楝樹(shù)染色體加倍方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種楝樹(shù)染色體加倍方法。本發(fā)明技術(shù)方案是采集楝樹(shù)外殖體，消毒滅菌，將殖體進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織并分散成懸浮細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，處理愈傷組織，染色體加倍，將愈傷組織轉(zhuǎn)接到初代培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，再轉(zhuǎn)接到生芽培養(yǎng)基中誘導(dǎo)不定芽，將不定芽放入增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，接種到生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，用椰糠和土配成的混合基顧進(jìn)行煉苗，篩選出加倍后的植株種苗。本發(fā)明克服了不能有效的對(duì)楝樹(shù)等木本植物進(jìn)行染色體加倍的缺陷。本發(fā)明培育出的多倍體楝樹(shù)果實(shí)大，產(chǎn)量高，含楝素高，植株健壯粗大，能夠有效提高楝樹(shù)的利用率，大大減少了其生產(chǎn)的成本，提高了經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
【專利說(shuō)明】楝樹(shù)染色體加倍方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)育種領(lǐng)域，專用于楝樹(shù)的染色體工程和倍性育種，特別涉及一種楝樹(shù)染色體加倍方法。
【背景技術(shù)】
[0002]楝樹(shù)具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，特別是所含有效的化學(xué)物質(zhì)如楝素等，但天然楝樹(shù)的果實(shí)比較小，其中的楝素也就很少。因此如何提高楝樹(shù)果實(shí)的大小，以及果實(shí)中有效化學(xué)物質(zhì)的含量成為楝樹(shù)エ業(yè)發(fā)展的瓶頸。
[0003]在本發(fā)明之前，沒(méi)有專門(mén)針對(duì)楝樹(shù)的染色體加倍方法。其他染色體加倍的方法例如丹參染色體加倍方法等都只針對(duì)草本植物，不能有效的對(duì)楝樹(shù)等木本植物進(jìn)行染色體加倍，本發(fā)明解決了楝樹(shù)的染色體加倍的技術(shù)難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的就在于克服上述缺陷，研制一種楝樹(shù)染色體加倍方法。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0006]楝樹(shù)染色體加倍的方法，其主要技術(shù)特征在于以下步驟:
[0007](I)采集楝樹(shù)外殖體；
[0008](2)用消毒試劑對(duì)楝樹(shù)外植體滅菌；
`[0009](3)將楝樹(shù)外殖體轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織；
[0010](4)將愈傷組織分散成懸浮細(xì)胞，進(jìn)行懸浮培養(yǎng)；
[0011 ](5)使用化學(xué)物質(zhì)處理愈傷組織，實(shí)現(xiàn)染色體加倍；
[0012](6)將染色體加倍的愈傷組織轉(zhuǎn)接到初代培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；
[0013](7)將愈傷組織轉(zhuǎn)接到生芽培養(yǎng)基中誘導(dǎo)不定芽；
[0014](8)將分化出的不定芽放入増殖培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；
[0015](9)接種到生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)；
[0016](10)用椰糠和土配成的混合基質(zhì)進(jìn)行煉苗，煉苗后移栽；
[0017](11)進(jìn)行染色體數(shù)目觀察，篩選出加倍后的植株種苗。
