火木層孔菌中1,2-桉烷型倍半萜在抗禽流感h5n1病毒上的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從火木層孔菌Phellinus?igniarius(L?ex?Fr)Quel（裂蹄木層孔菌phellinus?linteus(Berk?et?Curt)Teng、鮑氏層孔菌Phellinus?baumii、哈蒂針層孔菌Phellinus?hartigii(Allesch?et?Schnabl)Imaz）發(fā)酵液和子實(shí)體中分離的具有抗禽流感活性的1,2-桉烷型倍半萜。本發(fā)明首次公開了1,2-桉烷型倍半萜的一種新活性，證明其具有抗禽流感作用。本方法較一般化合物應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)在于：發(fā)現(xiàn)了這種特殊的1,2-桉烷型倍半萜新活性，具有抗禽流感病毒的作用。
【專利說明】火木層孔菌中1,2-桉烷型倍半萜在抗禽流感H5N1病毒上的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種抗禽流感H5N1病毒的火木層孔菌中活性物質(zhì)的提取制備方法，尤其涉及的火木層孔菌菌種，已于2013年8月26日保藏在北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，分類名稱:火木層孔菌Phellinus igniarius,保藏編號為CGMCC N0.8108。
【背景技術(shù)】
[0002]倍半職(sesquiterpenes)是指分子中含15個碳原子的天然職類化合物。倍半職類化合物分布較廣，在木蘭目(magnoliales)、蕓香目(rutales)、山茱萸目(cornales)及菊目(asterales)植物中最豐富。在植物體內(nèi)常以醇、酮、內(nèi)酯等等形式存在于揮發(fā)油中，是揮發(fā)油中高沸點(diǎn)部分的主要組成部分。多具有較強(qiáng)的香氣和生物活性，是醫(yī)藥、食品、化妝品工業(yè)的重要原料。
倍半萜類化合物較多，無論從數(shù)目上還是從結(jié)構(gòu)骨架的類型上看，都是萜類化合物中最多的一支。倍半萜化合物多按其結(jié)構(gòu)的碳環(huán)數(shù)分類，例如無環(huán)型、單環(huán)型、雙環(huán)型、三環(huán)型和四環(huán)型。亦有按環(huán)的大小分類，如五、六、七元環(huán)，直到十一元大環(huán)都有。如按倍半萜結(jié)構(gòu)的含氧基分類，則便于認(rèn)識它們的理化性質(zhì)和生理活性，例如倍半萜醇、醛、內(nèi)酯等。
[0003]I, 2-桉烷型倍半萜具有抗菌等多種重要的生理活性，如今，未見到有抗情流感病毒活性的報到。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明公開了一種從藥用菌中分離的具有抗禽流感活性的1，2-桉烷型倍半萜。本發(fā)明首次公開了 1，2-桉烷型倍半`萜的一種新活性，測定了其對MDCK細(xì)胞的最大無毒濃度，證明其具有抗禽流感H5N1病毒的作用。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
首先制備火木層孔菌粗提物，由下述方法制得:
(1)發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計(jì)是:
玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5%
蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5%
硫酸鎂 0.1-0.5%磷酸二氫鉀0.01-0.05%
(2)將火木層孔菌菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶內(nèi)，以20~35°C溫度，搖瓶轉(zhuǎn)速為80~280r/min，pH 3~8條件下，震動培養(yǎng)7~15天；培養(yǎng)中當(dāng)pH值降到2.5~4時，將搖瓶中的種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度20~35°C，發(fā)酵罐壓力0.1~0.2公斤/平方厘米，pH 3~8，通氣量0.5~1.lvvm,攪拌速度100~280轉(zhuǎn)/分的條件，培養(yǎng)7~15天，即可利用火木層孔菌菌絲體發(fā)酵全液制備火木層孔菌粗提物。
