一種防控蔬菜真菌病害的深綠木霉制劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種防控蔬菜真菌病害的深綠木霉菌劑及其制備方法。該木霉菌菌株Tr1208為深綠木霉（Trichodermaatroviride），保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo.6828。深綠木霉菌劑是以深綠木霉Tr1208菌體為有效活性成分，配以農(nóng)業(yè)上可以接受的載體及保護(hù)劑制成；其中效活性成分含菌量為1.0~30.0×108個孢子/克；菌體保護(hù)劑含量為0.05~1.8%。菌劑可有效防治韭菜灰霉病、黃瓜褐斑病、黃瓜白粉病、黃瓜霜霉病、番茄早疫病、瓜果類立枯病、瓜果類枯萎病、瓜果類根腐病，并對植物有促進(jìn)生長作用，具有高效、抑菌譜廣、使用簡單、成本低、無環(huán)境污染、改善植株微生態(tài)環(huán)境的特點。
【專利說明】一種防控蔬菜真菌病害的深綠木霉制劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物農(nóng)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種拮抗蔬菜病原真菌的深綠木霉制劑及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著我國農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整步伐的加快和人民生活水平的提高，蔬菜品種的多樣化及周年均衡供應(yīng)的需求日益增強(qiáng)，我國蔬菜生產(chǎn)的規(guī)模不斷擴(kuò)大，產(chǎn)量穩(wěn)步上升，已成為我國種植業(yè)中僅次于糧食的第二大農(nóng)作物。據(jù)農(nóng)業(yè)部農(nóng)情統(tǒng)計，2009年我國蔬菜種植面積占全球的43%，總產(chǎn)量占世界的49.6%?？偖a(chǎn)量及出口量均居世界第一，堪稱世界第一蔬菜大國。
[0003]但是隨著我國蔬菜生產(chǎn)的發(fā)展，栽培模式的多樣性，蔬菜栽培種類和品種的豐富性，尤其是栽培環(huán)境的多樣化，導(dǎo)致某些次要病害上升，病原菌寄主范圍擴(kuò)大，產(chǎn)生了許多亟待研究的新病害，一些新老病害交替為害，這些都嚴(yán)重制約著我國蔬菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。其中韭菜灰霉病、黃瓜褐斑病、黃瓜白粉病、黃瓜霜霉病、番茄早疫病、瓜果類立枯病、瓜果類枯萎病、瓜果類根腐病等真菌性病害，均發(fā)生較為嚴(yán)重，造成嚴(yán)重減產(chǎn)、甚至絕收，已成為蔬菜生產(chǎn)的限制性障礙。目前防治該類病害仍主要采用化學(xué)藥劑，常常剛用完藥就采收銷售，不僅造成蔬菜污染，同時還極易造成抗藥性問題。因此研發(fā)安全與環(huán)境相和諧的微生物農(nóng)藥成為必然，其中木霉這類有益微生物，由于其具有廣譜的抗病能力和調(diào)節(jié)微生態(tài)、誘導(dǎo)抗性作用，而被研究用于植物病害生物防治和改善作物生長。
[0004]木霉是自然界中普遍存在的一類真菌，在土壤、植物根圍、葉圍及種子、球莖表面經(jīng)?？梢苑蛛x到。近些年人們發(fā)現(xiàn)某些木霉是植物病原真菌的寄生菌或拮抗菌，如哈茨木霉(J.Aarzia/?a?)、鉤狀木霉(71.a?)、綠色木霉(71.n'riofe)可以防治真菌病害。迄今為止有關(guān)木霉在生防方面的研究已開展近70年，在國外已經(jīng)出現(xiàn)了商品化的木霉制劑。如以防治李屬果樹銀葉病(CXofl i/riasierew? /w/r/w/rew?)的木霉制劑在西歐已商品化生產(chǎn)；以色列的Makhteshim Agan公司開發(fā)的以哈茨木霉T39菌株為發(fā)酵液的生防制劑,商品名Trichodex,劑型為25%可濕粉,它可以用于防治灰霉病菌iBotrytis ciflerea)、菌核病菌{Scleratina sclerotiorum^V^^^iCladosporium fulvum)等病害，在國內(nèi)也有研究利用木霉菌控制植物病害。21世紀(jì)被稱為環(huán)保世紀(jì)，化學(xué)藥劑的應(yīng)用逐步受到限制，因此對蔬菜病害的生物防治研究自然稱為熱點問題。
