一種小麥cbl-cipk類抗逆調節(jié)因子及其編碼基因與應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種小麥CBL-CIPK類抗逆調節(jié)因子及其編碼基因與應用。本發(fā)明根據(jù)小麥鹽、旱脅迫的表達譜芯片信息，選擇在根和葉中表達明顯受鹽和旱誘導的蛋白激酶基因，并克隆了其含全長編碼區(qū)的cDNA序列，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。分析表明，該基因編碼CBL-CIPK類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，定名為TaCIPK33。通過轉基因功能分析表明，該基因具有提高植物耐鹽性和抗旱性的功能。這為深入理解小麥響應干旱、鹽脅迫的分子機理提供了基礎，同時該基因可應用于小麥等作物抗逆新種質的遺傳改良。
【專利說明】—種小麥CBL-CIPK類抗逆調節(jié)因子及其編碼基因與應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種小麥CBL-CIPK類抗逆調節(jié)因子及其編碼基因與應用，屬于分子生物學技術和基因工程【技術領域】。
【背景技術】
[0002]小麥是大約35%世界人口的主要食糧。干旱、鹽潰化等逆境是限制小麥產(chǎn)量與品質的重要環(huán)境因素，且易導致感染病蟲害，造成較大的經(jīng)濟損失。但是小麥無法逃避逆境環(huán)境，因此，克隆抗旱、耐鹽基因，研究其抗旱、耐鹽的分子機制，培育抗旱耐鹽新品種具有重大的理論與實踐意義。
[0003]絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶參與植物對不同逆境的應答反應，在提高植物抗逆性方面可發(fā)揮作用。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶具有“中央處理器(CPU)”的功能，接收從受體傳遞過來的諸如植物激素或其他外界因素等輸入信息，轉化成適當?shù)妮敵鲂畔ⅲ绱x、基因表達、細胞生長和分裂等方面的變化。
[0004]根據(jù)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化功能域的相似性，將其分為:鈣依賴蛋白激酶(CDPK)亞家族、SNFl相關蛋白激酶(SnRK)亞家族、類受體激酶(RLKs)亞家族、MAPK/MAPKK/MAPKKK亞家族、細胞周期蛋白依賴激酶(⑶K)亞家族、GSK3/SHAGGY亞家族等。各種逆境脅迫作用于植物細胞，首先引發(fā)細胞內Ca2+濃度的改變。鈣信號通過細胞內各種鈣離子感受器感知和傳遞鈣信號，植物中有兩類Ca2+依賴型感受器，一類為鈣調素(CaM)，另一類為植物特有的鈣調磷酸酶B類似蛋白(CBL)。CBL感受器與蛋白激酶CIPK (CBL-1nteractingProtein Kinases)相互作用形成Ca2+-CBL-CIPK復合體,CBL-CIPK復合體被激活，處于激活狀態(tài)的CBL-CIPK復合體磷酸化修飾下游目的靶蛋白，解碼各種動態(tài)變化的鈣信號，調控相關的生理過程。CIPK被認為屬`于植物SNFl相關蛋白激酶家族三大亞族之一 SnRK3亞族。
[0005]目前發(fā)現(xiàn)，擬南芥中存在26個CIPKs家族成員，水稻CIPKs家族成員有30個。CBL-CIPK信號途徑廣泛參與植物高鹽脅迫下的植物SOS信號轉導。植物在鹽脅迫下，細胞內Ca2+濃度增加，細胞膜上的Ca2+感受器S0S3/CBL4結合Ca2+并作用于激酶S0S2/CIPK24，S0S3-S0S2復合體被激活并磷酸化細胞膜Na+/H+逆轉運載體S0S1，提高了 Na+/H+逆向轉運能力，將細胞內過量的Na+排出以維持細胞內Na+平衡。在植物生長發(fā)育過程中鉀(K+)起著重要的作用。植物對K+的吸收和轉運主要是通過K+轉運體。