[0006](3)取步驟(2)中所得火木層孔菌菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/2~1/5 ；
(4)用體積百分比為60~95%的乙醇對上述步驟(3)濃縮后的發(fā)酵液進(jìn)行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的2~8倍，能夠使提取液中乙醇濃度達(dá)到60~90%，乙醇優(yōu)選為濃度65-95%的食用乙醇，所用體積優(yōu)選為濃縮液體積的3-6倍；
(5)對步驟(4)所得提取液在50~70°C條件下，加熱I~2小時；以常規(guī)方法進(jìn)行分離，并通過二級過濾除去雜質(zhì)，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5~1/10 ；
(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進(jìn)行干燥，得火木層孔菌粗提物。
[0007]然后從火木層孔菌粗提物中制備1，2-桉烷型倍半萜，步驟如下:火木層孔菌粗提物一正相硅膠層析一氯仿與甲醇梯度洗脫一TLC檢測一正相硅膠層析一氯仿甲醇凝膠層析一TLC檢測一正相硅膠層析一TLC檢測一減壓蒸干一無色油狀物(1，2-桉烷型倍半萜)。
[0008]具體方法為:
(1)制備火木層孔菌粗提物；
(2)將步驟(1)所得的沉淀物與正相硅膠混勻攪拌，干燥后進(jìn)行硅膠正相柱層析，使用洗脫劑洗脫2-5次，得到洗脫液；
(3)將步驟(2)中最后一次洗脫液蒸干，等體積硅膠拌樣，進(jìn)行正相硅膠層析，使用洗脫劑洗脫；` (4)收集步驟(3)中的洗脫液，減壓濃縮，使用氯仿:甲醇=1:1溶解，進(jìn)行甲醇凝膠柱層析，使用洗脫劑洗脫，使用TLC檢測收集的洗脫液，適當(dāng)合并洗脫液，減壓干燥；
(5)將步驟(4)中得到的產(chǎn)物進(jìn)行再次進(jìn)行正相硅膠層析，使用洗脫劑洗脫；
(6)收集步驟(5)得到的洗脫液，使用TLC檢測各洗脫液，適度合并洗脫液，減壓干燥，即為1,2-桉燒型倍半職。
[0009]優(yōu)選的，提取步驟(2)中所述的硅膠為100-200目正相硅膠，層析硅膠為正相200-300目，洗脫劑為氯仿和/或甲醇；
提取步驟(3)中所述的硅膠用量為1-3倍體積，洗脫劑為石油醚與丙酮；
提取步驟(4)中所述的凝膠為S^hadex LH-20，洗脫劑為氯仿:甲醇=1:1~1:3 ;
提取步驟(5)所述的層析硅膠為200-300目，洗脫劑為氯仿:甲醇=100:1-50:1 ;
提取步驟(6)中TLC檢測要點(diǎn)是出現(xiàn)斑點(diǎn)，展開劑為石油醚:丙酮=30:1-35:1。
[0010]然后使用得到的1，2-桉烷型倍半萜進(jìn)行對MDCK細(xì)胞毒性的測定，確定其半數(shù)中毒濃度(CC5tl)及最大安全濃度；
最后在最大安全濃度范圍內(nèi)進(jìn)行樣品在MDCK細(xì)胞水平上對H5N1毒株的作用，計(jì)算樣品的半數(shù)毒性濃度(CC5tl)和半數(shù)有效濃度(EC5tl),得到樣品的選擇指數(shù)(SI)=CC5tl / EC50,計(jì)算抑制率。
[0011]本發(fā)明的顯著優(yōu)勢:本方法采用多種層析技術(shù)相結(jié)合，可以精致到結(jié)構(gòu)明確，純度大于95%的1，2-桉烷型倍半萜。技術(shù)路線成熟明確、高效精確，并首次證明了其具有抗禽流感H5N1病毒的活性。
[0012](四)【具體實(shí)施方式】 實(shí)例1:火木層孔菌粗提物，由下述方法制得:
(1)發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計(jì)是:
玉米淀粉 1%葡萄糖 1%
蛋白胨 0.1%酵母膏 0.1%
硫酸鎂 0.1%磷酸二氫鉀0.01%
(2)將火木層孔菌菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶內(nèi)，以25°C溫度，搖瓶轉(zhuǎn)速為110r/min，pH 7條件下，震動培養(yǎng)7天；培養(yǎng)中當(dāng)PH值降到3時，將搖瓶中的種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度25°C，發(fā)酵罐壓力0.1公斤/平方厘米，pH 3，通氣量0.5-1.lvvm，攪拌速度100轉(zhuǎn)/分的條件，培養(yǎng)7天，即可利用火木層孔菌菌絲體發(fā)酵全液制備火木層孔菌粗提物。
