一種榆黃菇新品種選育及配套高產(chǎn)栽培技術(shù)研究方法
【專利摘要】一種榆黃菇新品種選育及配套高產(chǎn)栽培技術(shù)研究方法，屬于食用菌栽培學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及怎樣在人工條件下培育榆黃菇新品種的方法。主要通過Co60-γ射線輻照誘變，酯酶同工酶電泳試驗等方法培育榆黃菇新品種。
【專利說明】一種榆黃菇新品種選育及配套高產(chǎn)栽培技術(shù)研究方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于食用菌栽培學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及怎樣在人工條件下培育榆黃菇新品種的 方法。
[0002]

【背景技術(shù)】
[0003] 榆黃燕Sing.)色澤艷麗，味道鮮美，因其菌 蓋呈黃色，層疊排列，形似皇冠，故而得名金頂側(cè)耳，又稱"金頂蘑"、"榆黃蘑"、"玉皇 蘑"或"黃蘑"，營養(yǎng)豐富，具有滋補強壯功能，是著名的珍稀食藥用真菌，隸屬于擔(dān)子 菌門（Basidiomycota)、傘菌目（Agaricales)、口蘑科（Tricholomataceae)、側(cè)耳屬 。分布于我國東北、河北、四川和云南等地，日本、歐洲、北美洲也有分布，野生 子實體多發(fā)生于溫暖多雨的夏秋季節(jié)，腐生于榆、櫟、樺、楊、柳、核桃等闊葉樹的枯立木干 基部、伐樁和倒木上。
[0004] 榆黃菇味道鮮美，香味可口，營養(yǎng)豐富，含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸和維生素等多 種營養(yǎng)成分。據(jù)測定，榆黃菇干燥子實體中粗蛋白含量為41. 5%，Ghosh等人對榆黃菇的蛋 白質(zhì)量進(jìn)行了分析，證明其具有很高的營養(yǎng)價值，并且在菌蕾階段蛋白含量最高；粗脂肪 含量為3. 8%，而且脂肪酸多為不飽和脂肪酸，不僅能降低血脂，多食也不會引起發(fā)胖或引發(fā) 心血管疾病；氨基酸總含量為28. 7%，包括17種氨基酸，其中有8種含量豐富的人體必需氨 基酸；維生素的含量以B族最高，同時還含有維生素 C、煙酸、泛酸等；此外，應(yīng)用等離子光 譜結(jié)合原子吸收法從榆黃菇中鑒定出12種微量元素，如K、P、Fe、Ca、Na、Mg、Se和Ge等，能 夠充分滿足人體對礦物元素的需求，其中重金屬元素含量極微，不會對人體產(chǎn)生危害。榆黃 菇以其高蛋白、低糖、低脂肪的特點，同其它食用菌一樣，已成為人們飲食中必不可少的一 部分。
[0005] 榆黃燕也具有一定的藥用價值。據(jù)我國的醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)記載，榆黃燕入藥有滋補強壯 之效，可治療虛弱、萎癥、痢疾，民間用于治療肺氣腫。驗方中記載，榆黃菇小火焙干，研成細(xì) 末，口服可治痢疾；干燥的榆黃菇子實體，用黃酒浸泡9天，9蒸9曬后，小火焙干成黃色，研 末服用，可治療肌肉萎縮。常食其干菇或鮮菇，能補充賴氨酸不足，有利于病體康復(fù)，身體健 壯，并可降低膽固醇。榆黃菇液體培養(yǎng)提取液具有顯著的抗疲勞作用及提高機體免疫力作 用下；從子實休中分離出的多糖具有抗腫瘤、增強機體免疫力的作用。張麗萍等研究表明， PC-3經(jīng)硫酸化后，顯著地提高了抗柯薩奇病毒B5活性，而經(jīng)高碘酸氧化、甲基化，部分酸水 解產(chǎn)物抗柯薩奇病毒B5活性降低。劉曉峰等對榆黃菇的藥用活性進(jìn)行了較詳細(xì)的研究，證 明其甲醇提取物能顯著降低急性高血脂小鼠血清中的血脂和膽固醇含量，具有明顯的降血 脂活性。同時榆黃菇水溶性成分一延胡索酸具有平喘活性。另外延胡索酸還具有抗腫瘤、 抗菌、抗電休克，鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)咳的作用。