CBL-CIPK信號轉導系統(tǒng)在調控植物低鉀脅迫響應中起重要作用。在擬南芥中，CIPK23與CBLl或CBL9相互作用，磷酸化下游的K+通道AKTl，激活K+轉運。CBLl與CBL9還可以與CIPK6、CIPK16相互作用，傳遞低鉀信號、調控AKT1。CBL-CIPK還參與依賴ABA和非依賴ABA的信號轉導。CBLl功能缺失突變體cbll對干旱、冷害和鹽脅迫等多種非生物脅迫的敏感性并不依賴ABA，與CBLl高度同源的CBL9功能缺失突變體cbl9對非生物脅迫的敏感性則對ABA高度依賴。此外，除介導植物對外界環(huán)境的響應，CBL-CIPK系統(tǒng)還參與植物發(fā)育相關的過程以及調控植物其他的生理過程。
【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種小麥CBL-CIPK類抗逆調節(jié)因子及其編碼基因與應用。
[0007]發(fā)明概述
[0008]本發(fā)明根據(jù)前期小麥鹽、旱脅迫獲得的表達譜芯片信息，選擇在根和葉中表達明顯受鹽和旱誘導的蛋白激酶基因(探針)，并克隆了其含全長編碼區(qū)的cDNA序列，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。分析表明，該基因編碼CBL-CIPK類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，定名為TaCIPK33。通過轉基因功能分析表明，該基因具有提高植物耐鹽性和抗旱性的功能。這為深入理解小麥響應干旱、鹽脅迫的分子機理提供了基礎，同時該基因可應用于小麥等作物抗逆新種質的遺傳改良。
[0009]發(fā)明詳述
[0010]一種小麥CBL-CIPK類抗逆調節(jié)因子的編碼基因TaCIPK33，核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示。小麥CBL-CIPK類抗逆調節(jié)因子的編碼基因TaCIPK33序列全長1463個堿基，編碼區(qū)有1332個堿基。
[0011]上述小麥CBL-CIPK類抗逆調節(jié)因子，氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。所述的小麥CBL-CIPK類抗逆調節(jié)因子由443個氨基酸殘基組成。
[0012]一種插入上述SEQ ID N0.1所示核苷酸序列的重組載體。
[0013]一種轉基因細胞系，含有上述重組載體。
[0014]一種轉基因植株，含`有上述重組載體。
[0015]上述小麥CBL-CIPK類抗逆調節(jié)因子的編碼基因TaCIPK33、重組載體、轉基因細胞系或轉基因植株在培育耐鹽、抗旱植物中的應用。
[0016]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述的植物為小麥或煙草。
[0017]有益效果
[0018]本發(fā)明首次克隆到了小麥TaCIPK33基因，該基因編碼CBL-CIPK類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，并通過轉基因功能分析證明了所述基因具有提高植物耐鹽性和抗旱性的功能。本發(fā)明通過根瘤農桿菌介導的途徑將該基因轉入煙草中過量表達，與野生型煙草植株相比，含有本發(fā)明的TaCIPK33基因的轉基因煙草后代植株具有更為明顯的耐鹽、抗旱能力。本發(fā)明的基因可為培育小麥等作物抗逆新品種提供理論依據(jù)和基因資源。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1、為TaCIPK33基因全長cDNA序列的PCR擴增電泳結果照片；
[0020]其中:M、DNA分子量標準 Marker (Trans2k plus), 1、陰性對照，2、PCR 產(chǎn)物；
[0021]圖2、NaCl、PEG脅迫處理后TaCIPK33基因在小麥山融3號幼苗根和葉中的RT-PCR分析的電泳結果照片；