[0013](3)取步驟(2)中所得火木層孔菌菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/3 ；
(4)用體積百分比為70%的乙醇對上述步驟(3)濃縮后的發(fā)酵液進(jìn)行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的5倍，能夠使提取液中乙醇濃度達(dá)到55% ；
(5)對步驟(4)所得提取液在70°C條件下，加熱I小時；以常規(guī)方法進(jìn)行分離，并通過二級過濾除去雜質(zhì)，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5 ；
(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進(jìn)行干燥，得火木層孔菌粗提物。
[0014]將上述得物稱取300g與等體積100目正相硅膠混勻攪拌，進(jìn)行硅膠正相柱層析。層析固定相為200-300目正相硅膠，柱高lm，直徑15cm，洗脫劑為分別為氯仿，氯仿:甲醇=100:1-200:1，分別洗脫2，3個柱體積。并將所得洗脫液分別命名為Fr-l，F(xiàn)r-2。將Fr_2等體積硅膠拌樣，使用硅膠為100目正相硅膠，五倍體積硅膠層析，使用的硅膠為200— 300目正相硅膠。洗脫劑為石油醚與丙酮。減壓濃縮洗脫液，使用甲醇:氯仿=1:1溶解，氯仿甲醇凝膠柱層析。使用TLC檢測收集的洗脫液適當(dāng)合并，減壓蒸干，再次使用正相硅膠層析，洗脫劑為氯仿:甲醇=100:1-50: 1，收集洗脫液，使用TLC檢測各洗脫液，合并收集出現(xiàn)斑點(diǎn)的洗脫液，展開劑為石油醚:丙酮=30:1-35:1。減壓干燥，進(jìn)行1D-13CNMR核磁共振分析，頻率為 ΙΟΙΜΗζ，δ 80.14，75.46，69.61，54.26，51.95，39.88，39.43，30.86，30.46，30.37，30.22，29.65，25.78，23.77，22.61，14.89，14.51.分析結(jié)果為證明是為1，2_桉烷型倍半萜。
[0015](7)采用步驟(6)得到的化合物進(jìn)行對MDCK細(xì)胞毒性的測定，確定其半數(shù)中毒濃度(CC5tl)及最大安全濃度。
[0016]在96孔板上，10(^1/孔加入4父1051111-1濃度的MDCK細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h后，
在單層細(xì)胞上分別加入不同濃度的含樣維持液，每種濃度重復(fù)3孔，并設(shè)正常細(xì)胞對照。置370C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，棄培養(yǎng)液上清，100 μ I/孔加入5 mg.Hir1MTT的維持液，繼續(xù)培養(yǎng)Ih后，棄MTT上清，每孔加溶解液(DMSO) 100 μ 1，振蕩5_10 min，待結(jié)晶完全溶解，酶標(biāo)儀測492nm處的OD值。計(jì)算出樣品的半數(shù)中毒濃度(CC5tl)及最大安全濃度。當(dāng)加樣組的OD492值不顯著低于細(xì)胞對照組OD492時，此濃度即為樣品的最大安全濃度。
[0017]表1 1，2-桉烷型倍半萜各濃度對細(xì)胞生長的影響
【權(quán)利要求】
1.1, 2-桉烷型倍半萜在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的1，2-桉烷型倍半萜在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于1，2-桉烷型倍半萜是從火木層孔菌中提取的，提取步驟順序如下: (1)制備火木層孔菌粗提物； (2)將步驟(1)所得的沉淀物與正相硅膠混勻攪拌，干燥后進(jìn)行硅膠正相柱層析，使用洗脫劑洗脫2-5次，得到洗脫液； (3)將步驟(2)中最后一次洗脫液蒸干，等體積硅膠拌樣，進(jìn)行正相硅膠層析，使用洗脫劑洗脫； (4)收集步驟(3)中的洗脫液，減壓濃縮，使用氯仿:甲醇=1:1溶解，進(jìn)行甲醇凝膠柱層析，使用洗脫劑洗脫，使用TLC檢測收集的洗脫液，適當(dāng)合并洗脫液，減壓干燥； (5)將步驟(4)中得到的產(chǎn)物進(jìn)行再次進(jìn)行正相硅膠層析，使用洗脫劑洗脫； (6)收集步驟(5)得到的洗脫液，使用TLC檢測各洗脫液，適度合并洗脫液，減壓干燥，即為1,2-桉燒型倍半職。
