解淀粉芽孢桿菌及利用其制備的防治菌劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物防治煙草病害【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種煙草內(nèi)生細菌及利用該菌制備防治菌劑。防治煙草黑脛病的解淀粉芽孢桿菌CX-1已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?No.7645。利用解淀粉芽孢桿菌CX-1制備的防治菌劑，通過菌種制備、菌液發(fā)酵、種子發(fā)酵液的制備、防治菌劑的制備等步驟實現(xiàn)。所制備的防治菌劑在稀釋100~1000倍后用于防治煙草黑脛病。由于解淀粉芽孢桿菌CX-1本身為煙草的內(nèi)生細菌，相較于其他外來引進菌種，更利于煙草病害的防治，對生態(tài)環(huán)境本身也更加安全。本發(fā)明所提供的防治菌劑的制備方法是在現(xiàn)有生物發(fā)酵工程基礎(chǔ)上的簡單改進，因此便于推廣應(yīng)用。
【專利說明】解淀粉芽孢桿菌及利用其制備的防治菌劑
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物防治煙草病害【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種防治煙草黑脛病的煙草內(nèi)生細菌解淀粉芽孢桿菌及利用該菌制備的防治菌劑。
【背景技術(shù)】
[0002]煙草既是我國重要的經(jīng)濟作物之一，也是受病害威脅最為嚴重的農(nóng)作物之一。煙草從育苗到采收的各個階段，都可受到病原物的侵害。煙草黑脛病(Tobacco Black Shank)是煙草生產(chǎn)上最具毀滅性病害之一，又稱“煙草疫病”，它是由寄生疫霉煙草致病變種{Phytophthora parasitica var.nicotianae (Breda de Hean) Tucker)引起的一種土傳性真菌病害。該病菌可在煙草苗期和大田期進行侵染，對烤煙、晾煙、曬煙、白肋煙、香料煙等所有栽培煙草均可造成嚴重危害，但主要危害移栽后的大田煙株。病菌侵染后，大田煙株的莖基部出現(xiàn)黑褐色凹陷病斑，并很快擴展至髓部，病株葉片自下而上依次變黃，雨后如遇高溫天氣整株葉片呈現(xiàn)凋萎。
[0003]煙草黑脛病最早發(fā)現(xiàn)于印度尼西亞的爪哇，隨后迅速蔓延到世界各地。目前該病害已遍布于全世界溫帶、亞熱帶和熱帶地區(qū)的煙田。我國煙草黑脛病危害嚴重的省份主要有安徽、河南、云南、四川、貴州、湖南、山東、福建等，據(jù)估測我國每年因黑脛病造成的直接經(jīng)濟損失超過I億元。
[0004]目前對于煙草黑脛病的防治主要有農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)藥物防治和篩選培育抗病苗株等幾類措施。農(nóng)業(yè)防治措施主要是實行與煙草黑脛病病菌非寄主植物進行輪作，生產(chǎn)實踐中這一措施對于發(fā)生黑脛病嚴重的田塊防效甚微，并且在我國人多地少的情況下實施輪作可行性較低。篩選培育抗病苗株的育種措施看似能從根本上解決黑脛病危害，但生產(chǎn)實踐中面臨很大的局限性，主要 表現(xiàn)為一方面可供區(qū)域栽培的抗性品種有限，另一方面抗病品種喪失抗病性的周期越來越短，甚至出現(xiàn)了育種速度趕不上品種抗性喪失的速度?；瘜W(xué)藥物防治黑脛病害近年來得到了極為廣泛的應(yīng)用，一些化學(xué)農(nóng)藥如甲霜靈、敵克松等在生產(chǎn)上已廣為使用，但對黑脛病的防治效果并不十分理想，并且黑脛病菌對此類化學(xué)藥劑已經(jīng)逐漸產(chǎn)生了抗藥性，同時化學(xué)農(nóng)藥的大量使用，勢必會降低煙葉的質(zhì)量和使用安全性，也給生態(tài)環(huán)境帶來嚴重的破壞。
[0005]近年來，隨著人類環(huán)境保護和自身健康意識的增強，利用生態(tài)學(xué)規(guī)律對各類病蟲害進行生物防治成為了研究熱點。生物防治具有防治成本低、綠色安全、環(huán)保無污染等優(yōu)良特點，因此是未來病蟲害綜合防控的最重要手段和發(fā)展方向。現(xiàn)有技術(shù)中，對于煙草黑脛病采用生物防治措施已有一些較好的實施例，例如中國專利號2007103000874(—種防治煙草黑胚病的菌株及其菌劑)所公布一種淡紫擬青霉ZY-19-2 {Padlomyces hVaci/HAs),屬于內(nèi)寄生性真菌；中國專利號200810233500.4 (一種防治煙草黑脛病的地衣芽孢桿菌菌劑及其制備方法)所公布的一種地衣芽孢桿菌GP13 {Bacillus 7icAe/7i/br?i5.),為革蘭氏陽性桿菌；再如中國專利號201210159083.X (一種兼抗煙草黑脛病和青枯病的生防菌株Trb3)所公布的一種枯草芽孢桿菌Trb3 (.Bacillus也為革蘭氏陽性菌。以上這些工作為防治煙草黑脛病的提供了一些新的選擇和方法，但是更加有效的防治黑脛病則仍然需要提供更多新的微生物菌種和防治方法。