[0022]其中:Actin為內參；Leaf為葉；Root為根；
[0023]A、根中TaCIPK33基因在200mM NaCl脅迫處理下的表達；
[0024]B、根中TaCIPK33基因在體積濃度為18%PEG6000脅迫處理下的表達；
[0025]C、葉中TaCIPK33基因在200mM NaCl脅迫處理下的表達；
[0026]D、葉中TaCIPK33在體積濃度為18%PEG6000脅迫處理下的表達；[0027]圖3、構建的植物表達載體pROK I1-TaCIPK33的酶切驗證電泳結果照片；
[0028]其中:M、DNA分子量標準 Marker (Trans2k plus)，1、pROKII 質粒，2、pROK I1-TaCIPK33 的 BamH I 和 KpnI 雙酶切結果；
[0029]圖4、TaCIPK33轉基因煙草的再生過程照片；
[0030]其中:A、卡那霉素抗性芽在誘導培養(yǎng)基中的誘導與篩選，B、卡那霉素抗性芽在篩選培養(yǎng)基中生長；C、轉基因煙草植株在溫室正常生長；
[0031]圖5、轉基因煙草的PCR鑒定電泳結果照片；
[0032]其中:M、DNA分子量標準Marker (Trans2k plus)，1-11、轉基因植株，12、陽性對照，13、水對照，14、野生型非轉基因煙草植株；
[0033]圖6、轉基因煙草株系的表型鑒定照片；
[0034]其中:A、在含有IOOmM NaCl的MS培養(yǎng)基上豎直培養(yǎng)兩周幼苗根長生長情況；
[0035]B、在含有IOOmM甘露醇的培養(yǎng)基上豎直培養(yǎng)兩周幼苗根長生長情況；
[0036]A、B圖中，左上為對照野生株系WT，右上為轉基因株系S/T-8，左下為轉基因株系S/T-9，右下為轉基因株系S/T-10 ；
[0037]C、在含有IOOmM NaCl的MS培養(yǎng)基上種子萌發(fā)情況；
[0038]D、在含有IOOmM甘露醇的MS培養(yǎng)基上種子萌發(fā)情況；
[0039]C、D圖中，上方為對照野生株系WT，下方為轉基因株系S/T-10。
【具體實施方式】
[0040]下面結合說明書附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明的技術方案做進一步說明，但本發(fā)明所保護范圍不限于此。
[0041]生物材料來源
[0042]大腸桿菌DH5 α，北京全式金生物技術有限公司有售；
[0043]農桿菌LBA4404, Invitrogen 公司有售；
[0044]植物表達載體pROK II, Biovector中國質粒載體菌株基因庫有售；
[0045]小麥山融3號，魯農審字[2004] 030號，普通市售產(chǎn)品；
[0046]以下實施例中如無特別說明，使用的方法均為本領域常規(guī)方法，培養(yǎng)基均為本領域常規(guī)培養(yǎng)基。
[0047]實施例lTaCIPK33基因cDNA序列的克隆
[0048]TaCIPK33基因全長cDNA序列的克隆和序列測定
[0049]1.引物序列
[0050]根據(jù)小麥的SSH和表達譜芯片數(shù)據(jù)結果設計基因特異性引物，以小麥幼苗葉片cDNA第一條鏈為擴增目的基因的模版，擴增基因的全長cDNA，引物序列為:
[0051]TaCIPK-S:5/ CGACCTACCTCCTACCCTC3' ,SEQ ID N0.3
[0052]TaCIPK - A:5/ GCAAGATAGTTCCATTCCG3;。SEQ ID N0.4
[0053]2.PCR 反應體系(20 μ I)
[0054]依次加入10XPCR 緩沖液(含 Mg2+) 2.0 μ L, 2.5mM dNTPl.6 μ L，反轉錄 cDNA 第一鏈產(chǎn)物 I μ L，正向引物(TaCIPK-S) 0.5 μ L，反向引物(TaCIPK-A) 0.5 μ L，5U/ μ L Taq DNA聚合酶0.2 μ L，加水至20 μ L。[0055] 3.PCR 反應程序為:94°C預變性 5min ;94°C變性 30Sec，62°C復性 30Sec，72°C延伸lmin, 30cycles ;72°C延伸 10min,4°C保存。
