一種生防菌株bs102及其在防治植物灰霉病中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種生防菌株BS102及其在防治植物灰霉病中的應用，所述的生防菌株BS102為枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis）BS102，保藏編號為CGMCC?No.7728。所述的應用包括：制備含所述生防菌株BS102的生防菌劑；將所述的生防菌劑噴施在所述的植物上。本發(fā)明的生防菌株對灰葡萄孢的拮抗作用強烈，可用于灰霉病的防治。且本發(fā)明提供了灰霉病的生物防治方法，不使用化學農藥，具有無毒、不易產生抗藥性、環(huán)境和生物安全等優(yōu)點，具有廣闊的應用前景。
【專利說明】一種生防菌株BS102及其在防治植物灰霉病中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于作物病害防控【技術領域】，尤其涉及一種生防菌株BS102及其在防治植物灰霉病中的應用。
【背景技術】
[0002]灰葡萄孢(Botrytis cinerea Pers.:Fr.)可以對儲存期的梨果造成危害。侵染初期果實表面產生圓形或近圓形水潰狀病斑，不凹陷，逐漸擴大后形成淺黃褐色不規(guī)則形軟腐病斑。后期病部失水，表皮逐漸皺縮凹陷，以至全果軟腐皺縮。潮濕條件下，病斑表面可產生疏松的灰白色棉毛狀物，后期棉毛狀物上產生鼠灰色霉粉，有時還可產生不規(guī)則形黑色顆粒。雖然儲存期梨上的灰霉病不是梨生產上的主要病害，但由于采收成熟度和采收方法的不當，可造成機械損傷，這些傷口可以作為病原菌的通道。據(jù)聯(lián)合國糧農組織調查報告顯示，采收過程中不當?shù)臋C械損傷可使果蔬損失達8~12%。此外，目前我國水果采集技術和產后水果的儲存條件都非常有限，而且對產后病害的防控比較薄弱。因此，儲存期梨果上的灰霉病仍能造成嚴重經濟損失。
[0003]在農業(yè)生產中，使用化學藥劑是防治多種經濟作物灰霉病的主要措施，常見藥劑有多菌靈、撲海因、嘧霉胺等。但由于產后水果病害的防控是病害控制的最后一道防線，目前可使用的殺菌劑非常有限。此外，灰葡萄孢產孢量大，生長周期短，很容易對殺菌劑產生抗藥性，已有研究發(fā)現(xiàn)，我國灰霉病菌已對多種殺菌劑如多菌靈、撲海因等產生嚴重抗藥性問題。因此，對于灰霉病的防控，我們急需尋找更為有效的防治方法。此外，由于化學殺菌劑具有廣譜性，其大量使用不僅容易破壞微生態(tài)環(huán)境，而且還導致非靶標抗性。
[0004]在非化學性防治措施中，生物防治為最有前途的方法之一，其具有環(huán)境友好、無農殘、防效較好等優(yōu)點。目前雖已有一些灰葡萄孢拮抗微生物的報道，如藤黃灰鏈霉素(Sti^ptomyces luteogriseus) EC000001 (專利 CN200610048662.1)、粉紅粘帚菌(Bionectria ochroleuca) WY-1 (專利 CN200910072862.4)等，但尚未出現(xiàn)對芽孢桿菌的報道。另外，國內已有利用拮抗細菌生物防治由引起的番茄和百合的灰霉病(如和CN200710014340)，但防效較差，且缺乏其他作物灰霉病生防菌株的研究報道。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明提供了一種生防菌株BS102，對灰葡萄孢菌菌絲生長、孢子萌發(fā)有較好的抑制作用，對植物灰霉病尤其是梨灰霉病具有較好的防治效果。
[0006]本發(fā)明提供了一種生防菌株BS102，分類命名枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，完整命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BS102，已于2013年6月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為=CGMCC N0.7728。
[0007]該菌株BS102在LB培養(yǎng)基上菌落表面粗糙、不透明，呈現(xiàn)皺縮、白色，能夠形成芽抱，能移動，需氧型。
[0008]本發(fā)明還提供了所述生防菌株BS102在防治植物灰霉病中的應用。[0009]所述的植物具體可以為梨。
[0010]梨的品種可以為皇冠。
[0011]所述應用具體包括:
[0012](I)制備含所述生防菌株BS102的生防菌劑；
[0013](2)將所述的生防菌劑噴施在所述的植物上。
[0014]噴施生防菌劑時，噴施至植物表面水珠流動即可。
[0015]如對梨灰霉病進行防治時，可在儲藏期將所述的生防菌劑噴施在梨果實上，噴施至梨果實表面水珠流動即可，噴施結束后可將梨果實20~25°C保濕20~24h。
[0016]為達到較好的防治效果，所述的生防菌劑中，所述生防菌株BS102的濃度優(yōu)選為I X IO8 ~10lclCFU/mL，更優(yōu)選為 I X 108CFU/mL。
[0017]所述生防菌劑可通過如下方法進行制備:
[0018](I)將所述生防菌株BS102于培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD6tltl為0.5~0.8，獲得種子液；
[0019](2)將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)液中擴大培養(yǎng)，調節(jié)發(fā)酵液中生防菌株BS102的濃度至I X IO8~101(lCFU/mL，獲得所述生防菌劑。
[0020]所述的培養(yǎng)基可選用LB液體培養(yǎng)基。
[0021]其中，所述種子液的接種量優(yōu)選為I~2% (v/v)，優(yōu)選為1% (v/v)0
[0022]以每升計，所述發(fā)酵培養(yǎng)液的配方為:葡萄糖，18~22g ；L-谷氨酸，2.4~2.6g ;L-天門冬酰胺，2.4 ~2.6g ;ΚΗ2Ρ04，0.8 ~1.2g ；MgS04.7Η20，0.4 ~0.6g ;KC1，0.4 ~0.6g ；酵母粉，0.8 ~1.2g ;L-苯丙氨酸，2 ~3X 10_3g ；MnS04.H2O, 5 ~6X IO^3g ；CuSO4.5H20,
0.16 ~0.18X10、；FeS04.7Η20，0.15 ~0.17 X l(T3g ;調節(jié) pH 值為 7.0。
[0023]作為進一步優(yōu)選，以每升計，所述發(fā)酵培養(yǎng)基液的配方為:葡萄糖，20g;L-谷氨酸，2.5g ;L-天門冬酰胺，2.5g ；KH2PO4, Ig ；MgS04.7Η20，0.5g ；KC1,0.5g ;酵母粉，Ig ；L-苯丙氨酸，2Xl(T3g ；MnSO4.H20，5Xl(T3g ；CuSO4.5Η20，0.16X10、；FeS04.7H20,0.15X10、；調節(jié)pH值為7.0。該發(fā)酵培養(yǎng)液由Landy培養(yǎng)基改良而來，更有利于本發(fā)明所述枯草芽孢桿菌的增殖。
[0024]本發(fā)明中，所述擴大培養(yǎng)是發(fā)酵罐中進行的，所述擴大培養(yǎng)的溫度為28~30°C，優(yōu)選為30°C，所述擴大培養(yǎng)的時間為20~24h。在該培養(yǎng)條件下，在保證菌活力的同時使其具有較快的增殖速度。
[0025]擴大培養(yǎng)過程中，發(fā)酵液pH值維持在7.0,溶氧量20%，通氣量5_7m3/小時，轉速240~260r/min，罐壓0.05-0.1KPa0發(fā)酵液出罐后梯度稀釋涂板檢測并調節(jié)菌懸液濃度為IXlO8 ~1010CFU/mL。
[0026]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果為:
[0027](I)本發(fā)明的生防菌株BS102為枯草芽孢桿菌，生防菌BS102菌體和上清在平板拮抗試驗中顯示對灰葡萄孢菌菌絲生長、孢子萌發(fā)有較好的抑制作用，可將其應用于植物灰霉病的生物防治。
[0028](2)光照培養(yǎng)箱進行的梨果實灰霉病防治試驗效果顯示，本發(fā)明的生防菌株BS102能有效抑制病菌在梨果實表面的病斑擴展，防效高達90%，在貯藏條件下，本發(fā)明的生防菌株BS102對梨灰霉病的防效仍可達到68%以上，防治效果好，因此可利用該生防菌株BS102防治梨灰霉病。[0029](3)本發(fā)明生防菌株BS102應用于植物灰霉病的防治，可完全克服因化學農藥的使用所帶來的一系列問題，因而有利于農產品的無公害生產，農民可以不用或減少其他化學農藥的用量，這不僅可為農民節(jié)省開支，而且有利于提高產品質量。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1為生防菌BS102的菌落形態(tài)圖。