[0006]解淀粉芽孢桿菌(ifeci77i/5.amyloliquefaciens)是一種工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用較為普遍的菌種，主要用于生產(chǎn)各類酶制劑(中國專利，201210277040.1)。近年來，對解淀粉芽孢桿菌的進一步研究發(fā)現(xiàn)，這類細菌在自身的生產(chǎn)過程中可以產(chǎn)生一系列的代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物具有廣泛地抑制真菌和細菌活性的作用，利用這一特性可以將其應(yīng)用于植物病害防治例如植物炭疽病防治和果蔬保鮮等方面(車曉曦、李校堃，解淀粉芽孢桿菌amyloli quefaci ens )的研究進展,2010,北京農(nóng)業(yè))。但是,解淀粉芽孢桿菌作為一種煙草內(nèi)生細菌，將其用于防治煙草黑脛病，則尚未見到有關(guān)報道和應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明目的在于提供解淀粉芽孢桿菌、利用其制備的防治菌劑。
[0008]本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
一種用于防治煙草黑胚病的解淀粉芽孢桿菌CX-1 {Bad Ilus amyloli quefaci ensCX-1),已于2013年5月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCCN0.7645。
[0009]一種利用解淀粉芽孢桿菌CX-1制備的防治煙草黑脛病的防治菌劑，通過以下步驟制備:
(O囷種制備
將解淀粉芽孢桿菌CX-1菌 種接種到試管斜面培養(yǎng)基上，32°C恒溫培養(yǎng)72小時，獲得試管種，斜面培養(yǎng)基配方為:葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，牛肉浸膏3 g/L，酵母浸膏I g/L，瓊脂 18 g/L, ρΗ6.8~7.0 ；
(2)菌液發(fā)酵
將在步驟(1)制備的試管種中加入IOml無菌水，用接種環(huán)洗下菌苔，充分震蕩形成細菌懸浮液，按照體積比1:200的比例將細菌懸浮液接種到無菌且容積為600ml的三角瓶中，三角瓶中裝有無菌且溫度低于35°C的培養(yǎng)液1，在轉(zhuǎn)速為120rpm、溫度為32 °C條件下的震蕩培養(yǎng)72小時，培養(yǎng)液I配方為:蔗糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，牛肉浸膏3 g/L，酵母浸膏Ig/L, ρΗ6.8~7.0 ；
(3)種子發(fā)酵液的制備
將步驟(2)制備的菌液與培養(yǎng)液2按照體積比為1:100的比例接入到容積為30L的種子罐中，種子罐內(nèi)的溶氧量為18%~20%，攪拌速度為180rpm，32°C條件下發(fā)酵，發(fā)酵至細菌含量大于2 X IO11 CFU/ml為止，培養(yǎng)液2配方為:蔗糖10 g/L，大豆蛋白胨10 g/L，酵母膏
1.5 g/L, MgSO4 0.5 g/L, FeSO4 0.1 g/L, ZnSO4 0.1 g/L, MnSO4 0.02g/L, KH2PO3 I g/L ；
(4)防治菌劑的制備
將步驟(3)制備的種子發(fā)酵液與培養(yǎng)液3按照體積比1:100的比例接入生產(chǎn)發(fā)酵罐，生產(chǎn)罐的溶氧量為18%~20%，攪拌速度為180rpm，32°C條件下發(fā)酵，發(fā)酵5小時后，每隔2小時對發(fā)酵罐進行發(fā)酵質(zhì)量檢測，觀察含菌量、測定發(fā)酵液的酸堿度，當(dāng)菌含量大于2X IO11CFU/ml，酸堿度為7.0~7.6時，存儲作為防治菌劑，培養(yǎng)液3配方為:蔗糖10 g/L，土豆200g/L, MgSO4 0.5 g/L, MnSO4 5g/L ；
步驟(4)所制備的防治菌劑在稀釋100-1000倍后用于防治煙草黑脛病。
[0010]步驟(4)所制備的防治菌劑在稀釋100倍后于煙苗移栽7d和14d后灌根施用，施用量為50ml/株。
