參與控制茄科植物種內(nèi)及種間生殖障礙的一類基因slf及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】參與控制茄科植物種內(nèi)及種間生殖障礙的一類基因SLF及其應(yīng)用。本發(fā)明公開(kāi)了一類在茄科植物中參與控制種內(nèi)和種間生殖障礙的SLF基因及其編碼的蛋白，其中SLF基因的核苷酸序列如SEQ?ID?No：1-5所示，其編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?No：6-10所示。本發(fā)明公開(kāi)了通過(guò)基因工程技術(shù)將SLF基因轉(zhuǎn)入矮牽牛和番茄等茄科植物，從而消除種內(nèi)和種間生殖障礙的方法。本發(fā)明還公開(kāi)了利用上述多核苷酸及其編碼的蛋白，在栽培番茄和野生番茄之間進(jìn)行遺傳育種的應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】參與控制茄科植物種內(nèi)及種間生殖障礙的一類基因SLF及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程和育種【技術(shù)領(lǐng)域】。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一個(gè)控制茄科種內(nèi)和種間生殖障礙的基因家族SLF (S-locus f-box)，該家族包含5個(gè)SLF基因。本發(fā)明還涉及所述SLF基因編碼的蛋白質(zhì)及其功能類似物，以及含有所述SLF基因核苷酸序列的載體和含有該基因核苷酸序列或該載體的宿主細(xì)胞；另外，本發(fā)明還涉及利用所述載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞以打破茄科植物種內(nèi)及種間生殖障礙的方法以及在茄科遺傳育種中的相關(guān)應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]生殖障礙制約了作物遺傳多樣性的提高和雜交優(yōu)勢(shì)的利用。例如，栽培番茄在人工馴化和育種的過(guò)程中，遺傳多樣性逐步喪失，導(dǎo)致其遺傳背景單一而對(duì)生物和非生物逆境抗性下降(Tanksley and McCouch, 1997)。具有高度遺傳多樣性的野生番爺與栽培番茄之間的生殖障礙阻礙了它們之間的基因交流，制約了栽培番茄遺傳多樣性的提高(Rick，1988)。番茄生殖障礙還降低了雜交育種的效率，增加了育種的時(shí)間和難度(Bernacchi andTanksley,1997)。
[0003]茄科植物是與人類關(guān)系最密切的植物之一，既包含適合科學(xué)研究的模式植物(番茄，矮牽牛等)，還包含許多重要的經(jīng)濟(jì)作物(土豆，番茄和煙草等)(Rick，1988)。茄科中的番爺亞屬包括17個(gè)種，它們?cè)诜N內(nèi)和種間表現(xiàn)出不同的生殖障礙(Bedinger et al.,2011)。番茄種間生殖障礙會(huì)引起栽培番茄與野生番茄雜交子一代自交不親和，限制了育種家利用野生番爺資源對(duì)栽培番爺進(jìn)行改良(Bernacchi and Tanksley, 1997)。因此,研究并打破種間生殖障礙是番茄育種的重要目標(biāo)。高密度的種間漸滲系材料，成熟的轉(zhuǎn)基因技術(shù)以及高質(zhì)量的栽培番茄全基因 組數(shù)據(jù)使得番茄成為研究生殖障礙的模式材料。
[0004]番茄的生殖障礙主要分為兩類:一類是種內(nèi)生殖障礙，自交不親和性(self-1ncompatibility, SI);另一類是種間生殖障礙，單向不親和性(unilateralincompatibility, UI)。自交不親和性是指在一些雌雄同花且正常可育的被子植物中，自花授粉受到抑制的現(xiàn)象。前人的研究結(jié)果表明，番茄的自交不親和性是由單一的復(fù)等位基因位點(diǎn)所控制，該位點(diǎn)被稱為自交不親和位點(diǎn)一S位點(diǎn)(the S-locus) 0遺傳研究發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)至少編碼兩類基因，花柱表達(dá)的花柱S基因和花粉表達(dá)的花粉S基因，分別控制花柱和花粉的自交不親和特異性。這兩類基因緊密連鎖，構(gòu)成了一種遺傳單元，被稱為S單體型(S-haplotype) (Zhang et al.，2009)。番茄的花柱S基因編碼一類T2家族的核酸酶，被稱為
S-RNase (Parry et al.，1997)，番茄的自交不親和現(xiàn)象也因此被命名為S-RNase類自交不親和性。番茄的花粉S因子目前還不清楚。其它S-RNase類自交不親和物種，如車前科金魚(yú)草和茄科矮牽牛的花粉S因子已被證明是一類與S-RNase基因緊密連鎖的F_box基因，命名為 SLF(S_locus F-box) (Lai et al., 2002 ；Qiao et al., 2004 ；Si jacic et al.,2004)。最近的研究結(jié)果表明多個(gè)SLF蛋白協(xié)同作用，識(shí)別異己S-RNase并使其進(jìn)入泛素-26S蛋白酶體系統(tǒng)被降解，同時(shí)避免降解自己的S-RNase (Kubo et al., 2010 ；Sun and Kao,2013)。