[0056]4.lwt%瓊脂糖凝膠電泳
[0057]PCR擴增產(chǎn)物用lwt%瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)在1463bp處有一條目的帶，如圖1所示。
[0058]5.擴增目的片段的回收、克隆至PMD18-T載體
[0059]對擴增片段采用lwt%瓊脂糖凝膠電泳后,使用TIANgel Midi Purification kit試劑盒回收目的基因片段即PCR產(chǎn)物，具體操作步驟按照試劑盒說明書進行。PCR產(chǎn)物與TaKaRa公司pMD18_T載體連接，獲得連接產(chǎn)物，連接體系為:
[0060]IuL pMD18_T Vector, 4uL PCR 產(chǎn)物，5uL Ligation Mix ；
[0061]條件為16°C連接30分鐘。
[0062]6.回收片段的克隆與測序
[0063]將全量的連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞中，挑取白色菌斑于37°C搖菌，提取已插入基因片段的質粒。
[0064](I)雙酶切檢測驗證:用TaKaRa公司的Hind III和EcoR I內切酶酶切，操作如下:酶切體系20yL，包括2μ L緩沖液，14μ L已插入基因片段的質粒，IyL HindIII內切酶，IyL EcoRI內切酶，補水2 μ L。在37°C水浴中4個小時，電泳檢測酶切結果。
[0065](2)將連接載體的陽性克隆的菌液送測序公司測序，確保正確無誤，測序結果如SEQ ID N0.1所示，由1463個堿基組成，命名為TaCIPK33。
[0066]實施例2基因的表達分析
[0067]NaCl、PEG脅迫處理條件下TaCIPK33基因的表達分析
[0068]1.材料處理
[0069]選取飽滿的小麥山融3號種子，進行正常萌發(fā)。
[0070]挑選生長至兩葉一心、情況大體一致、健壯的山融3號小麥進行如下脅迫處理:200mM NaCl泡根處理48h后恢復48h ;體積百分濃度為18%PEG6000溶液浸根處理48h后恢復48h，對照為正常條件下健康植株。分別在Oh、0.511、111、311、611、1211、2411、4811、恢復2411和恢復48h取樣，-70°C保存。取山融3號小麥植株的脅迫處理不同時間點的根和葉，Trizol法提取小麥總RNA。
[0071]2.Trizol法提取小麥總RNA
[0072]以小麥山融3號10天苗齡的幼苗葉片為材料
[0073](I)將組織材料放入液氮預冷的研缽中，在液氮中充分研磨成粉末，將粉末裝入1.5mL離心管中，每IOOmg材料迅速加入Iml的Invitrogen公司的TRIzol提取液,劇烈震蕩15秒，混勻樣品，使樣品充分裂解，室溫放置5分鐘；
[0074](2)加入 100uL2M 醋酸鈉(PH4.0)，溫育 2-3 分鐘；
[0075](3)加入0.2ml氯仿(chloroform),劇烈振蕩15秒,溫育2-3分鐘；
[0076](4) 4°C,12000rpm離心15分鐘，取上清液移至新的1.5mL離心管中；
[0077](5)加入800 μ L氯仿，用手劇烈搖晃15秒鐘，溫育2 — 3分鐘；
[0078](6) 4°C, 12000rpm離心15分鐘，取上清液移至新的1.5mL離心管中；
[0079](7)加入500 μ L異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10分鐘；[0080](8) 4°C，12000rpm離心10分鐘，吸除上清液；
[0081](9)加入Im L預冷的體積百分比為75%的乙醇溶液，蝸旋震蕩。4°C，7500rpm離心5分鐘，棄上清，收集沉淀；
[0082](10)重復用體積百分比為75%的乙醇溶液洗滌RNA沉淀一次；