[0031]圖2為生防菌BS102平板拮抗灰葡萄孢菌菌絲生長。
[0032]圖3為生防菌BS102無菌上清抑制灰葡萄孢菌菌絲生長。
[0033]圖4為生防菌BS102無菌上清抑制灰葡萄孢菌孢子萌發(fā)。
[0034]圖5為BS102生防菌劑光照培養(yǎng)箱防治皇冠灰霉病效果。
【具體實施方式】
[0035]下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步闡釋。
[0036]實施例1 BS102生防菌株的采集、分離和鑒定
[0037]BS102菌株分離自江蘇省海安縣小麥麥穗上。取小麥麥穗磨碎，80°C水浴10分鐘后涂布于LB平板上；次日挑取菌落進行純化培養(yǎng)。
[0038]菌株BS102在LB培養(yǎng)基上菌落表面粗糙、不透明，呈現(xiàn)皺縮、白色(見圖1 )，能夠形成芽抱，能移動，需氧型。
[0039]提取該菌株的DNA，擴增16S rDNA序列，進行測序，該菌株的16S rDNA如SEQ IDN0.1所示,序列在NCBI中的比對結果顯示與枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的同源性`最聞。
[0040]該菌株已保存在位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期為2013年6月18日，保藏編號為=CGMCCN0.7728。
[0041]實施例2生防菌劑的制備
[0042]1、生防菌劑的制備
[0043](I)將生防菌株BS102接種到LB培養(yǎng)液中，30°C，180r/min振蕩培養(yǎng)，12~16小時后在超凈工作臺中分別取樣測600nm處的OD值，OD測定過程中以未接菌的培養(yǎng)液來調零；
[0044](2)當振蕩培養(yǎng)至菌液的OD值為0.5~0.8之間時即為種子菌液，將種子菌液以體積比為1:100加入裝有發(fā)酵培養(yǎng)液的200L發(fā)酵罐中，30°C 250r/min振蕩培養(yǎng)20~24小時，發(fā)酵液PH值維持在7.0，溶氧量為20%，通氣量5-7m3/小時，罐壓為0.05-0.1KPa0發(fā)酵液出罐后梯度稀釋涂板檢測并調節(jié)菌懸液濃度約為I X 109cfu/ml。
[0045]發(fā)酵培養(yǎng)液的配方(每升)為:葡萄糖，20g ;L_谷氨酸，2.5g ;L_天門冬酰胺，2.5g ；KH2PO4, Ig ；MgS04.7Η20，0.5g ；KC1,0.5g ;酵母粉，Ig ;L_ 苯丙氨酸，2X 10_3g ；MnSO4.H2O,5X 10_3g ；CuSO4.5Η20，0.16X 10_3g ；FeS04.7Η20，0.15X10、；調節(jié) pH 值為 7.0。
[0046]實施例3 BS102生防菌株對灰葡萄孢菌的拮抗活性測定
[0047]1、BS102對灰葡萄孢菌平板拮抗活性測定
[0048](I)試驗方法[0049]采用對峙培養(yǎng)法，將保存于4°C中的灰葡萄孢菌GZ22 (模式菌)接種到PDA平板上活化，待真菌長滿平板后用滅菌的打孔器從菌落外邊緣均勻的打成直徑為6_的圓形菌塊。將菌絲塊接種在WA平板(WA培養(yǎng)基/L:蛋白胨5g，葡萄糖10g，肉汁浸膏3g，氯化鈉5g，瓊脂20g，pH=7.0)的中心，在其四周距中心約25mm處分別接種BS102，試驗以枯草芽孢桿菌模式菌株PY79、清水和0.3μ g/ml環(huán)酰菌胺為對照組。25°C培養(yǎng)，待菌絲接近長滿平板時測量抑菌圈的大小(從細菌菌落中心算起)。
[0050]根據(jù)抑菌圈的大小對BS102的拮抗灰葡萄孢菌活性進行評估:0mm無抑制作用；< 2mm有輕微的抑制作用；2-5mm中等抑制作用；> 5mm較強的抑制作用。
[0051]抑制率根據(jù)以下公式進行計算:
[0052]抑制率=100 (R「R2) /R1, R1為對照病原菌在清水方向上的菌落半徑；R2為病原菌在細菌方向的菌落半徑。
[0053](2)結果分析
[0054]如圖2所示，平板拮抗試驗表明:生防菌BS102對灰葡萄孢菌菌絲生長具有較強的抑制效果，抑制圈半徑為15.0mm,菌絲抑制率為71.4%，而陰性對照PY79、清水和環(huán)酰菌胺處理組無拮抗效果。
[0055]2、生防菌BS102無菌上清抑制灰葡萄孢菌菌絲活性測定
[0056](I)試驗方法