[0005]人們?cè)谘芯糠炎越徊挥H和性的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)自交親和的栽培番茄對(duì)自交不親和的野生番茄授粉時(shí)，花粉管無(wú)法抵達(dá)胚珠完成受精；反之，當(dāng)自交不親和的野生番茄對(duì)自交親和的栽培番茄授粉時(shí)，花粉管可以抵達(dá)胚珠完成受精并產(chǎn)生成熟的種子。這種與正反交方向相關(guān)的種間生殖障礙被稱為單向不親和性(Martin，1964)。遺傳研究表明，含有兩個(gè)野生潘那利番茄遺傳因子的栽培番茄可以打破對(duì)野生番茄的單向不親和性(Chetelatand DeVema，1991)。這兩個(gè)遺傳因子分別被定位在6號(hào)染色體(ui6.1)和I號(hào)染色體(uil.1)上(Bernacchi and Tanksley, 1997 ；Li et al.,2010)。Li 等人通過(guò)遺傳學(xué)手段證明ui6.1編碼一個(gè)Cullinl蛋白，在野生番茄中功能正常，而在栽培番茄中失去功能(Liand Chetelat, 2010)。uil.1目前被定位在I號(hào)染色體S位點(diǎn)附近約12cM的區(qū)域內(nèi)(Li etal.，2010)，其分子本質(zhì)和作用機(jī)制還不清楚。
[0006]本發(fā)明從打破番茄種間生殖障礙，進(jìn)一步利用番茄野生種質(zhì)資源出發(fā)，利用同源克隆的方法在番茄中克隆了一類SLF基因。這類基因在栽培番茄中由于提前終止而喪失功能，而在野生多毛番茄中功能正常，這樣的種間基因功能差異與之前發(fā)現(xiàn)的ui6.1情況類似。上述SLF基因中的部分成員在雜交矮牽牛中異位表達(dá)可以打破雜交矮牽牛S單體型為S3S%植株的自交不親和性，提示這類基因作為花粉S因子發(fā)揮功能且在屬間功能保守。帶有功能正常的SLF基因和ui6.1的栽培番茄可以打破對(duì)野生番茄的單向不親和反應(yīng)，提示這些SLF基因可能作為uil.1參與番茄的種間生殖障礙。根據(jù)上述的結(jié)果，育種家可以通過(guò)基因工程來(lái)恢復(fù)栽培番茄SLF基因的功能，使其花粉可以消除對(duì)野生番茄的種間生殖障礙，從而利用野生番茄種質(zhì)資源。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明分離了參與控制茄科植物種內(nèi)及種間生殖障礙的多核苷酸家族(將其命名為SLFs，(S-locus E-box))和其編碼的蛋白質(zhì)，以及包含該多核苷酸的載體，核酸構(gòu)建體，細(xì)胞和植物材料等。本發(fā)明還涉及一種消除茄科植物種內(nèi)和種間生殖障礙的方法，及本發(fā)明中多核苷酸和其編碼蛋白的應(yīng)用。
[0008]基于上述，在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種分離的多核苷酸，其包含或由選自下組之一的多核苷酸組成:
[0009]a) SEQ ID No:1_5中任一項(xiàng)所示的多核苷酸；
[0010]b)多核苷酸，其編碼SEQ ID No:6_10中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列，或編碼SEQ IDNo:6-10中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸但保留SEQID No:6-10的氨基酸序列的功能而得到的氨基酸序列；
[0011]c)多核苷酸，其編碼與SEQ ID No:6-10中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列具有至少60 %的序列同一性，優(yōu)選至少70 %的序列同一性，優(yōu)選至少80 %的序列同一性，優(yōu)選至少90%的序列同一性，優(yōu)選至少95%的序列同一性和優(yōu)選至少99%的序列同一性的氨基酸序列；
[0012]d)多核苷酸，其在嚴(yán)謹(jǐn)條件下，優(yōu)選中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下和更優(yōu)選高等嚴(yán)謹(jǐn)條件下可以與a)或b)或c)中任一項(xiàng)雜交(上述嚴(yán)謹(jǐn)條件可為在6X SSC，0.5% SDS的溶液里，在65°C下雜交，然后用 2XSSC，0.1% SDS 和 1XSSC，0.1% SDS 各洗膜一次)；[0013]e)多核苷酸，其為a)-d)中任一項(xiàng)的活性片段。
[0014]優(yōu)選地，本發(fā)明的多核苷酸由SEQ ID No:1-5所示的核苷酸序列組成或由編碼SEQID No:6-10所示的氨基酸序列的核苷酸序列組成。
