι水解酪蛋白，30 g/Ι蔗糖，0.5 g/1 2-N-嗎啉-乙基磺酸，0.003 g/Ι雙丙氨膦，3g/l植物凝膠。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK103497970SQ201310395028
【公開日】2014年1月8日 申請(qǐng)日期:2013年9月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月4日
【發(fā)明者】陳亮, 賀紅霞, 叢媛媛, 郝東云 申請(qǐng)人:吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院