[0005]本發(fā)明正是基于以上原因，以目前蔬菜為害較為嚴(yán)重，又缺乏生物防治手段的的韭菜灰霉病、黃瓜褐斑病、黃瓜白粉病、黃瓜霜霉病、番茄早疫病、瓜果類立枯病、瓜果類枯萎病、瓜果類根腐病為靶標(biāo)，從微生物資源中尋找具有高效拮抗活性的微生物，擬為研究開發(fā)新型生物菌劑尋找新的資源。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明旨在提供一種防治蔬菜病害的深綠木霉制劑及其制備方法，可以用于防治蔬菜真菌病害，解決化學(xué)農(nóng)藥防治帶來的農(nóng)藥殘留、抗藥性和環(huán)境污染問題。本發(fā)明可用于防治韭菜灰霉病、黃瓜褐斑病、黃瓜白粉病、黃瓜霜霉病、番茄早疫病、瓜果類立枯病、瓜果類枯萎病、瓜果類根腐病等，具有高效、光譜、性能穩(wěn)定、可規(guī)?；a(chǎn)的蔬菜微生物菌劑。為實現(xiàn)此目的，本發(fā)明公開了如下的技術(shù)內(nèi)容:
一株具有拮抗蔬菜病原真菌活性的深綠木霉菌株，其特征在于該菌株為深綠木霉Trl208 (Trichoderma atroviride),已于2012年11月15日保藏中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCN0.6828。保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中科院微生物研究所。
[0007]本發(fā)明保藏的深綠木霉菌株Trl208 {Trichoderma atrwiriofe)的生理、生化特性如下:
木霉菌株Trl208在PDA平板上生長迅速，菌落在3天內(nèi)覆蓋直徑90mm的平板，呈輻射狀，表面疏松平坦；在培養(yǎng)的第3天明顯可見有孢子產(chǎn)生，最初為淡綠色，以后逐漸增多，呈現(xiàn)深綠色，產(chǎn)孢叢束排列成同心的輪紋。顯微觀察培養(yǎng)的菌絲體無色、分枝繁復(fù)，由具有橫隔的分枝菌絲構(gòu)成；產(chǎn)生的分生孢子無隔膜，呈球形，聚成頭狀排列，單生，細(xì)胞壁存在明顯而微小的粗糙突起。余下量為碳酸鈣和硅藻土載體，其中碳酸鈣:硅藻土的重量份數(shù)比為1:2~5。
[0008] 本發(fā)明進(jìn)一步公開了一種深綠木霉菌劑，其特征在于它是由保藏號為CGMCCN0.6828的深綠木霉Tr 1208 (Trichoderma a troviride )菌體和它的次生代謝物為有效活性成分，配以農(nóng)業(yè)上可以接受的載體以及菌體保護(hù)劑組成；其中有效活性成分為
1.0^30.0XlO8個孢子/克，菌體保護(hù)劑含量為0.05~1.8% (w/w)。
[0009]本發(fā)明優(yōu)選的深綠木霉菌劑，其特征在于它是由保藏號為CGMCCN0.6828的深綠木霉Trl208 {Trichoderma airoririofe)菌體為有效活性成分,配以農(nóng)業(yè)上可以接受的載體以及菌體保護(hù)劑組成；其中有效活性成分為1.0-30.0X IO8個孢子/克，菌體保護(hù)劑含量為 0.05~1.8% (w/w)。
[0010]本發(fā)明所述的深綠木霉菌劑，其菌體為深綠木霉分生孢子、菌絲和厚垣孢子的混合物；農(nóng)業(yè)上可接受的載體為:硅藻土、碳酸鈣、水、小麥粉、木屑、高嶺土、不飽和烴類一種或幾種的混合物；所述的菌體保護(hù)劑為黃原膠、蔗糖、腐植酸鈉、黃腐酸鉀一種或幾種的混合物。
[0011]本發(fā)明更加優(yōu)選的深綠木霉菌劑，其特征在于它是由下述成分組成:
深綠木霉Trl208含菌量為1.0^30.0XlO8個孢子/克，
黃原膠 0.05~0.1% (w/w),
鹿糖 I~1.5% (w/w),
腐植酸鈉或黃腐酸鉀0.05、.2% (w/w)
本發(fā)明更進(jìn)一步公開了深綠木霉菌劑的制備方法，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行:
1)菌種活化:保藏號為CGMCCN0.6828 的深綠木霉 Trl208 (.Trichoderma atroviride')的菌株在在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中活化72h，備用；
所述的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(簡稱PDA培養(yǎng)基)組成為:馬鈴薯300克、葡萄糖20克、瓊脂15~20克、自來水1000毫升，自然pH ；
2)種子液制備:活化后的深綠木霉Trl208菌株，在23~28°C下，小麥粉培養(yǎng)液或理查培養(yǎng)液震蕩培養(yǎng)72、6h，培養(yǎng)后得到深綠木霉Trl208種子液；所述的小麥粉培養(yǎng)液組成為:全麥粉20g、葡萄糖20g、酵母膏2g，水lOOOmL，pH6.8~
7.2 ；
理查培養(yǎng)液指的是:硝酸鉀1(^，磷酸二氫鉀58，硫酸鎂2.5 g，氯化鐵0.02 g，蔗糖50g,水 1000 mL, pH6.8 ~7.2 ;
3)固體發(fā)酵培養(yǎng):在固體發(fā)酵培養(yǎng)基料中加入水2(T45%(w/w),初始pH為6.5^7.5之間，高溫滅菌，然后待溫度降到30°C以下，接入步驟2)的種子液，再在溫度為2(T30°C，間隔24~30h，定期攪拌的條件下發(fā)酵培養(yǎng)96~148h ；
所述的固體發(fā)酵培養(yǎng)基料(w/w)的組成為:麥粉2~4%，麥麩12~18%，食用菌廢料渣或/和木屑77.f 84%，過磷酸鈣0.5~1%，尿素0.2~0.5%，蔗糖0.2~0.5%，潤水后滅菌備用；
4)測定發(fā)酵培養(yǎng)基料中菌體的數(shù)量，待發(fā)酵基料中孢子量達(dá)到IO9cfu/g以上后停止發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)物料經(jīng)常溫干燥，采用萬能粉碎機(jī)粉碎后成深綠木霉母粉；
5)制備深綠木霉菌劑:以含菌量為2.0^60.0XlO8個孢子/克深綠木霉Tr 1208母粉，黃原膠0.05、.1%，蔗糖f 1.5%，腐植酸鈉或黃腐酸鉀0.05、.2%，余下量為碳酸鈣和硅藻土載體，其中碳酸鈣:硅藻土的重量份數(shù)比=1:2~5，混合制備深綠木霉菌劑。
[0012]本發(fā)明同時也公開了深綠木霉Trl208 {Trichoderma airoririofe)菌株在制備作為防控蔬菜真菌病害菌劑中的應(yīng)用。優(yōu)選在作為防治韭菜灰霉病、黃瓜褐斑病、黃瓜白粉病、黃瓜霜霉病、番茄早疫病、瓜果類立枯病、瓜果類枯萎病、瓜果類根腐病菌劑中的應(yīng)用以及作為促進(jìn)植物生長制劑中的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明可以制成各種劑型，如可濕性粉劑、粉塵劑、顆粒劑和懸浮劑等，還可以加入其它有效活性成分進(jìn)行復(fù)配以及增效劑、穩(wěn)定劑，以提高制劑的藥效和農(nóng)業(yè)上的實用性。
[0014]本發(fā)明選用碳酸鈣為載體，碳酸鈣顆粒的直徑為0.074mm。
[0015]本發(fā)明選用娃藻土為載體，娃藻土顆粒的直徑為0.074mm。
[0016]所述的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(簡稱PDA培養(yǎng)基)組成為:馬鈴薯300克、葡萄糖20克、瓊脂15~20克、自來水1000毫升，自然pH ；