[0015]更優(yōu)選地，本發(fā)明的多核苷酸編碼的蛋白為參與控制茄科植株種內(nèi)及種間生殖障礙的相關(guān)蛋白。
[0016]本發(fā)明進(jìn)一步提供重組載體或核酸構(gòu)建體，其包含本發(fā)明的至少一種多核苷酸。
[0017]本發(fā)明進(jìn)一步提供植物細(xì)胞，其包含本發(fā)明的重組載體或核酸構(gòu)建體。
[0018]本發(fā)明還提供轉(zhuǎn)基因植物，其包含本發(fā)明的植物細(xì)胞。優(yōu)選地，本發(fā)明的植物是茄科植物，更優(yōu)選的選自番茄，土豆或煙草。
[0019] 本發(fā)明進(jìn)一步提供一種植物材料，包括上述植物的后代，克隆，繁殖材料，種子，果實(shí)，植物材料，植物細(xì)胞培養(yǎng)物，植物器官和部分，優(yōu)選為種子。
[0020]進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供上述植物材料制備的組合物，包括食品和飼料等。
[0021]在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供一種參與控制茄科植物種內(nèi)及種間生殖障礙的蛋白，其由本發(fā)明第一方面所述的任一種多核苷酸序列編碼，其為具有SEQ ID No:6-10中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID No:6-10中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID No:6-10中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列相同的功能的由SEQ ID No:6-10中任一項(xiàng)衍生的蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)優(yōu)選具有SEQ ID No:6-10中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列。更優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)由SEQ ID No:6-10中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列組成。
[0022]在第三個(gè)方面，本發(fā)明提供一種培育消除種內(nèi)及種間生殖障礙的茄科植物的方法，該方法包括將本發(fā)明的多核苷酸序列導(dǎo)入所述茄科植物的細(xì)胞中的步驟，或者包括使用將本發(fā)明的重組載體或核酸構(gòu)建體導(dǎo)入所述茄科植物的細(xì)胞的步驟，和將得到的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞培育成為轉(zhuǎn)基因植株的步驟，從而使所得到的轉(zhuǎn)基因植株消除了種內(nèi)及種間生殖障礙。其中所述茄科植物包括，但不限于，番茄，土豆，煙草。
[0023]在第四個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種消除茄科植物種內(nèi)及種間生殖障礙的方法，所述方法包括在所述茄科植物中使本發(fā)明的多核苷酸過(guò)表達(dá)的步驟，其中所述茄科植物包括，但不限于，番茄，土豆，煙草。
[0024]在第五個(gè)方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的多核苷酸序列及其編碼蛋白質(zhì)、本發(fā)明的重組載體或核酸構(gòu)建體、或本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞在消除茄科植物種內(nèi)及種間生殖障礙方面的用途，其中所述茄科植物包括，但不限于，番茄，土豆，煙草。
[0025]在第六個(gè)方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的多核苷酸序列及其編碼蛋白質(zhì)、本發(fā)明的重組載體或核酸構(gòu)建體、或本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞在調(diào)控茄科植物種內(nèi)或者種間傳粉受精方面的應(yīng)用。
[0026]在第七個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種利用上述多核苷酸序列及其編碼蛋白質(zhì)在栽培番茄和野生培番茄之間進(jìn)行遺傳育種的應(yīng)用。
[0027]綜上所述，本發(fā)明提供下述各項(xiàng):
[0028]1、分離的多核苷酸序列，其包含或由選自下組之一的多核苷酸序列組成:
[0029]a) SEQ ID No:1_5中任一項(xiàng)所不的多核苷酸序列；