[0006] 榆黃菇中的甘露醇能降低顱內(nèi)壓，減輕腦水腫，并具有利尿、止咳平喘功能；尿嘧 啶具有強心活性；煙酸能夠促進(jìn)細(xì)胞新陳代謝、降血脂、增強機體免疫力、抗脂質(zhì)過氧化以 及輔助治療突發(fā)性耳聾和防治急性腎功能衰竭；麥角留醇具有抗佝僂病的作用；微量元 素鐵、銅可防治貧血，錳參與造血，鋅、錳有抑癌抗癌的作用，硒具有維持人體心臟的正常功 能、防癌抗癌、抗衰老的效用。
[0007] 隨著食藥用菌產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，關(guān)于榆黃菇的研究不斷深入。20世紀(jì)70年代開始人工 馴化培養(yǎng)，1974年，王柏松等人在長白山區(qū)用菇木菌絲分離法獲得了其野生菌種，并對其 生物學(xué)特性進(jìn)行觀察，此后，在我國東北等地區(qū)開始了人工栽培。近年來，在全國范圍內(nèi)已 形成了一定的栽培規(guī)模。
[0008] 榆黃菇生長周期約3個月，不耐高溫，菌絲生長適溫20°C -27°C，最適溫度 23°C-27°C。溫度達(dá)到30°C時，菌絲體的生長受到抑制，生長緩慢且不健壯。32°C時菌絲很 難生長。子實體形成適溫15°C -25°C，最適溫度為17°C -23°C。溫度高于24°C后，產(chǎn)量下降。 栽培榆黃菇的原料來源廣泛，可因地制宜，玉米芯、玉米發(fā)酵液、蔗渣、稻草、酒糟、棉籽殼等 均可。一般來說，以單一原料作為培養(yǎng)料，生物學(xué)效率低，所以多采用混合料進(jìn)行栽培。培養(yǎng) 料中添加適量的麩皮或米糠，可以提高氮源營養(yǎng)，從而增加產(chǎn)量。其中Ragunathan等人用 各種不同的農(nóng)業(yè)廢料栽培榆黃菇，研究培養(yǎng)料與產(chǎn)量及生物有效率之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 以蔗渣為栽培原料時，菌絲體產(chǎn)量最高；以稻草和蔗渣（1:1)混合物為栽培原料時，生長率 和廣量達(dá)到最商；以稻草為栽培原料時，蛋白質(zhì)和氣基酸含量最商。此外，Nallathambi等 用不同方式處理側(cè)耳屬真菌的栽培基質(zhì)，觀察其對酶活性的影響及與產(chǎn)量間的關(guān)系，結(jié)果 表明，榆黃菇的栽培基質(zhì)用化學(xué)方法處理后，纖維素酶活性增強，產(chǎn)量增加，同時菌絲體發(fā) 生較早。
[0009] 據(jù)各地環(huán)境條件的不同，栽培方式多種多樣，有仿野生覆土栽培法、陽畦栽培法、 瓶栽法、菌塊栽法、露地栽培法、床式栽培和大棚畦栽培等方法。其中，仿野生覆土栽培法簡 單易行，管理方便，發(fā)菌和出菇的濕度極易達(dá)到要求，所以產(chǎn)品質(zhì)量和生物學(xué)效率最高，經(jīng) 濟效益最好；陽畦栽培法主料是棉籽殼或玉米芯，具有操作簡單，易管理，投資少，效益高的 特點，生物學(xué)效率可達(dá)100%。楊儒欽根據(jù)生產(chǎn)實踐，總結(jié)出榆黃菇的周年栽培技術(shù)，春季、冬 季人為創(chuàng)造適宜的生長環(huán)境，夏秋季節(jié)可利用自然溫度進(jìn)行，一年四季均可出菇，提高了經(jīng) 濟效益。