小麥粉培養(yǎng)液組成為:全麥粉20g、葡萄糖20g、酵母膏2g，加水lOOOmL，pH6.8~7.2。
[0017]本發(fā)明提供深綠木霉菌劑防治蔬菜病害的施用方法是:將菌劑兌水500-1000倍液，于蔬菜地上部分均勻噴霧，或是于植株灌根施用，也可采用土壤撒施的方法進(jìn)行土壤處理，以達(dá)到控制蔬菜病害的目的，可有效防治韭菜灰霉病、番茄灰霉病、黃瓜褐斑病、黃瓜白粉病、黃瓜霜霉病、番茄早疫病、瓜果類枯萎病、瓜果類根腐病防效達(dá)70%~89%，并且對植物生長有明顯的促進(jìn)生長作用。
[0018]本發(fā)明公開的深綠木霉深綠木霉菌劑與現(xiàn)有技術(shù)相比所具有的積極效果在于:
(1)本發(fā)明公開的深綠木霉菌劑對蔬菜真菌病害有較好效果，與現(xiàn)有技術(shù)相比防效明顯提聞;
(2)本發(fā)明公開的深綠木霉菌劑可有效防治韭菜灰霉病、番爺灰霉病、黃瓜褐斑病、黃瓜白粉病、黃瓜霜霉病、番茄早疫病、瓜果類枯萎病、瓜果類根腐病，防治范圍有所增加；
(3)本發(fā)明公開的深綠木霉菌劑對植物生長有明顯的誘抗和促進(jìn)生長作用。
【具體實施方式】
[0019]本發(fā)明實質(zhì)性特點可以從下述實施例中得以體現(xiàn)，但是這些實施例僅作為說明，而不是對本發(fā)明進(jìn)行限制，本領(lǐng)域的專業(yè)人員按照本發(fā)明的精神可以對其進(jìn)行改進(jìn)和變化，所述的這些改進(jìn)和變化都應(yīng)視為在本發(fā)明的范圍內(nèi)，本發(fā)明的范圍和實質(zhì)由權(quán)利要求來限定，下面通過實例來進(jìn)一步闡明本發(fā)明深綠木霉菌株的制備方法及應(yīng)用。下述實施例中的實驗方法和試劑，如無特別說明，均為常規(guī)方法并均有市售。
[0020]實施例1:
深綠木霉的篩選分離與鑒定。
[0021]通過平皿對峙培養(yǎng)進(jìn)行拮抗木霉菌篩選，發(fā)現(xiàn)深綠木霉Trl208對韭菜灰霉病、番茄灰霉病、黃瓜褐斑病、番茄早疫病、瓜果類枯萎病、瓜果類根腐病等病原真菌有較強(qiáng)的拮抗作用，經(jīng)檢測其對蔬菜多種病原菌有較強(qiáng)的抑制作用。
[0022]表1、深綠木霉Trl208對韭菜灰霉病菌、黃瓜褐斑病菌、番茄早疫病、瓜果類枯萎病、瓜果類根腐病的抑菌效果
【權(quán)利要求】
1.一株具有拮抗蔬菜病原真菌活性的深綠木霉菌株，其特征在于該菌株為深綠木霉Trl208 {Trichoderma atroviride),已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCN0.6828。
2.—種深綠木霉菌劑，其特征在于它是由保藏號為CGMCCN0.6828的深綠木霉Trl208iTrichoderma atroviride)菌體和它的次生代謝物為有效活性成分,配以農(nóng)業(yè)上可以接受的載體以及菌體保護(hù)劑組成；其中有效活性成分為1.0-30.0X IO8個孢子/克，菌體保護(hù)劑含量為 0.05~1.8% (w/w)。
3.權(quán)利要求2所述的深綠木霉菌劑，其特征在于它是由保藏號為CGMCCN0.6828的深綠木霉Trl208 {Trichoderma airoririofe)菌體為有效活性成分,配以農(nóng)業(yè)上可以接受的載體以及菌體保護(hù)劑組成；其中有效活性成分為1.0-30.0X IO8個孢子/克，菌體保護(hù)劑含量為 0.05~1.8% (w/w)。
4.權(quán)利要求2所述的深綠木霉菌劑，其中所述的菌體為深綠木霉分生孢子、菌絲和厚垣孢子的混合；農(nóng)業(yè)上可接受的載體為:硅藻土、碳酸鈣、水、小麥粉、木屑、高嶺土、不飽和烴類一種或幾種的混合物；所述的菌體保護(hù)劑為黃原膠、蔗糖、腐植酸鈉、黃腐酸鉀一種或幾種的混合物。
5.權(quán)利要求2-4任一項所述的深綠木霉菌劑，其特征在于它是由下述成分組成:
深綠木霉Trl208含菌量為1.0^30.0XlO8個孢子/克，
黃原膠 0.05~0.1% (w/w),