[0030]b)多核苷酸序列，其編碼SEQ ID No:6-10中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列，或編碼SEQ ID No:6-10中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸但保留SEQ ID No:6-10的氨基酸序列的功能而得到的氨基酸序列；
[0031]c)多核苷酸序列,其編碼與SEQ ID No:6_10中任一項(xiàng)所不的氨基酸序列具有至少60 %的序列同一性，優(yōu)選至少70 %的序列同一性，優(yōu)選至少80 %的序列同一性，優(yōu)選至少90%的序列同一性，優(yōu)選至少95%的序列同一性和優(yōu)選至少99%的序列同一性的氨基酸序列；
[0032]d)多核苷酸序列，其在嚴(yán)謹(jǐn)條件下，優(yōu)選中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下和更優(yōu)選高等嚴(yán)謹(jǐn)條件下可以與a)或b)或c)中任一項(xiàng)雜交；
[0033]e)多核苷酸序列，其為a)_d)中任一項(xiàng)的活性片段。
[0034]2、第I項(xiàng)的多核苷酸序列，其由SEQ ID No:1_5中任一項(xiàng)所示的多核苷酸序列組成或由編碼SEQ ID No:6-10中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的多核酸序列組成。
[0035]3、重組載體或核酸構(gòu)建體，其包含第1-2項(xiàng)任一項(xiàng)的至少一種多核苷酸序列。
[0036]4、一種轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其包含第3項(xiàng)中的重組載體或核酸構(gòu)建體。
[0037]5、一種在茄科植物中參與控制種內(nèi)和種間生殖障礙的蛋白質(zhì)，其為具有SEQ IDNo:6-10中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID No:6_10中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID No:6-10中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列相同的功能的由SEQ ID No:6-10中任一項(xiàng)衍生的蛋白質(zhì)。
[0038]6、第5項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，其特征在于:其氨基酸序列為SEQ ID No:6_10中任一項(xiàng)所示。
[0039]7、一種培育消除種內(nèi)及種間生殖障礙的茄科植物的方法，所述方法包括下述步驟:
[0040](I)將第1-2項(xiàng)所述的任一種多核苷酸序列導(dǎo)入所述茄科植物的細(xì)胞中，或者使用第3項(xiàng)的重組載體或核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染所述茄科植物的細(xì)胞；和
[0041](2)將得到的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞培育成為轉(zhuǎn)基因植株，從而使所得到的轉(zhuǎn)基因植株消除了種內(nèi)及種間生殖障礙。
[0042]8、第7項(xiàng)的方法，其中所述茄科植物選自番茄、土豆或煙草。
[0043]9、一種消除茄科植物種內(nèi)和種間生殖障礙的方法，所述方法包括在所述茄科植物細(xì)胞中導(dǎo)入第1-2項(xiàng)中任一項(xiàng)的至少一種多核苷酸序列或第3項(xiàng)的重組載體或核酸構(gòu)建體進(jìn)行過(guò)表達(dá)的步驟。
[0044]10、第9項(xiàng)的方法，其中所述茄科植物選自番茄、土豆或煙草。
[0045]11、第1-2項(xiàng)所述的多核苷酸序列、第3項(xiàng)所述的重組載體或核酸構(gòu)建體、第4項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和第5-6項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)在調(diào)控茄科植物種內(nèi)或者種間傳粉受精方面的應(yīng)用。
[0046]12、第1-2項(xiàng)所述的多核苷酸序列、第3項(xiàng)所述的重組載體或核酸構(gòu)建體、第4項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或第5-6項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)在消除茄科植物種內(nèi)或者種間生殖障礙方面的應(yīng)用。
[0047]13、第11-12項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中所述茄科植物選自番茄、土豆或煙草。
[0048]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式步驟如下:
[0049]一、番茄S位點(diǎn)的確定和SLF基因的克隆[0050]本發(fā)明利用茄科植物膨大矮牽牛的花粉S因子PiSLF2 (Wang et al.，2004)氨基酸序列在栽培番爺(Solanum Iycopersicum, SI)全基因組數(shù)據(jù)中進(jìn)行比對(duì)，克隆得到了 5個(gè)SlSLF基因，均由于提前終止而喪失功能，而在野生的多毛番茄(Solanumhabrochaites, Sh)中功能正常。這些基因分布在栽培番爺I號(hào)染色體長(zhǎng)臂靠近著絲粒約1640kb的區(qū)域內(nèi)(圖1)。在該區(qū)域還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)S-RNase基因，該結(jié)果符合SLF基因與S-RNase基因緊密連鎖的規(guī)律,且與前人對(duì)番爺S位點(diǎn)的遺傳定位結(jié)果一致(Bernacchiand Tanksley, 1997),提示該區(qū)域是番爺?shù)腟位點(diǎn)。
[0051]二、SLF基因功能的鑒定
[0052]上述的5個(gè)SLF基因在栽培番茄中均由于提前終止而失去功能，而在野生的多毛番茄中功能正常。前人的研究發(fā)現(xiàn)，SLF基因的不同等位與其對(duì)應(yīng)的S核酸酶連鎖。為了驗(yàn)證多毛番茄中的這些ShSLF基因位于S位點(diǎn)，本發(fā)明選擇其中兩個(gè)SLF基因?qū)τH本和子代群體進(jìn)行了 CAPS (cleaved amplified polymorphic sequence)分析。以多毛番爺 ShS1S3和ShS1S5以及它們雜交后得到的31株F1代個(gè)體植株的基因組DNA作為模版，對(duì)ShSLF2_S5和ShSLFe-S1進(jìn)行擴(kuò)增。對(duì)于ShSLF2-S5進(jìn)行CAPS分析，將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶TaqI進(jìn)行酶切檢測(cè)；對(duì)于ShSLFe-S1進(jìn)行CAPS分析，將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶AluI進(jìn)行酶切檢測(cè)。酶切后的產(chǎn)物分別用濃度為1.5%或2.5%的瓊脂糖凝膠分離，用溴化乙啶染色觀察酶切后產(chǎn)生的特異條帶。親本和子代均表現(xiàn)出CAPS標(biāo)記與S核酸酶連鎖的對(duì)應(yīng)關(guān)系，提示上述兩個(gè)SLF基因位于S位點(diǎn)(圖4)。
[0053]由于上述ShSLF基因編碼的蛋白質(zhì)(SEQ ID No:6_10)之間的氨基酸序列一致性大約40-70%，我們推測(cè)這些基因可能具有相同的功能。之前的報(bào)道提示SLF基因編碼產(chǎn)物的羧基端(除去氨基端50個(gè)氨基酸剩下的部分)可以在酵母中與雜交矮牽牛PhSv-RNase發(fā)生相互作用(Qiao et al.，2004)，我們將上述SEQ ID No: 1_5除去起始的150個(gè)堿基剩下的序列和PhSv-RNase序`列SEQ ID No:12(圖15)構(gòu)建進(jìn)入酵母載體，在酵母體內(nèi)進(jìn)行了雙雜交驗(yàn)證。酵母雙雜交結(jié)果提示，上述5個(gè)ShSLF基因產(chǎn)物的羧基端均可以與PhSv-RNase在酵母中發(fā)生相互作用(圖14)。
[0054]本發(fā)明利用ρΒΙΙΟΙ質(zhì)粒構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體(圖5)，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將這些功能正常的ShSLF基因轉(zhuǎn)入自交不親和物種雜交矮牽牛(S單體型為S3S3J中(圖6)，自交不親和性被打破，子代群體均帶有轉(zhuǎn)基因(圖7和圖8)。這一結(jié)果提示這些ShSLF基因可能作為花粉因子發(fā)揮功能，同時(shí)在屬間(矮牽牛屬和茄屬)功能保守。
[0055]三、驗(yàn)證SLF基因是否作為uil.1參與番茄種間單向不親和性
[0056]為了驗(yàn)證SLF基因是否作為uil.1參與番茄種間單向不親和性，本發(fā)明利用上述攜帶ShSLF基因的pBI 101載體(圖5)，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將這些功能正常的ShSLF基因轉(zhuǎn)入自交親和的栽培番茄(圖9)。將轉(zhuǎn)基因栽培番茄與ui6.1的栽培番茄漸滲系進(jìn)行雜交，獲得含有功能正常的ShSLF基因和ui6.1的栽培番茄。將該株系作為父本，對(duì)自交不親和的野生番茄進(jìn)行授粉。授粉后得到的子代均帶有轉(zhuǎn)基因(圖10)。對(duì)子代進(jìn)行自花授粉，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照栽培番茄花粉相比，子代花粉可以抵達(dá)胚珠(圖11)。這些結(jié)果提示，上述SLF基因(例如ShSLF6)作為uil.1參與控制番茄種間單向不親和性。