[0083](11)去上清，RNA沉淀于無菌操作臺上晾干約10-15分鐘，RNA略顯透明，加入適量的DEPC水(一般為20 μ L)溶解沉淀(或體積百分比為75%的乙醇溶液中保存(置-80°C冰箱中保存?zhèn)溆?；
[0084](12)取I μ L RNA樣品，lwt%瓊脂糖凝膠電泳檢測，于紫外凝膠成像系統(tǒng)中成像，鑒定RNA是否降解及粗略的濃度。
[0085]3.第一鏈cDNA的合成
[0086]米用Fermentas 公司的 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒進行，反應步驟如下:
[0087]首先，將mRNA反轉錄成第一鏈cDNA,所用反轉錄酶為Fermentas公司的RevertAidFirst Strand cDNA Synthesis Kit,反應體系為 20 μ L。依次加入 I μ L oligo (dT) 18primer(lOOuM), I μ g Total RNA和DEPC水至10 μ L，65°C水浴變性5min,冰上急冷，稍離心；然后依次加入 I μ L RNase Inhabitor (20U/uL), 4 μ L5x Reaction Buffer, 2 μ L dNTP Mixture(IOmM)IyL M-MuLV ReverseTranscriptase (200U/uL), 4 μ L RNase Free ddH20,混勻；
[0088]然后在PCR儀上按照“42°C，60min ；70°C，5min ；4°C，保存”的程序運行；反轉錄獲得小麥cDNA的第一條鏈，于_20°C保存。
[0089]4.PCR反應體系
[0090]用山融3號小麥cDNA為模板，以TaActin-S和TaActin-A作為擴增引物，獲得558bp左右的actin內參產(chǎn)物片段。根據(jù)內參Actin的擴增情況確定PCR的循環(huán)數(shù)，調整cDNA的模版量。
[0091](I)內參Actin引物序列:
[0092]TaActin-S5/ AGCCATACCGTGCCAATC3'
[0093]TaActin-A5/ AGAGCCTCCAATCCAGAC3'
[0094](2)反應體系如下:TaqMixl0uL,模板 x uL, TaActin-S0.5, TaActin-A0.5,補水至總體系20 μ Lo
[0095](3) PCR 反應程序:94 °C 5min ；94 °C 30Sec，58 °C 30Sec，72 °C lmin, 30cycles ；72°C IOmin ;4°C保存。
[0096]lwt%瓊脂糖凝膠電泳檢測表達分析,結果如圖2所示。
[0097]實施例3CaMV35S啟動子驅動的過量表達植物表達載體的構建
[0098]植物表達載體pROK II是含有CaMV35S啟動子和NPTII基因的雙元載體，在其多克隆位點上含有限制性內切酶BamH I和Kpn I位點。根據(jù)基因TaCIPK33的cDNA編碼區(qū)序列，設計包含完整ORF的基因特異性引物，引物序列=TaCIPK-Sl加入BamH I (GGATCC)位點，TaCIPK-Al 加入 Kpn I (GGTACC)位點，
[0099]TaCIPK-S15/ CGCGGATCCCGACCTACCTCCTACCCTC3' , SEQ ID N0.5
[0100]TaCIPK-A15/ CGGGGTACCGCAAGATAGTTCCATTCCG3' , SEQ ID N0.6
[0101]用該對引物擴增基因的cDNA序列，擴增出1463bp的基因片段，并克隆至TaKaRa公司的PMD18-T載體上。然后用限制性內切酶BamH I和Kpn I分別雙酶切空載體pROK II和攜帶目的基因片段的PMD18-T載體，分別回收載體大片段和TaCIPK33基因片段，16°C過夜連接，得到重組質粒植物表達載體pROK I1-TaCIPK33。
[0102](I)空載體pROK II和攜帶目的基因片段的T-載體BamH I內切酶和Kpn I內切酶雙酶切