[0018]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果在于培育出的多倍體楝樹(shù)果實(shí)大,產(chǎn)量高,含楝素高，植株健壯粗大，能夠有效提聞棟樹(shù)的利用率，大大減少了其生廣的成本，提聞了經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
[0019]本發(fā)明的其他具體優(yōu)點(diǎn)和效果將在下面繼續(xù)說(shuō)明。
【具體實(shí)施方式】
[0020]本發(fā)明的技術(shù)思路是:
[0021]多倍體植株大多比較粗壯，產(chǎn)量明顯提高，抗寒、抗旱、抗病能力加強(qiáng)，具有一定的優(yōu)越性。但是在自然界中多倍體自發(fā)情況極少，而且發(fā)生的變異大多不定向。本發(fā)明用化學(xué)物質(zhì)秋水仙素處理愈傷組織從而誘導(dǎo)多倍體，利用的是愈傷組織分化程度低、細(xì)胞分裂快、再生能力強(qiáng)的特點(diǎn)。不僅可以大大縮短所需時(shí)間，誘發(fā)成功率高，而且材料易得，易處理。大致流程如下:外植體一愈傷組織一多倍體植株一檢驗(yàn)一擴(kuò)繁。
[0022]本發(fā)明方法包括以下具體步驟:
[0023](1)外殖體采集:選擇睛朗的天氣，在上午葉面無(wú)露水時(shí)進(jìn)行采集。挑選健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的植株，用較鋒利的剪刀剪下枝梢半木質(zhì)化部分，切除頂梢幼嫩段，只保留半木質(zhì)化段。在腋芽上下3cm處切下腋芽，并只保留3cm左右的葉柄，切ロ要求平滑不裂，以利于隨后的消毒處理。
[0024](2)外殖體消毒:將上述采集的外殖體在無(wú)菌的情況下，采用特別配制的消毒試劑進(jìn)行消毒，處理方法為:
[0025]方法一洗潔精沖洗3遍，0.1 %~0.2%高錳酸鉀35min，10%~20%次氯酸鈉溶液Ih (加1%吐溫20)，1~3%山農(nóng)一號(hào)I型與抗生素溶液lh，其中抗生素含鏈霉素、頭孢霉素、制霉菌素，且濃度均為3~7%，75%こ醇30秒，每個(gè)試劑處理后均要用無(wú)菌水沖洗3遍。
[0026]方法二洗潔精沖洗3~5遍，75%こ醇30秒，10%次氯酸鈉溶液lh，1%氯化汞溶液IOmin,姆個(gè)試劑處理后均要用無(wú)菌水沖洗3遍。
[0027](3)誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織:每隔14天，將外殖體轉(zhuǎn)接到新的愈傷組織的培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基在正常的MS培養(yǎng)基中添加了蔗糖40g，卡拉膠7.5g，6-BAl.5mg,NAA0.025mg，水至I升，調(diào)整pH至5.8~6.2。25±2°C培養(yǎng)，無(wú)需光照。
[0028](4)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)愈傷組織:將愈傷分散后,接種在液體培養(yǎng)中上，125rpm振蕩培養(yǎng)。姆隔3~5天換一次培養(yǎng)基,一段時(shí)間后觀察愈傷狀態(tài)。懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方為:MS培養(yǎng)基中添加了蔗糖40g，6-BAl.5mg,NAA0.025mg，水至I升，調(diào)整pH至5.8~6.2。25 ±2 °C培養(yǎng)，無(wú)需光照。
[0029](5)使用化學(xué)物質(zhì)處理愈傷組織誘導(dǎo)染色體加倍:在無(wú)菌環(huán)境下，分別將愈傷組織、幼苗、懸浮細(xì)胞的混合物用0.25%濃度的秋水仙素溶液處理2.5h，秋水仙素溶液內(nèi)需加入I %的二甲基亞砜?jī)傻?。處理后用無(wú)菌水沖洗2~3次。
[0030](6)挑選愈傷組織進(jìn)行初代培養(yǎng):挑選細(xì)胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，顔色淺而透明的愈傷組織轉(zhuǎn)接到初代培養(yǎng)基中。每月轉(zhuǎn)接一次，大概培養(yǎng)2~3個(gè)月。該培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基添加了蔗糖40g，卡拉膠7.5g，TDZ0.2mg，三農(nóng)一號(hào)II型2ml，活性炭1.5g，水至I升，調(diào)整pH至5.8~6.2。25±2°C和2000Iux光照條件下或日光燈照明培養(yǎng)，也可使用LED紅燈作為光源進(jìn)行培養(yǎng)。每天提供24h光照。