[0057]四、通過(guò)打破單向不親和性進(jìn)一步利用野生番茄資源
[0058]首先，之前在栽培番茄和野生番茄之間的雜交育種中，栽培番茄只能作為母本。在打破了單向不親和性后，可以選擇野生番茄作為母本進(jìn)行雜交育種。
[0059]其次，之前在栽培番茄和野生番茄之間的雜交育種中，由于雜種一代自交不親和(類似于單向不親和性，即栽培番茄對(duì)野生番茄授粉的情況)而無(wú)法得到性狀強(qiáng)烈分離的雜種二代以及后續(xù)世代，導(dǎo)致遺傳方式復(fù)雜的性狀(如一些數(shù)量性狀)無(wú)法得到優(yōu)選(Bernacchi and Tanksley，1997)。在打破單向不親和性后，雜種一代自交親和，使得育種家可以在F2代以及后續(xù)分離世代中優(yōu)選遺傳方式復(fù)雜的性狀，從而更有效地利用野生資源改良栽培品種(圖12)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0060]從下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的上述特征和優(yōu)點(diǎn)將更明顯，其中:
[0061]圖1、栽培番茄SLF基因的定位:
[0062]左圖顯示番茄I號(hào)染色體，兩條橫線之間的基因區(qū)段為栽培番茄的S位點(diǎn)，位于番茄I號(hào)染色體長(zhǎng)臂靠近著絲粒的區(qū)域；右圖顯示該基因區(qū)段的放大圖:在S位點(diǎn)內(nèi)，黃色箭頭(即，最上方的箭頭)表示S-RNase基因，藍(lán)色箭頭表示提前終止的SLF基因。
[0063]圖2、5 個(gè) ShSLF 基因的 DNA 序列:SEQ ID No:1_5。
[0064]圖3、5個(gè)ShSLF基因編碼的氨基酸序列:SEQ ID No:6_10。
[0065]圖4、ShSLF 與 ShS-RNase 的連鎖分析:
[0066]為了檢測(cè)ShSLF2和ShSLF6是否與S-RNase連鎖，我們對(duì)多毛番茄ShS1S5和ShS1S3以及它們雜交得到的F1代群體(31株)進(jìn)行了 CAPS分析。圖a，ShSLF2_S5，ShSLF2-S1和ShSLF2-S3核苷酸序列中TaqI的酶切位點(diǎn)示意圖。圖b，ShSLF6_S5，ShSLFe-S1和ShSLF6_S3核苷酸序列中AluI的酶切位點(diǎn)示意圖。圖C，以ShS1S5和ShS1S3基因組DNA為模版，使用引物ShSLF2_F和ShSLF2_R(表1)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，得到的產(chǎn)物用TaqI進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳后用溴化乙啶染色后檢測(cè)。圖d，以ShS1S5和ShS3S5基因組DNA為模版，使用引物ShSLF6-F和ShSLF6-R (表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的產(chǎn)物用AluI進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物在2.5%瓊脂糖凝膠中電泳后用溴化乙啶染色后檢測(cè)。圖e，ShS1S5和ShS1S3雜交產(chǎn)生的31株個(gè)體中，14株基因型為S3S5,17株基因型為S1S3，符合1:1的預(yù)期分離比(表2)。然后，我們利用該F1代群體，對(duì)ShSLF2進(jìn)行CAPS分析。結(jié)果如圖所示，ShSLF2_S5的CAPS分析的特異性條帶只出現(xiàn)在14株基因型為S3S5的植株中，而在17株基因型為S1S3中則完全檢測(cè)不到，表明ShSLF2-S5是S5-單倍型特異性的，與ShS5-RNase緊密連鎖。隨后，我們利用該F1代群體，對(duì)ShSLF6進(jìn)行CAPS分析。結(jié)果如圖所示，ShSLFe-S1的CAPS分析的特異性條帶只出現(xiàn)在17株基因型為S1S3的植株中，而在14株基因型為S3S5中則完全檢測(cè)不到，表明ShSLFe-S1是S1-單倍型特異性的，與ShS1-RNase緊密連鎖。圖中W表示用雙蒸水代替底物模版進(jìn)行PCR的陰性對(duì)照。
[0067]表1用于同源克隆多毛番爺ShSLF的引物
[0068]
【權(quán)利要求】