[0011]本發(fā)明所采用的解淀粉芽孢桿菌CX-1菌株，屬于革蘭氏陽性細菌，對此類細菌在生物防治方面的應(yīng)用是目前的研究熱點，本發(fā)明所提供的此類細菌在煙草黑脛病防治方面的應(yīng)用為進一步開發(fā)利用此類細菌提供了新的可能。另一方面，由于此類細菌本身即為煙草的內(nèi)生細菌，當(dāng)其作為煙草病害的防治菌種時相較于其他外來引進菌種，更利于煙草病害的防治，對生態(tài)環(huán)境本身也更加安全。由于芽孢桿菌類細菌在工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用過程中的發(fā)酵制備技術(shù)較為完善，對其稍加改變即可用于制備生物防治菌劑，因此本發(fā)明所提供的生防菌劑的制備方法有利于此類細菌在生物防治應(yīng)用方面的推廣使用。
【具體實施方式】
[0012]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的解釋說明。
[0013]實施例1
解淀粉芽孢桿菌CX-1菌株已與2013年5月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.7645。
[0014]利用解淀粉芽孢桿菌CX-1菌株制備的防治煙草黑脛病防治菌劑，通過以下方法步驟制備:
(O囷種制備
將解淀粉芽孢桿菌CX-1菌株接種到試管斜面培養(yǎng)基上，32°C恒溫培養(yǎng)72小時，獲得試管種，斜面培養(yǎng)基配方為:葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，牛肉浸膏3 g/L，酵母浸膏I g/L，瓊脂 18 g/L, ρΗ6.8~7.0 ；
(2)菌液發(fā)酵
在步驟(1)制備的試管種中加入IOml無菌水，用接種環(huán)洗下菌苔，充分震蕩形成細菌懸浮液，按照體積比1:200的比例將細菌懸浮液接種到無菌且容積為600ml的三角瓶中，三角瓶中裝有無菌且溫度低于35°C的培養(yǎng)液1，然后在轉(zhuǎn)速為120rpm、溫度為32 1:條件下的震蕩培養(yǎng)72小時，培養(yǎng)液I配方為:蔗糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，牛肉浸膏3 g/L，酵母浸膏I g/L, ρΗ6.8~7.0 ；
(3)種子發(fā)酵液的制備
將步驟(2)制備的菌液與培養(yǎng)液2按照體積比為1:100的比例接入到容積為30L的種子罐中，種子罐內(nèi)的溶氧量18%~20%，攪拌速度為180rpm，32°C條件下發(fā)酵，發(fā)酵至細菌含量大于2 X IO11 CFU/ml為止，培養(yǎng)液2配方為:蔗糖10 g/L，大豆蛋白胨10 8/1，酵母膏1.5g/L, MgSO4 0.5 g/L, FeSO4 0.1 g/L, ZnSO4 0.1 g/L, MnSO4 0.02g/L, KH2PO3 I g/L ；
(4)防治菌劑的制備
將步驟(3)制備的種子發(fā)酵液與培養(yǎng)液3按照體積比1:100的比例接入生產(chǎn)發(fā)酵罐，生產(chǎn)罐的溶氧量為18%~20%，攪拌速度為180rpm，32°C條件下發(fā)酵，發(fā)酵5小時后，每隔2小時對發(fā)酵罐進行發(fā)酵質(zhì)量檢測，觀察含菌量、測定發(fā)酵液的酸堿度，當(dāng)菌含量大于2X IO11CFU/ml，酸堿度為7.0~7.6時，存儲作為防治菌劑，培養(yǎng)液3配方為:蔗糖10 g/L，土豆200g/L, MgSO4 0.5 g/L, MnSO4 5g/L ；
實施例2
為檢驗本發(fā)明所提供的解淀粉芽孢桿菌CX-1菌株針對煙草黑脛病的防治效果，發(fā)明人在溫室條件下進行了解淀粉芽孢桿菌CX-1菌株針對煙草黑脛病的防治實驗。
[0015]溫室實驗所用煙草試驗材料為品種K326，試驗地點為云南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家工程中心。本實驗中用于盆栽煙苗的土壤來自往年煙草黑脛病發(fā)病較重的田塊，即利用帶菌土壤中的病原菌誘發(fā)煙草黑脛病。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可根據(jù)實際情況利用土壤稀釋法從土壤中分離得到病原真菌，再回接煙株使煙株發(fā)病。
[0016]將實施例1所制備的解淀粉芽孢桿菌CX-1的防治菌劑分別稀釋成100倍、500倍、1000倍，分別在煙苗移栽7d和14d后灌根施用，施用量為50ml/株。以25%甲霜靈可濕性粉劑500倍液為藥劑對照，以清水為空白對照。每個處理3次重復(fù)，各處理隨機排列。