[0031](7)利用愈傷組織誘導(dǎo)不定芽:將愈傷組織放入培養(yǎng)基中誘導(dǎo)不定芽，20~25天轉(zhuǎn)接一次。該培養(yǎng)基為3 / 2MS培養(yǎng)基中加入了蔗糖40g，卡拉膠7.5g，6-BA0.5mg，NAA0.15mg，水至I升，調(diào)整pH至5.8~6.2。培養(yǎng)條件為:25±2°C和2000Iux光照條件下或日光燈照明培養(yǎng)，也可使用LED紅燈作為光源進(jìn)行培養(yǎng)。每天提供24h光照。
[0032](8)增殖培養(yǎng):轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基后每25~30天轉(zhuǎn)接一次。該培養(yǎng)基為3 / 2MS培養(yǎng)基中加入了鹿糖40g,卡拉膠7.5g, 6-BA0.5mg,NAA0.15mg,水至I升,調(diào)整pH至5.8~
6.2。培養(yǎng)條件為:25±2°C和2000Iux光照條件下或日光燈照明培養(yǎng)，也可使用LED紅燈作為光源進(jìn)行培養(yǎng)。每天提供16h光照。
[0033](9)生根培養(yǎng):挑選較粗壯的植株，切去葉柄，將枝干切成4~5cm的小段,接種到生根培養(yǎng)基中。該培養(yǎng)基在正常的MS培養(yǎng)基中加入了蔗糖40g，卡拉膠5g，IBA0.15mg /L，水至I升，調(diào)整pH至5.8~6.2。
[0034]置于20~28°C和1000~3000Iux光照條件下或日光燈或LED紅光燈作為照明光源培養(yǎng)。每天提供16~24h光照。
[0035](10)出瓶移栽:移栽組培苗可用椰糠:土 =1:1的土壤作為基質(zhì)。在植株的根長(zhǎng)至3~5cm長(zhǎng)時(shí)，即可出瓶移栽。移栽前先將瓶苗置于蔭棚中訓(xùn)化培養(yǎng)7~10天，開(kāi)蓋后再放置3~5天。移栽時(shí)用竹筷或鑷子將瓶苗輕輕取出，洗凈培養(yǎng)基后用1%。的多菌靈浸泡7min,栽入育苗杯中,澆透水后用地膜覆蓋,培養(yǎng)。
[0036](11)染色體檢測(cè):取候選加倍楝樹(shù)植株的莖尖或根尖組織，進(jìn)行染色體數(shù)目觀察，篩選加倍植株的楝樹(shù)種苗，以便用于進(jìn)一步擴(kuò)繁生產(chǎn)。
[0037]實(shí)施例:
[0038](I)在上午葉面無(wú)露水時(shí)，選取健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的楝樹(shù)植株，取頂稍幼嫩段的外殖體20個(gè)。
[0039](2)將上述外殖體用消毒試劑進(jìn)行消毒。消毒試劑采用及處理時(shí)間如下:洗潔精沖洗3遍，0.2%高錳酸鉀20min，10%次氯酸鈉溶液1.5h (加I %吐溫20)，培養(yǎng)基中加過(guò)濾的1%山農(nóng)一號(hào)I型與抗生素溶液2.5h(其中含鏈霉素、頭孢霉素、制霉菌素,且濃度均為3% )，75%乙醇20秒，每個(gè)試劑處理后均要用無(wú)菌說(shuō)沖洗3遍。
[0040](3)每隔14天，將外殖體轉(zhuǎn)移到新的愈傷組織的培養(yǎng)基中。該培養(yǎng)基是在正常MS培養(yǎng)基中加鹿糖40g,卡拉膠7.5g, 6-BA0.5mg,NAA0.05mg,水至I升,調(diào)整pH至5.8~6.2。25 ±2 °C培養(yǎng)，無(wú)需光照。
`[0041](4)將愈傷組織分散后懸浮，接種在液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行震蕩培養(yǎng)。每隔3~5天更換培養(yǎng)基。培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基中添加了蔗糖40g，6-BA0.5mg, NAA0.05mg，水至I升，調(diào)整pH至5.8~6.2。25 ±2 °C培養(yǎng)，無(wú)需光照，搖床轉(zhuǎn)速150rpm。