[0103]酶切反應體系(20 μ L):
[0104]BamH I 內切酶IyL
[0105]Kpn I 內切酶I μ L
[0106]空載體pROKII
[0107](或目的基因片段)5yL
[0108]IOXBuffer2 μ L
[0109]補ddH20 至20 μ L，
[0110]在37 °C恒溫水浴鍋溫育2小時；
[0111](2)酶切產(chǎn)物電泳與回收
[0112]雙酶切反應完成后，將酶切產(chǎn)物進行0.8wt%瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠試劑盒回收載體大片段和TaCIPK基`因片段；
[0113](3)連接
[0114]將經(jīng)過雙酶切的載體大片段和目的基因片段按照體積比1:4的比例進行16°C過夜連接，反應體系如下(25μ L):TaCIPK基因片段10μ L，pR0K II載體大片段4 μ L，IOXT4DNALigase buffer2.5 μ L, T4DNA Ligasel μ L，補水至 25 μ L ; 16°C連接過夜；
[0115](4)轉化
[0116]將連接產(chǎn)物通過熱激法轉化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，轉化菌落在含Kan50 μ g/ml的LB固體平板上37°C培養(yǎng)16小時；
[0117](5)陽性重組子的酶切鑒定
[0118]挑取白色菌斑于37°C搖菌，提取質粒，BamH I內切酶和Kpn內切酶雙酶切檢測驗證，酶切反應體系同實施例3中的(I)步驟，酶切產(chǎn)物經(jīng)0.8wt%瓊脂糖凝膠電泳，檢測到合適大小的目的基因條帶和載體片段條帶，說明TaCIPK基因已經(jīng)成功連接到pROK II載體，制得重組表達載體質粒DNA。結果如圖3所示。將連接好的重組載體進行測序，確保正確無誤。
[0119]實施例4農桿菌感受態(tài)的制備與轉化
[0120]1.農桿菌感受態(tài)細胞的制備
[0121](I)從YEP平板(含50 μ g/ml利福平)上挑取農桿菌LBA4404單菌落，接種于含50 μ g/ml利福平的YEP液體培養(yǎng)基中，200rpm，28°C下培養(yǎng)過夜；
[0122](2)取2ml過夜培養(yǎng)液接種于50ml含相同抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)至OD600 M 0.5；
[0123](3)菌液冰浴 30min, 4°C, 5000rpm 離心 IOmin,收集菌體；
[0124](4)菌體重懸于冰浴的 IOml0.15mol/L 的 NaCl 中，4°C 5000rpm 離心 lOmin，收集菌體；
[0125](5)菌液重新懸浮于Iml20mmol/L冰預冷的CaCl2溶液中，將菌液以每管200 μ L分裝在1.5ml Eppendorf管中，液氮速凍lmin, -70°C保存?zhèn)溆谩?br> [0126]2.凍融法轉化農桿菌LBA4404
[0127](I)冰上融化農桿菌感受態(tài)細胞，加入I μ g重組表達載體質粒DNA，混勻后冰浴30min ；
[0128](2)液氮速凍lmin,迅速移至37°C保溫3min ；
[0129](3)加入無抗生素的液體YEP800 μ L，28°C震蕩培養(yǎng)4hr ；
[0130](4) 7000rpm離心30s，收集菌體，涂于含有50 μ g/ml利福平、50 μ g/ml Kan的YEP平板上，28°C倒置暗培養(yǎng)2~3天。
[0131]3.陽性菌落PCR鑒定
[0132]菌落PCR所用引物同實施例1，方法及程序同實施例1中的步驟2。
[0133]實施例5轉基因功能驗證煙草轉化、篩選及表型分析
[0134]1.葉盤轉化法轉化煙草