[0017]移栽后40天和60天各調(diào)查一次病情指數(shù)，病情指數(shù)計算方法如下:
病情指數(shù)=Σ [各級病株數(shù)X該病級值]X 100 /調(diào)查總株數(shù)X最高病級數(shù)值；其中煙草黑脛病分級標準參照中華人民共和國煙草行業(yè)標準(YC / T39-1996)規(guī)定執(zhí)行，即根據(jù)煙草發(fā)病病情分為5級，具體標準為:
O級:不發(fā)病；
I級:莖基部變?yōu)楹诤稚』L度不超過莖長1/4 ；
2級:黑褐色病莖長度達莖長1/4~1/2 ；
3級:病莖長度超過莖長1/2，且全株萎蔫；
4級:全株基本變?yōu)楹诤稚?，死亡?br> [0018]根據(jù)病情指數(shù)最終計算防治菌劑的相對防效，并據(jù)此數(shù)值判斷防治效果，相對防效的計算方法如下:
相對防效=(對照病情指數(shù)一處理病情指數(shù))XlOO /對照病情指數(shù) 具體調(diào)查結(jié)果如下表:
表1防治菌劑對煙草黑脛病防效的溫室試驗
【權(quán)利要求】
1.解淀粉芽抱桿菌CX-1 (.Bacillus amyloliquefaciens CX-1), 2013 年 5 月 27 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.7645。
2.一種利用權(quán)利要求1所述解淀粉芽孢桿菌CX-1制備的防治煙草黑脛病的防治菌劑，通過以下步驟制備: (O囷種制備 將解淀粉芽孢桿菌CX-1菌種接種到試管斜面培養(yǎng)基上，32°C恒溫培養(yǎng)72小時，獲得試管種，斜面培養(yǎng)基配方為:葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，牛肉浸膏3 g/L，酵母浸膏I g/L，瓊脂 18 g/L, ρΗ6.8~7.0 ； (2)菌液發(fā)酵 在步驟(1)制備的試管種中加入IOml無菌水，用接種環(huán)洗下菌苔，充分震蕩形成細菌懸浮液，按照體積比1: 200的比例將細菌懸浮液接種到容積為600ml的無菌三角瓶中，三角瓶中裝有溫度低于35°C的無菌培養(yǎng)液1，在轉(zhuǎn)速為120rpm、溫度為32 1:條件下的震蕩培養(yǎng)72小時，培養(yǎng)液I配方為:蔗糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，牛肉浸膏3 g/L，酵母浸膏I g/L，ρΗ6.8~7.0 ； (3)種子發(fā)酵液的制備 將步驟(2)制備的菌液與培養(yǎng)液2按照體積比為1: 100的比例接入到容積為30L的種子罐中，種子罐內(nèi)的溶氧量為18%~20%，攪拌速度為180rpm，32°C條件下發(fā)酵，發(fā)酵至細菌含量大于2 X IO11 CFU/ml為止，培養(yǎng)液2配方為:蔗糖10 g/L，大豆蛋白胨10 g/L，酵母膏 1.5 g/L, MgSO4 0.5 g/L, FeSO4 0.1 g/L, ZnSO4 0.1 g/L, MnSO4 0.02g/L, KH2PO3 I g/L ； (4)防治菌劑的制備 將步驟(3)制備的種子發(fā)酵液與培養(yǎng)液3按照體積比1: 100的比例接入生產(chǎn)發(fā)酵罐，生產(chǎn)罐的溶氧量為18%~20%，攪拌速度為180rpm，32°C條件下發(fā)酵，發(fā)酵5小時后，每隔2小時對發(fā)酵罐進行發(fā)酵質(zhì)量檢測，觀察含菌量、測定發(fā)酵液的酸堿度，當(dāng)菌含量大于2 X IO11〇?~1111、？!1為7.0~7.6時，存儲作為防治菌劑，培養(yǎng)液3配方為:蔗糖10 g/L，土豆200 g/L, MgSO4 0.5 g/L, MnSO4 5g/L。
3.權(quán)利要求2所述防治菌劑的應(yīng)用，用于防治煙草黑脛病。
4.如權(quán)利要求3所述防治菌劑的應(yīng)用，其特征在于:防治菌劑稀釋100-1000倍后灌根使用。
5.如權(quán)利要求4所述防治菌劑的應(yīng)用，其特征在于:防治菌劑稀釋100倍后分別于煙苗移栽7d和14d時灌根施用，施用量為50ml/株。
【文檔編號】A01N63/00GK103602610SQ201310440630
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月25日
【發(fā)明者】陳小龍, 王軍, 馮劍, 謝劍, 吳慶華, 高尊華, 劉愛玲, 王墨染, 張展, 王逸飛, 尹光庭, 韓冰, 王建忠 申請人:河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司