一種水櫟組織培養(yǎng)繁殖方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種水櫟新品種組織培養(yǎng)繁殖方法，包括選材、消毒處理、試管芽苗培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、移栽、成活一系列操作；在體胚誘導、增殖、成熟、萌發(fā)培養(yǎng)的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。本發(fā)明具有繁殖系數高，繁殖時間不受季節(jié)限制，取材對母體傷害小，無病蟲害困擾，在水櫟苗木生產及科研中均具有重要的應用價值。
【專利說明】一種水棟組織培養(yǎng)繁殖方法【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及水櫟的繁育方法，具體地說是涉及水櫟的組織培養(yǎng)方法。
【背景技術】
[0002]水櫟iQuercus /?辦ra)為殼斗科櫟屬樹種，原產美國東南部，主要分布于美國東南部的亞熱帶海岸平原及密西西比河中下游沖積平原區(qū)，在低地及海拔450米處均有分布，喜陽，適應性強，對土壤要求不嚴，既耐干旱瘠薄，又較耐水濕，抗寒，是優(yōu)良的用材和綠化景觀樹種。然而由于水櫟在我國的引種時間較短，且開花結果實較遲，結實大小年現象明顯，種子來源少，扦插及嫁接的成活率均很低，對種苗的大量繁育帶來了困難。組織培養(yǎng)技術是目前林業(yè)生物技術的主要內容之一，其主要用途是林木的大規(guī)模繁殖和分子育種。該技術的優(yōu)點在于繁殖效率高，占用空間小，不受季節(jié)及外界環(huán)境的限制，需要母體材料少，能夠在短期內提供大量優(yōu)質苗木。

【發(fā)明內容】

[0003]發(fā)明目的:本發(fā)明的目的是針對水櫟現有繁殖技術較為陳舊的問題，提供一種水櫟良種的組織培養(yǎng)方法，其目的在于提高其繁殖系數以適應其引種推廣及園林應用的需求。
[0004]技術方案:本發(fā)明提供的一種水櫟組織培養(yǎng)繁殖方法，其操作步驟包括如下:
(1)選材:于十月末在引種的十年生水櫟樹上采集種子，采用水浸法除去壞種子，將選出的種子置于沙、蔬菜顆粒肥、蘆葦炭、草碳混合物的基質中培養(yǎng)，取水櫟種子繁育的優(yōu)良實生幼苗嫩莖為接種材料；
(2)消毒處理:將幼苗嫩莖進行消毒處理；
(3)試管芽苗培養(yǎng):在無菌條件下，將步驟(2)中消毒后的外植體剪去接觸消毒液的傷口，留f 2cm帶芽莖段接種在啟動培養(yǎng)基中，然后將其置于普通日光燈為光源的環(huán)境下，其中光照強度為1600-25001χ，每日光照時間為16小時，溫度為(25±2)°C，濕度為50%~65%，培養(yǎng)22~25天，分化長成試管芽苗；
(4)壯苗培養(yǎng):由于初代誘導的小苗因受頑拗現象的影響直接增殖極易枯死，因此先進行壯苗培養(yǎng)，將步驟(3)中獲得的試管芽苗，剪切帶有1~2個腋芽的莖段或頂芽后，在超凈的工作臺上及無菌條件下，接種于經消毒的含有壯苗培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)瓶中，在光照強度為1600-25001χ，每日光照時間為16小時，溫度為(25±2) °C，濕度為50%~65%的條件下，進行壯苗培養(yǎng)，15^18天后進入下一步驟；
(5)增殖培養(yǎng):將從步驟(4)中長成的試管芽苗，剪切帶有廣2個腋芽的莖段或頂芽后，在超凈的工作臺上及無菌條件下，轉接于經消毒的含有增殖培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)瓶中，然后將其置于普通日光燈為光源的環(huán)境下，在光照強度為1600-25001χ，每日光照時間為16小時，溫度為(25±2) °C，濕度為50%~65%的條件下，對芽苗進行增殖培養(yǎng)，15~18天后增殖系數為2.45~4 ；(6)生根培養(yǎng):將步驟(5)中獲得的試管苗，去掉基部組織和部分葉片，留3~4片葉片，于無菌條件下接種于經消毒的含有生根培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)瓶中，在光照強度為1600-25001χ，每日光照時間為16小時，溫度為(25±2) °C，濕度為50%~65%的條件下，進行生根培養(yǎng)15天后轉至不含激素的WPM培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)；15~20天后生根率達50% ；
(7)移栽、成活:將步驟(6)中獲得的生根瓶苗，取出洗凈，移栽到含有泥炭和黃心土的基質中，其中泥炭與黃心土的體積比為1:1，然后澆透水，用塑料薄膜覆蓋容器口，保持溫度25~30 V，相對濕度75%~85%，培養(yǎng)30~35天，新葉完全展開，移栽成活率在80%~83%。
[0005]進一步地，所述步驟(2)中的消毒處理過程包括:選取的外植體剪切成3~4cm長的小段，用洗衣粉溶液浸泡5 min,自來水沖洗10次，轉入超凈工作臺，放入無菌燒杯中，用70%的酒精進行表面消毒30 S，無菌水沖洗3次，再用濃度為0.1%的升汞溶液消毒4.5分鐘，最后用無菌水沖洗6次。
[0006]進一步地，所述步驟(1)中的沙、蔬菜顆粒肥、蘆葦炭、草碳混合物體積比為4:1:1:10