[0135](I)煙草種子于體積百分比為75%的乙醇溶液消毒lmin，無菌水沖洗3~5次；將次氯酸鈉和水以1:4的質量比稀釋，對種子消毒lOmin，無菌水沖洗5次，均勻鋪灑于1/2MS?；九囵B(yǎng)基上，使其發(fā)芽。
[0136](2)待種子發(fā)芽(約兩周)后，將其轉移到單獨的瓶中(含1/2MS)，生長4~5周，待植株長出足夠的葉子以供轉化。
[0137](3)挑取農桿菌(攜帶重組表達載體質粒的農桿菌單菌落)接種于含有50 μ g/ml卡那霉素，50 μ g/ml利福平的YEP液體培養(yǎng)基中，280C，200rpm振蕩培養(yǎng)約24h，至對數(shù)生長期。
[0138](4)將菌液6000rpm離心6min，收集菌體，MS0液體培養(yǎng)基重懸。
[0139](5)取煙草葉片，剪成小塊(0.5X0.5cm)，將剪好的煙草葉片放于重懸的菌液中
1.5min,不斷振蕩，取出后用無菌濾紙吸干水分，將其整齊緊密地排列在MS分化培養(yǎng)基上，28°C，暗培養(yǎng)2d。
[0140](6)暗培養(yǎng)兩天后，將葉片松散地排列在MS選擇培養(yǎng)基上，280C，光照時間16h/d，
每隔兩周更換一次培養(yǎng)基。
[0141](7)待其長出叢生芽時，將其切下放入伸長培養(yǎng)基上，使其伸長。
[0142](8)叢生芽長至3~5cm時，轉移到生根培養(yǎng)基，促其生根。
[0143](9)待根系發(fā)育好后，將苗洗根移入盛有無菌土的花盆中，蓋地膜3d。
[0144](10)光下培養(yǎng)，長至一定程度移到大盆中，溫室常規(guī)管理，收獲Ttl代種子。結果如圖4所示。
[0145]2.轉基因煙草陽性植株的篩選
[0146]Ttl代種子用7.5wt%次氯酸鈉溶液(包括7.5wt%次氯酸鈉和0.01wt%Triton_X100)消毒后，播種在MS選擇培養(yǎng)基(50mg/L卡那霉素)上，培養(yǎng)室中培養(yǎng)10天，挑選卡那霉素抗性植株(長出真葉1-2對，根伸長至培養(yǎng)基中)并移栽到營養(yǎng)缽中，培養(yǎng)直至種子成熟，采用同樣的方法篩選T1代種子得到T2代植株，并在T1代植株中挑選抗性比為3:1的單拷貝插入株系，在T2代選擇抗性部分的純合株系，即:純合T2代株系，將純合T2代株系進行轉基因煙草的分子檢測和表型鑒定。
[0147]單拷貝插入的純合株系的獲得為本領域常規(guī)步驟:將收獲的T1代種子播種在添加有卡那霉素的MS培養(yǎng)基上，非轉基因種子萌發(fā)后會白化、死亡，轉基因種子萌發(fā)后為正常的綠色苗，通過卡方(X2)測驗，計算綠色苗與白化死亡苗的比例，如果外源基因是單拷貝插入到受體煙草中，那么綠色苗與白化死亡苗的比例就是3:1，即單拷貝插入的轉基因株系，否則就不是符合要求的轉基因后代(即符合孟德爾遺傳規(guī)律)。收獲單拷貝插入的轉基因株系的種子，繼續(xù)在添加有卡那霉素的MS培養(yǎng)基上篩選，完全是綠色苗的為純合體，即純合的T2代株系。轉基因T3代株系為單拷貝純合株系自交傳代獲得。
[0148]3.轉基因煙草的PCR鑒定
[0149](I) CTAB法提取煙草葉片基因組DNA
[0150]①取IOOmg左右的新鮮葉片，放入1.5ml離心管中，液氮速凍，研磨，加入600 μ L預熱至65°C的2XCTAB提取緩沖液，上下顛倒混勻，置于65°C水浴中靜置30min ;其間不斷輕搖，使CTAB提取液與植物材料充分混勻；
[0151 ] ②混合物冷至室溫后加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，混勻，室溫靜置15min，4°C，12000rpm 離心 IOmin ；
[0152]③取上清，加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻，4°C，12000rpm離心IOmin ；
[0153]④取上清，加入1/10體積的3mol/L NaAc (pH5.3)和0.7倍體積的異丙醇，混勻，室溫靜置 15min,4°C, 12000rpm 離心 15min,沉淀 DNA ；