[0042](5)在無(wú)菌環(huán)境下，分別將愈傷組織，幼苗，懸浮細(xì)胞的混合物用0.1 %濃度的秋水仙素溶液浸泡處理5h，秋水仙素溶液內(nèi)需加入1%的二甲基亞砜?jī)傻?。處理后用無(wú)菌水沖洗2~3次。
[0043](6)將外殖體轉(zhuǎn)接到初代培養(yǎng)基中，每月轉(zhuǎn)接一次，大概培養(yǎng)2~3個(gè)月。該培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基添加了蔗糖40g，卡拉膠7.5g，TDZ0.2mg，三農(nóng)一號(hào)II型1ml，活性炭
0.5g，水至I升，調(diào)整pH至5.8~6.2。25±2°C和2000Iux光照條件下或日光燈照明培養(yǎng)，也可使用LED紅燈作為光源進(jìn)行培養(yǎng)。每天提供24h光照。
[0044](7)將愈傷組織放入培養(yǎng)基中誘導(dǎo)不定芽，20天轉(zhuǎn)接一次。該培養(yǎng)基為3 / 2MS培養(yǎng)基中加入了鹿糖40g,卡拉膠7.5g, 6-BA0.3mg,NAA0.05mg,水至I升,調(diào)整pH至5.8~
6.2。培養(yǎng)條件為:25±2°C和2000Iux光照條件下或日光燈照明培養(yǎng)，也可使用LED紅燈作為光源進(jìn)行培養(yǎng)。每天提供24h光照。
[0045](8)每25天轉(zhuǎn)接一次到增殖培養(yǎng)基中。該培養(yǎng)基為3 / 2MS培養(yǎng)基中加入了蔗糖40g,卡拉膠7.5g, 6-BA0.3mg,NAA0.05mg,水至I升,調(diào)整pH至5.8~6.2。培養(yǎng)條件為:25±2°C和2000IUX光照條件下或日光燈照明培養(yǎng)，也可使用LED紅燈作為光源進(jìn)行培養(yǎng)。每天提供16h光照。
[0046](9)挑選較粗壯的植株，切去葉柄，將枝干切成4cm的小段，接種到生根培養(yǎng)基中。該培養(yǎng)基在正常的MS培養(yǎng)基中加入了蔗糖60g，卡拉膠7.5g，IBA0.05mg / L，水至I升，調(diào)整pH至5.8~6.2。置于25±2°C和2000Iux光照條件下或日光燈或LED紅光燈作為照明光源培養(yǎng)。每天提供16光照。
[0047](10)移栽組培苗用椰糠:土壌=I:1的土壤作為基質(zhì)。在植株的根長(zhǎng)至4cm長(zhǎng)時(shí)，出瓶移栽。移栽前先將瓶苗置于蔭棚中訓(xùn)化培養(yǎng)7天，開(kāi)蓋后再放置3天。移栽時(shí)用鑷子將瓶苗輕輕取出，洗凈培養(yǎng)基后用1%。的多菌靈浸泡5min，栽入育苗杯中，澆透水后用地膜
覆蓋，培養(yǎng)。
[0048](11)取加倍后楝樹(shù)植株的莖尖或根尖組織，進(jìn)行染色體數(shù)目觀察，篩選加倍植株的楝樹(shù)種苗， 以便用于進(jìn)ー步擴(kuò)繁生產(chǎn)。
[0049]本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不僅僅局限于上述【具體實(shí)施方式】的說(shuō)明。
【權(quán)利要求】
1.楝樹(shù)染色體加倍方法，其特征在于以下步驟: (1)采集楝樹(shù)外殖體； (2)用消毒試劑對(duì)楝樹(shù)外植體滅菌； (3)將楝樹(shù)外殖體轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織； (4)將愈傷組織分散成懸浮細(xì)胞，進(jìn)行懸浮培養(yǎng)； (5)使用化學(xué)物質(zhì)處理愈傷組織,實(shí)現(xiàn)染色體加倍； (6)將染色體加倍的愈傷組織轉(zhuǎn)接到初代培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)； (7)將愈傷組織轉(zhuǎn)接到生芽培養(yǎng)基中誘導(dǎo)不定芽； (8)將分化出的不定芽放入增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)； (9)接種到生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)； (10)用椰糠和土配成的混合基質(zhì)進(jìn)行煉苗，煉苗后移栽； (11)進(jìn)行染色體數(shù)目觀察，篩選出加倍后的植株種苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)I中所述的楝樹(shù)染色體加倍方法，其特征在于步驟(2)中，消毒試劑包括:洗潔精，高錳酸鉀，次氯酸鈉溶液，無(wú)菌水，山農(nóng)一號(hào)I型，抗生素溶液，75 %乙醇，氯化汞。