[0010] 榆黃菇屬于"天然、營養(yǎng)、安全、多功能"食品，既是營養(yǎng)豐富的副食品，又是保健食 品及天然藥物的重要原料來源。符合國際上近年來對食品"三低一高"的新要求。榆黃菇 能最大限度利用自然資源，不增加環(huán)境負(fù)荷，符合生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展的要求。通過對營養(yǎng)成分及 藥用成分的大量研究發(fā)現(xiàn)，榆黃菇不僅營養(yǎng)豐富，而且富含各種活性成分，使其作為食藥用 真菌具有更廣闊的發(fā)展前景。
[0011] 榆黃菇不僅營養(yǎng)豐富，還具有提高人體免疫功能、抗衰老等作用，是一種很有發(fā)展 前途的食藥用菌。目前榆黃菇的栽培已經(jīng)成功，大量栽培榆黃菇既可以調(diào)整我國農(nóng)村的產(chǎn) 業(yè)結(jié)構(gòu)，也是廣大農(nóng)村致富的首選項目之一。但一直以來，榆黃菇或者將野生菌株直接用于 生產(chǎn)，或者經(jīng)過篩選馴化后作生產(chǎn)用菌種，菌種選育研究極少。這勢必會阻礙榆黃菇的進(jìn)一 步開發(fā)利用。為促進(jìn)食用菌產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，改變目前榆黃菇以野生菌種進(jìn)行商業(yè)化生 產(chǎn)的尷尬局面，開發(fā)適于生產(chǎn)需要的高產(chǎn)優(yōu)良品種已經(jīng)成為當(dāng)務(wù)之急。有必要利用新技術(shù) 研究和選育出優(yōu)質(zhì)品種，同時對栽培的榆黃菇進(jìn)行系統(tǒng)的生物學(xué)研究，確定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一 步實現(xiàn)規(guī)范化栽培。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 一、在試驗菌株資源及收集 試驗收集的榆黃菇菌株及來源如下： ① 榆黃菇818,魯東大學(xué)食用菌工程技術(shù)研究中心自存； ② 榆黃菇05 - 1，引自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食用菌所； ③ 榆黃菇05 - 2,引自黑龍江伊春市食用菌中心。
[0013] 二、試驗菌株的篩選與純化 ①將保藏的榆黃菇菌株接入PDA斜面培養(yǎng)基上，于25°C下培養(yǎng)8 d。
[0014] ②用接種刀切取上述斜面培養(yǎng)基上菌絲最前端部分再接入PDA斜面培養(yǎng)基上，于 25°C下培養(yǎng)6 d，選取長勢良好的斜面菌種試驗備用。
[0015] 三、Co6°- γ射線輻照誘變 采用尖端菌絲Co6°y射線輻照誘變的方法，以期獲得榆黃菇優(yōu)良菌株。
[0016] 3.1材料與方法 3. 1. 1實驗材料：以榆黃燕818為試驗出發(fā)菌株，Co6°-γ射線福照處理采用山東省農(nóng) 科院原子能研究所的鈷源進(jìn)行。
[0017] 培養(yǎng)基：PDA斜面培養(yǎng)基。
[0018] 3.1.2 方法 3. 1. 2. 1菌絲培養(yǎng)將榆黃菇菌種接種到試管內(nèi)的斜面培養(yǎng)基上，放在25°C恒溫培 養(yǎng)48h后取出，選擇菌絲長勢一致的斜面菌種進(jìn)行輻照處理。
[0019] 3. 1.2.2 Co6°-Y射線輻照處理將試管培養(yǎng)菌種按照不同劑量、不同劑量率分組 進(jìn)行輻照處理。輻照劑量分別為：300Gy、600Gy、900Gy、1200Gy;每一劑量組再分成2組， 每組劑量率分別為26. lGy/h和43. 5Gy/h。對照組不經(jīng)輻照處理。