1.分離的多核苷酸序列，其包含或由選自下組之一的多核苷酸序列組成: a)SEQ ID No:1_5中任一項(xiàng)所不的多核苷酸序列； b)多核苷酸序列，其編碼SEQID No:6-10中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列，或編碼SEQ IDNo:6-10中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸但保留SEQID No:6-10的氨基酸序列的功能而得到的氨基酸序列； c)多核苷酸序列，其編碼與SEQID No:6-10中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列具有至少60 %的序列同一性，優(yōu)選至少70 %的序列同一性，優(yōu)選至少80 %的序列同一性，優(yōu)選至少90%的序列同一性，優(yōu)選至少95%的序列同一性和優(yōu)選至少99%的序列同一性的氨基酸序列； d)多核苷酸序列，其在嚴(yán)謹(jǐn)條件下，優(yōu)選中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下和更優(yōu)選高等嚴(yán)謹(jǐn)條件下可以與a)或b)或c)中任一項(xiàng)雜交； e)多核苷酸序列，其為a)_d)中任一項(xiàng)的活性片段。
2.權(quán)利要求1的多核苷酸序列,其由SEQID No:1_5中任一項(xiàng)所示的多核苷酸序列組成或由編碼SEQ ID No:6-10中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的多核酸序列組成。
3.重組載體或核酸構(gòu)建體，其包含權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)的至少一種多核苷酸序列。
4.一種轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其包含權(quán)利要求3中的重組載體或核酸構(gòu)建體。
5.—種在茄科植物`中參與控制種內(nèi)和種間生殖障礙的蛋白質(zhì)，其為具有SEQ ID No:6-10中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID No:6_10中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID No:6-10中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列相同的功能的由SEQ ID No:6-10中任一項(xiàng)衍生的蛋白質(zhì)。
6.權(quán)利要求5所述的蛋白質(zhì)，其特征在于:其氨基酸序列為SEQID No:6-10中任一項(xiàng)所示。
7.一種培育消除種內(nèi)及種間生殖障礙的茄科植物的方法，所述方法包括下述步驟: (1)將權(quán)利要求1-2所述的任一種多核苷酸序列導(dǎo)入所述茄科植物的細(xì)胞中，或者使用權(quán)利要求3的重組載體或核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染所述茄科植物的細(xì)胞；和 (2)將得到的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞培育成為轉(zhuǎn)基因植株，從而使所得到的轉(zhuǎn)基因植株消除了種內(nèi)及種間生殖障礙。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述茄科植物選自番茄、土豆或煙草。
9.一種消除茄科植物種內(nèi)和種間生殖障礙的方法，所述方法包括在所述茄科植物細(xì)胞中導(dǎo)入權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的至少一種多核苷酸序列或權(quán)利要求3的重組載體或核酸構(gòu)建體進(jìn)行過(guò)表達(dá)的步驟。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述茄科植物選自番茄、土豆或煙草。
11.權(quán)利要求1-2所述的多核苷酸序列、權(quán)利要求3所述的重組載體或核酸構(gòu)建體、權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和權(quán)利要求5-6所述的蛋白質(zhì)在調(diào)控茄科植物種內(nèi)或者種間傳粉受精方面的應(yīng)用。
12.權(quán)利要求1-2所述的多核苷酸序列、權(quán)利要求3所述的重組載體或核酸構(gòu)建體、權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或權(quán)利要求5-6所述的蛋白質(zhì)在消除茄科植物種內(nèi)或者種間生殖障礙方面的應(yīng)用。
13.權(quán)利要求11-12所述的應(yīng)用，其中所述茄科植物選自番茄、土豆或煙草。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK103484474SQ201310426075
【公開(kāi)日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2013年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月18日
【發(fā)明者】薛勇彪, 郭晗, 李群, 張玉娥, 孔昭勝 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所