3.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)I中所述的楝樹(shù)染色體加倍方法，其特征在于步驟(3)中的培養(yǎng)基在正常的MS培養(yǎng)基中添加了鹿糖40g,卡拉膠7.5g, 6-BA0.5~2mg,NAA0.01~0.05mg,水至I升，調(diào)整pH至5.8~6.2。
4.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)I中所述的楝樹(shù)染色體加倍方法，其特征在于步驟(4)中懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基在正常的MS培養(yǎng)基中添加了蔗糖40g，6-BA0.5~2mg，NAA0.01~0.05mg，水至I升，調(diào)整pH至5.8~6.2，搖床轉(zhuǎn)速100~150rpm。
5.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)I中所述的楝樹(shù)染色體加倍方法，其特征在于步驟(5)中的化學(xué)物質(zhì)為秋水仙素；處理濃度與方法為:在無(wú)菌環(huán)境下將濃度為0.1~0.5%的秋水仙素藥液過(guò)濾，再把經(jīng)過(guò)懸浮培養(yǎng)的愈傷組織浸泡于上述藥液中處理I~5h，之后用無(wú)菌說(shuō)沖洗2~3次。
6.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)I中所述的楝樹(shù)染色體加倍方法，其特征在于步驟(6)中的初代培養(yǎng)基的配方為:MS基本培養(yǎng)基添加了蔗糖40g，卡拉膠7.5g，TDZ0.1~0.3mg,山農(nóng)一號(hào)II型I~3ml，活性炭0.5~2g，水至I升，調(diào)整pH至5.8~6.2。
7.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)I中所述的楝樹(shù)染色體加倍方法，其特征在于步驟(7)中的生芽培養(yǎng)基配方為:3 / 2MS培養(yǎng)基中加入了蔗糖40g，卡拉膠7.5g，6-BA0.3~0.7mg，NAA0.05~0.2mg，水至I升，調(diào)整pH至5.8~6.2。
8.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)I中所述的楝樹(shù)染色體加倍方法，其特征在于步驟(8)中的增殖培養(yǎng)基配方為:3 / 2MS培養(yǎng)基中加入了蔗糖40g，卡拉膠7.5g，6-BA0.3~0.7mg，NAA0.05~0.2mg，水至I升，調(diào) 整pH至5.8~6.2。
9.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)I中所述的楝樹(shù)染色體加倍方法，其特征在于步驟(9)中的生根培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基中加入了蔗糖40g，卡拉膠5~10g，IBA0.05-2mg / L，水至I升，調(diào)整pH至 5.8 ~6.2。
10.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)I中所述的楝樹(shù)染色體加倍方法，其特征在于步驟(10)中培養(yǎng)組培苗的混合基質(zhì)的成分為椰糠和土壤混合物，混合比例為1:2~2:1。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK103598088SQ201310403061
【公開(kāi)日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年9月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月5日
【發(fā)明者】王臺(tái)虎 申請(qǐng)人:南京大淵美容保健有限公司