[0020] 3.2.2.3誘變株篩選①將經(jīng)過輻照處理的斜面菌種在25°C恒溫繼續(xù)培養(yǎng)10d 左右，觀察菌絲恢復(fù)生長情況，選擇菌絲長速、色澤變化或菌絲形態(tài)變化的菌株進(jìn)行拮抗 試驗，挑取經(jīng)過不同輻照處理的菌絲接種于空白平板培養(yǎng)基的一側(cè)，另一側(cè)接種對照菌 絲，置于25°C恒溫培養(yǎng)10d，觀察拮抗線產(chǎn)生情況。
[0021] ②將拮抗線產(chǎn)生明顯的菌株進(jìn)行擴大培養(yǎng)，收集菌絲進(jìn)行酯酶同工酶電泳試驗， 通過酯酶同工酶譜的差異進(jìn)一步驗證變異株。
[0022] 3. 2結(jié)果與分析 3.2. 1 Co6°y射線輻照處理結(jié)果 所進(jìn)行不同劑量輻照后的菌絲均呈現(xiàn)菌絲變色，生長暫停現(xiàn)象，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng) 又萌發(fā)出白色菌絲。整體趨勢為隨著輻照劑量的增加，菌絲重新萌發(fā)所需時間延長，初生 菌絲較弱。
[0023] 在本實驗條件下，劑量率高的處理均較劑量低相同，但劑量率低的處理恢復(fù)生長 快，初生菌絲較壯。在輻照劑量300Gy和600Gy處理的菌絲變色較淺，重新萌發(fā)時間短， 恢復(fù)生長的菌絲粗壯，呈濃密棉花狀，氣生菌絲增多。而劑量在900Gy和1200Gy處理的 菌絲變色較深，重新萌發(fā)時間明顯延長，且恢復(fù)生長的菌絲較細(xì)弱，這表明在此劑量下菌 絲受輻照損傷較大，嚴(yán)重影響了菌絲生長。因此，采用600Gy的輻照劑量對榆黃菇尖端菌 絲多批誘變。
[0024] 但隨著傳代次數(shù)的增加，菌絲的長速規(guī)律發(fā)生變化。表1顯示了轉(zhuǎn)代10代后的 菌絲長速： 表1 C〇6°Y射線輻照處理結(jié)果

【權(quán)利要求】
1. 一種采用射線輻射照誘變育種的方法，其特征在于包括 (1) 菌絲培養(yǎng)將榆黃菇菌種接種到試管內(nèi)的斜面培養(yǎng)基上，放在25°C恒溫培養(yǎng)48h 后取出，選擇菌絲長勢一致的斜面菌種進(jìn)行輻照處理； (2) Co6°-y射線輻照處理將試管培養(yǎng)菌種按照不同劑量、不同劑量率分組進(jìn)行輻照 處理，輻照劑量分別為：300Gy、600Gy、900Gy、1200Gy;每一劑量組再分成2組，每組劑量率 分別為26. lGy/h和43. 5Gy/h，對照組不經(jīng)輻照處理； (3) 誘變株篩選 ① 將經(jīng)過輻照處理的斜面菌種在25°C恒溫繼續(xù)培養(yǎng)10d左右，觀察菌絲恢復(fù)生長情 況，選擇菌絲長速、色澤變化或菌絲形態(tài)變化的菌株進(jìn)行拮抗試驗，挑取經(jīng)過不同輻照處 理的菌絲接種于空白平板培養(yǎng)基的一側(cè)，另一側(cè)接種對照菌絲，置于25°C恒溫培養(yǎng)10d， 觀察拮抗線產(chǎn)生情況； ② 將拮抗線產(chǎn)生明顯的菌株進(jìn)行擴大培養(yǎng)，收集菌絲進(jìn)行酯酶同工酶電泳試驗，通過 酯酶同工酶譜的差異進(jìn)一步驗證變異株。