[0057]取實施例2的生防菌BS102菌株發(fā)酵液，10，000r/min,離心IOmin后取上清。上清經細菌濾器(0.22 μ m)過濾后待用。
[0058]向50°C WA培養(yǎng)基中加入灰葡萄孢菌GZ22的孢子，至孢子終濃度為IO5個/ml。將含灰葡萄孢菌GZ22孢子的WA培養(yǎng)基倒入9cm直徑的平板中，每平板倒入20mL。待冷卻凝固后，用7mm直徑的打孔器在平板的對稱位置打3個孔，每孔分別加入25 μ L制備的無菌上清，以培養(yǎng)液和環(huán)酰菌胺為對照組。25°C靜止培養(yǎng)后觀察拮抗圈大小(從孔中心算起)。
[0059](2)結果分析
[0060]生防菌BS102無菌上清能有有效抑制菌絲生長，抑制圈半徑為10.4mm，3倍濃縮無菌上清的抑菌圈半徑為12.5mm，見圖3。
[0061]3、生防菌BS102無菌上清抑制灰葡萄孢菌孢子萌發(fā)活性測定
[0062]( I)試驗方法
[0063]取實施例2的生防菌BS102菌株發(fā)酵液，10，000r/min,離心IOmin后取上清。上清經細菌濾器(0.22 μ m)過濾后待用。
[0064]在上述無菌上清中加入果糖，使果糖終濃度至10mM，加入灰葡萄孢菌GZ22的孢子。對照組為含IOmM果糖的培養(yǎng)液。取置于果糖溶液中的孢子懸浮液10 μ I置于載玻片上，每處理5次重復。玻片置于保濕盒中，25°C靜止培養(yǎng)，每個I小時觀察各處理組孢子萌發(fā)情況，計算萌發(fā)率。
[0065](2)結果分析
[0066]生防菌BS102無菌上清能強烈抑制灰葡萄孢菌孢子的萌發(fā)，處理后的孢子不能形成芽管(圖4)。誘導萌發(fā)后，8、16、24小時分別統(tǒng)計各處理組的萌發(fā)率，結果顯示當陰性對照組萌發(fā)率為100%時，BS102處理組孢子仍無萌發(fā)。統(tǒng)計結果見表1。
[0067]表1各處理組灰葡萄孢菌孢子萌發(fā)率
【權利要求】
1.一種生防菌株BS102，其特征在于，命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BS102，保藏編號為 CGMCC N0.7728。
2.如權利要求1所述的生防菌株BS102在防治植物灰霉病中的應用。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于，所述的植物為梨。
4.如權利要求3所述的應用，其特征在于，所述梨的品種為皇冠。
5.如權利要求2~4任一項所述的應用，其特征在于，所述的應用包括: (1)制備含所述生防菌株BS102的生防菌劑； (2)將所述的生防菌劑噴施在所述的植物上。
6.如權利要求5所述的應用，其特征在于，所述的生防菌劑中，所述生防菌株BS102的濃度為 IXlO8 ~ 1010CFU/mL。
7.如權利要求6所述的應用，其特征在于，所述生防菌劑可通過如下方法進行制備: (1)將所述生防菌株BS102于培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD_為0.5~0.8，獲得種子液； (2)將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)液中擴大培養(yǎng)，調節(jié)發(fā)酵液中生防菌株BS102的濃度至I X IO8~101QCFU/mL，獲得所述生防菌劑。
8.如權利要求7所述的應用，其特征在于，所述種子液的接種量為I~2%。
9.如權利要求7所述的應用，其特征在于，以每升計，所述發(fā)酵培養(yǎng)液的配方為:葡萄糖，18~22g ;L-谷氨酸，2.4~2.6g ；L-天門冬酰胺，2.4~2.6g ；KH2PO4,0.8~1.2g ；MgS04.7Η20，0.4 ~0.6g ；KC1,0.4 ~0.6g ;酵母粉，0.8 ~1.2g ；L-苯丙氨酸，2 ~3 X l(T3g ；MnSO4.H2O, 5 ~6 X l(T3g ；CuSO4.5H20,0.16 ~0.18 X l(T3g ；FeS04.7H20,0.15 ~0.17 X 10_3go
【文檔編號】A01N63/02GK103571777SQ201310493822
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年10月18日 優(yōu)先權日:2013年10月18日
【發(fā)明者】陳云, 尹燕妮, 馬忠華 申請人:浙江大學