[0154]⑤75%乙醇洗沉淀兩次。棄上清，超凈臺干燥數(shù)分鐘
[0155]⑥沉淀溶于適量TE緩沖液中，于_20°C保存。
[0156](2)轉基因煙草的PCR擴增
`[0157]以上述提取的煙草基因組DNA為模板，用基因特異性引物(同實施例1)進行PCR擴增。
[0158]PCR反應體系同實施例1中的步驟2，PCR反應程序為:94°C預變性5min ;94°C變性 30Sec，62°C復性 30Sec，72°C延伸 lmin, 30cycles ;72°C延伸 10min，4°C保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測到在轉基因煙草植株中擴增出1463bp左右的目的條帶，在轉空載體的植株中和滅菌水為陰性對照未見擴增條帶，結果如圖5所示。
[0159]4.轉基因煙草的表型鑒定
[0160](I)煙草的種植
[0161]T3代單拷貝純合煙草株系的種子用7.5wt%次氯酸鈉溶液(包括7.5wt%次氯酸鈉和0.01wt%Triton-X100)消毒10分鐘，然后用無菌水漂洗5~6次，點播于MS平板上，然后移植到營養(yǎng)缽中(營養(yǎng)土與蛭石按等比例混合)，25°C培養(yǎng)。
[0162](2) NaCl和干旱脅迫處理
[0163]根長統(tǒng)計
[0164]將萌發(fā)2天的煙草幼苗(對照WT及轉基因株系S/T-8、S/T-9、S/T_10)小心移至含有IOOmM NaClUOOmM甘露醇的MS培養(yǎng)皿中，豎直培養(yǎng)兩周觀察統(tǒng)計根長長度，結果表明轉TaCIPK33基因的煙草植株的根長明顯比野生型對照植株的根長長(如圖6A、6B所示)。
[0165]萌發(fā)率統(tǒng)計
[0166]將轉基因后代煙草種子(S/T-10)和野生型煙草種子(WT)用次氯酸鈉消毒10分鐘后，無菌水漂洗5次，點播于分別含有IOOmM NaClUOOmM甘露醇的MS培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)兩周后，分別統(tǒng)計種子的萌發(fā)率，結果發(fā)現(xiàn)轉TaCIPK33基因煙草后代的種子萌發(fā)率高于野生型種子的萌發(fā)率(如圖6C、6D所不)。
[0167]結果分析 [0168]由上述實驗結果可以得出，本申請所述基因TaCIPK33編碼CBL-CIPK類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與植物對干旱、高鹽逆境的響應。該基因TaCIPK33過量表達后，轉基因植株能夠產(chǎn)生耐鹽抗旱的特性。
【權利要求】
1.一種小麥CBL-CIPK類抗逆調節(jié)因子的編碼基因TaCIPK33，核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示。
2.權利要求1所述小麥CBL-CIPK類抗逆調節(jié)因子，氨基酸序列如SEQID N0.2所示。
3.一種插入SEQ ID N0.1所示核苷酸序列的重組載體。
4.一種轉基因細胞系，含有權利要求3所述的重組載體。
5.一種轉基因植株，含有權利要求3所述的重組載體。
6.權利要求1所述小麥CBL-CIPK類抗逆調節(jié)因子的編碼基因TaCIPK33、權利要求3所述重組載體、權利要求4所述轉基因細胞系或權利要求5所述轉基因植株在培育耐鹽、抗旱植物中的應用。
7.如權利要求6所述的應`用，其特征在于，所述的植物為小麥或煙草。
【文檔編號】A01H5/00GK103555740SQ201310511236
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月25日 優(yōu)先權日:2013年10月25日
【發(fā)明者】單雷, 徐平麗, 彭振英, 夏光敏, 唐桂英, 柳展基 申請人:山東省農業(yè)科學院生物技術研究中心