2. -種酯酶同工酶標(biāo)記榆黃燕菌株的方法，其特征在于包括 (1) 樣品的制備挑選榆黃菇菌絲用Tris-HCl緩沖液（0. 1M，pH8.0)研磨，冷凍（_2°C) 離心（1600r/min離心lOmin)，取上清，將上清置于-20 °C冰箱中保存?zhèn)溆茫? (2) 電泳條件采用聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳法，分離膠濃度為7%，pH8. 9,濃縮膠濃度為 2. 5%，pH6. 7,點樣量150 μ g (雙縮脲法測定蛋白的含量)，電泳緩沖液為Tris-Gly系統(tǒng)（pH 8. 3 )，起始電流10毫安，約1. 5h后，將電流升至48毫安，恒流4-5h，待溴酚蘭指示劑遷移至 下端約0. 5cm處停止電泳； (3) 染色照相電泳完畢后，酯酶同工酶用α-萘酯，β-萘酯和堅牢藍(lán)配制的染液，于37 °C染色10_15min，待顯出清晰酶帶后取出，用蒸餾水漂洗幾次，用GIS-2020D全自動數(shù)碼凝 膠成像分析系統(tǒng)（白光透射）照相。
3. -種DNA分子標(biāo)記榆黃菇品種鑒定方法，其特征在于包括菌絲體準(zhǔn)備、基因組總DNA 抽提和引物、ITS序列的PCR反應(yīng)、RAPD分析的PCR反應(yīng)體系和程序，具體步驟為： (1) 采用液體PDA培養(yǎng)基深層培養(yǎng)榆黃菇菌絲體，長好后過濾冷凍備用； (2) 取0. 2g液氮研磨的菌絲體粉末，放入1. 5mL以滅菌的EP管，加入600uL已65°C預(yù) 熱的2 X CTAB提取液，再加入1. 2 μ L的巰基乙醇，充分混勻，65°C水浴45min，期間定期晃動 混勻，將EP管從水浴中拿出，室溫冷卻后，再在該EP管中加入600yL的氯仿：異戊醇（24 : 1)，振蕩混勻5-10min，8000r/min離心lOmin，取上清，重復(fù)抽提兩次。
4. 加0. 8倍體積的冷的異丙醇，混勻，-20°C放置15-30min。 5. 10000r/min離心8min去沉淀，70%乙醇清洗2次，風(fēng)干。
6. 力卩 100yLTE(pH8.0)溶解。
7. 加入 2 μ L RNAase (10mg/mL)，37?溫箱中 30min。
8. 加等體積氯仿：異戊醇（24 : 1)，振蕩混勻，10000r/min離心10min取上清。
9. 加入2倍的冷的無水乙醇和1/10的3M NaAc，-20°C放置15-30min。 10. 10000r/min 離心 10min。
11. 取沉淀，70%乙醇清洗2次，風(fēng)干，加20 μ L TE (pH8. 0)溶解，4°C保存。 12. ITS測序引物：ZITS1 TCCgTAggTgAACCTgCg ZITS4 TCCTCCgCTTATTgATATgRAPD 引物。
13. (3)ITS序列的PCR反應(yīng)在0. 5mLEppendorf管內(nèi)配制50yL反應(yīng)體系，混勻，各 反應(yīng)均加10 μ L石蠟油。
14. 按下述程序進(jìn)行擴增：①95°C預(yù)變性5min ;②94°C變性lmin ;③55°C復(fù)性lmin ; ④72°C延伸lmin ;⑤重復(fù)步驟②?④32次；⑥72°C延伸lOmin。
15. (4)以Williams等（1990)的RAPD反應(yīng)體系為基礎(chǔ)，設(shè)置25 μ L PCR反應(yīng)體系，對 酶質(zhì)量及用量、Mg2+濃度、DNA模板濃度、dNTPs濃度等對擴增效果影響較大的因素進(jìn)行 了對照分析，最后確定反應(yīng)體系。
16. 反應(yīng)混合物用20-30 μ L礦物油覆蓋后，在PTC-100? PCR儀上進(jìn)行擴增，根據(jù)文 獻(xiàn)綜合分析，確定以38°C為退火溫度，建立反應(yīng)程序。
【文檔編號】A01H1/06GK104041406SQ201310517500
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2013年10月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月28日
【發(fā)明者】蔡德華 申請人:魯東大學(xué)