鹿糖 I~1.5% (w/w), 腐植酸鈉或黃腐酸鉀0.05、.2% (w/w) 余下量為碳酸鈣和硅藻土載體，其中碳酸鈣:硅藻土的重量份數(shù)比為1:2~5。
6.權(quán)利要求2-4任一項所述深綠木霉菌劑的制備方法，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行: 1)菌種活化:保藏號為CGMCCN0.6828 的深綠木霉 Trl208 (.Trichoderma atroviride^)的菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中活化72h，備用； 所述的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(簡稱PDA培養(yǎng)基)組成為:馬鈴薯300克、葡萄糖20克、瓊脂15~20克、自來水1000毫升，自然pH ； .2)種子液制備:活化后的深綠木霉Trl208菌株，在23~28°C下，小麥粉培養(yǎng)液或理查培養(yǎng)液震蕩培養(yǎng)72、6h，培養(yǎng)后得到深綠木霉Trl208種子液； 所述的小麥粉培養(yǎng)液組成為:全麥粉20g、葡萄糖20g、酵母膏2g，水lOOOmL，pH6.8~.7.2 ； 理查培養(yǎng)液組成為:硝酸鉀10g，磷酸二氫鉀5g，硫酸鎂2.5 g，氯化鐵0.02 g，蔗糖50g,水 1000 mL, pH6.8 ~7.2 ; 3)固體發(fā)酵培養(yǎng):在固體發(fā)酵培養(yǎng)基料中加入水2(T45%(w/w),初始pH為6.5^7.5之間，高溫滅菌，然后待溫度降到30°C以下，接入步驟2)的種子液，再在溫度為2(T30°C，間隔.24~30h，定期攪拌的條件下發(fā)酵培養(yǎng)96~148h ； 所述的固體發(fā)酵培養(yǎng)基料(w/w)的組成為:麥粉2~4%，麥麩12~18%，食用菌廢料渣或/和木屑77.f 84%，過磷酸鈣0.5~1%，尿素0.2~0.5%，蔗糖0.2~0.5%，潤水后滅菌備用； .4)測定發(fā)酵培養(yǎng)基料中菌體的數(shù)量，待發(fā)酵基料中孢子量達(dá)到IO9cfu/g以上后停止發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)物料經(jīng)常溫干燥，采用萬能粉碎機(jī)粉碎、過篩后成深綠木霉母粉； 5)制備深綠木霉菌劑:以含菌量為2.0^60.0XlO8個孢子/克深綠木霉Tr 1208母粉，黃原膠0.05、.1%，蔗糖f 1.5%，腐植酸鈉或黃腐酸鉀0.05、.2%，余下量為碳酸鈣和硅藻土載體，其中碳酸鈣:硅藻土的重量份數(shù)比=1:2~5，混合制備深綠木霉菌劑。
7.權(quán)利要求1所述深綠木霉Trl208(.Trichoderma airoririofe)菌株在制備作為防控蔬菜真菌病害菌劑中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述深綠木霉Trl208(.Trichoderma airoririofe)菌株在制備作為防治韭菜灰霉病、黃瓜褐斑病、黃瓜白粉病、黃瓜霜霉病、番茄早疫病、瓜果類立枯病、瓜果類枯萎病、瓜果類根腐病菌劑中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1所述深綠木霉Trl208(.Trichoderma airoririofe)菌株在制備作為促進(jìn)植物生長菌劑中的 應(yīng)用。
【文檔編號】A01P3/00GK103484384SQ201310462539
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年10月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月8日
【發(fā)明者】王勇, 高葦, 王萬立, 張春祥, 郝永娟, 劉春艷, 霍建飛 申請人:天津市植物保護(hù)研究所