3.如權(quán)利要求2所述的1，2-桉烷型倍半萜在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于所述火木層孔菌粗提物，由下述方法制得: (1)將火木層孔菌菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶內(nèi)，以20~35°C溫度，搖瓶轉(zhuǎn)速為80~280r/min，pH 3~8條件下，震動培養(yǎng)7~15天；培養(yǎng)中當(dāng)pH值降到2.5~4時，將搖瓶中的種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度20~35°C，發(fā)酵罐壓力0.1~0.2公斤/平方厘米，pH 3~8，通氣量0.5~1.lvvm,攪拌速度100~280轉(zhuǎn)/分的條件，培養(yǎng)7~15天，即可得到火木層孔菌菌絲體發(fā)酵全液； (2)取步驟(1)中所得火木層孔菌菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/2~1/5 ； (3)用體積百分比為60~95%的乙醇對上述步驟(2)濃縮后的發(fā)酵液進(jìn)行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的2~8倍，能夠使提取液中乙醇濃度達(dá)到60~90% ； (4)對步驟(3)所得提取液在50~70°C條件下，加熱I~2小時；以常規(guī)方法進(jìn)行分離，并通過二級過濾除去雜質(zhì)，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5~1/10 ； (5)將將步驟(4)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進(jìn)行干燥，得火木層孔菌粗提物。
4.如權(quán)利要求3所述的1，2-桉烷型倍半萜在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于所述液體培養(yǎng)基配方以克/100毫升計(jì)是: 玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5% 蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5% 硫酸鎂 0.1-0.5%磷酸二氫鉀0.01-0.05%。
5.如權(quán)利要求3所述的1，2-桉烷型倍半萜在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于火木層孔菌粗提物制備步驟(3)的乙醇為濃度65%-95%食用乙醇，所用體積為3-6倍體積。
6.如權(quán)利要求2所述的1，2-桉烷 型倍半萜在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于提取步驟(2)中所述的拌樣硅膠為100-200目正相硅膠，層析硅膠為正相200-300目，洗脫劑為氯仿和/或甲醇。
7.如權(quán)利要求2所述的1，2-桉烷型倍半萜在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于，步驟(3)中所述的硅膠用量為等體積，洗脫劑為石油醚與丙酮。
8.如權(quán)利要求2所述的1，2-桉烷型倍半萜在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于，步驟(4)中所述的凝膠為Sephadex LH-20,洗脫劑為氯仿:甲醇=1:1~1:3。
9.如權(quán)利要求2所述的1，2-桉烷型倍半萜在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于，步驟(5)所述的層析硅膠為200-300目，洗脫劑為氯仿:甲醇=100:1-50:1。
10.如權(quán)利要求2所述的1，2-桉烷型倍半萜在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于，步驟(6)所述的 檢測要點(diǎn)是出現(xiàn)斑點(diǎn)，展開劑為石油醚:丙酮=30:1-35:1。
【文檔編號】A01G1/04GK103800321SQ201310401647
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2013年9月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月6日
【發(fā)明者】趙晨, 宋愛榮, 孔超, 孫效樂, 王光遠(yuǎn) 申請人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)