[0007]進一步地，所述步驟(7)中的泥炭與黃心土的體積比為1:1-1.5。
[0008]進一步地，所述步驟(3)中的啟動培養(yǎng)基配方為:WPM基本培養(yǎng)基、0.01 mg.02mg.T1NAAJOg.L-1蔗糖、6.5 g.L-1卡拉膠；所述啟動培養(yǎng)基的pH值控制在
5.7~5.8。
[0009]進一步地，所述步驟(5)中的壯苗培養(yǎng)基配方為:WPM基本培養(yǎng)基、0.01mg.02 mg.L^1NAA,0.5 mg.L-1 玉米素、30g.L-1 蔗糖、6.5 g.L-1 卡拉膠；所述壯苗培養(yǎng)基配方PH值控制在5.7~5.8。
[0010]進一步地，所述步驟(6)的增殖培養(yǎng)基配方為:WPM基本培養(yǎng)基、0.lmg.0.02 mg.LlAA、30g.L-1蔗糖、6.5 g.L-1卡拉膠；增殖培養(yǎng)基pH值控制在5.7~5.8。
[0011]進一步地，所述步驟(7)中的生根培養(yǎng)基配方為:WPM基本培養(yǎng)基、1.5mg.L-1IBA,30g.L—1蔗糖、6.5 g.L—1卡拉膠，所述生根培養(yǎng)基的pH值為5.7~5.8。
[0012]進一步地，所述的WPM基本培養(yǎng)基即木本植物組織培養(yǎng)基的具體配方如下: 硝酸銨 NH4N03400 mg/L
硝酸鈣 Ca (NO3) 2.4H20556 mg/L
氯化鈣 CaCl2.2H2096 mg/L
硫酸鎂 MgSO4.7H20370 mg/L
磷酸二氫鉀 KH2PO4170 mg/L
硫酸鉀 K2S04990 mg/L
乙二胺四乙酸二鈉Na2.EDTA 37.3 mg/L 硫酸亞鐵 FeSO4.7H2027.8 mg/L
硫酸錳 MnSO4.H2O22.3 mg/L
硫酸鋅 ZnSO4.7H208.6 mg/L
硼酸 H3BO36.2 mg/L
鑰酸鈉 Na2MoO4.2H200.25 mg/L
硫酸銅 CuSO4.5H200.025 mg/L
氯化鈷 CoCl2.620.025 mg/L肌醇 C6H12O6.2H20100 mg/L
甘氨酸 NH2.CH2.COOH 2 mg/L 鹽酸硫胺素 C12H17ClOS.2HC1 I mg/L 鹽酸吡唆醇 C8HltlNO5P0.5 mg/L
煙酸 NC5H4COOH0.5 mg/L 。
[0013]有益效果:本發(fā)明相對于現有技術而言具有以下優(yōu)點:
(I)本發(fā)明所述的一種水櫟組織培養(yǎng)方法相對于播種繁殖和其他無性繁殖而言，通過適當的操作和適宜的培養(yǎng)基，具有操作簡便、節(jié)約占地空間，繁殖時間不受季節(jié)限制，其萌發(fā)率高，達到90%以上。
[0014](2)本發(fā)明取材對母體無傷害，無病蟲害困擾，繁殖系數高，能夠保持原植株的優(yōu)良性狀的優(yōu)點，在水櫟苗木生產及科研中均具有重要的應用價值。
[0015](3)本發(fā)明與常規(guī)組培繁殖方法相比，由于初代誘導的水櫟小苗因受頑拗現象的影響直接增殖極易枯死，本法在操作中將壯苗培養(yǎng)提前一步驟，在增殖誘導之前進行，有效保證了增殖成活率和增值系數。
【具體實施方式】
[0016]下面結合實施例對本發(fā)明作更進一步的說明。
[0017]以下實例所用的基本培養(yǎng)基的配方如下:
芽誘導基本培養(yǎng)基為WPM培養(yǎng)基，其中，常量元素的組分和其對應的使用濃度如下:硝酸銨(NH4NO3) 400 mg/L、硝酸鈣(Ca(NO3)2.4Η20) 556 mg/L、氯化鈣(CaCl2.2Η20) 96 mg/L、硫酸鎂(MgSO4.7H20) 370 mg/L、磷酸二氫鉀(KH2PO4) 170 mg/L、硫酸鉀(K2SO4) 990 mg/L ；微量元素的組分和其對應的使用濃度如下:硫酸錳(MnSO4.H2O )22.3 mg/L、硫酸鋅(ZnSO4.7H20) 8.6 mg/L、硼酸(H3BO3) 6.2 mg/L、鑰酸鈉(Na2MoO4.2H20) 0.25 mg/L、硫酸銅(CuSO4.5Η20)0.025 mg/L、硫酸銅(CuSO4.5Η20)0.025 mg/L、氯化鈷(CoCl2.62 )0.025 mg/L ；
鐵鹽的組分和其對應的使用濃度如下:乙二胺四乙酸二鈉(Na2.EDTA) 37.3 mg/L、硫酸亞鐵(FeSO4.7H20) 27.8 mg/L ；
有機成分的組分和其對應的濃度如下:肌醇100 mg/L、甘氨酸(Gly) 2 mg/L、鹽酸硫胺素(VB1) I mg/L、鹽酸吡哆醇(VB6) 0.5 mg/L、煙酸(VPP) 0.5 mg/L。
[0018]利用上述的基本培養(yǎng)基配置誘導培養(yǎng)基、壯苗培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基及生根培養(yǎng)基。
[0019]其中，誘導培養(yǎng)基:WPM基本培養(yǎng)基+6-BA (0.05 mg.L—1)+ NAA (0.02 mg.L_0+ 蔗糖(30g.L-1) + 卡拉膠(6.5 g.L-1)，pH 值為 5.7~5.8。
[0020]壯苗培養(yǎng)基為:WPM基本培養(yǎng)基+6_BA(0.1 mg.L—1)+ +蔗糖(25g.L-1) +卡拉膠(6.5 g.L-1)+ 活性炭(lg.L-1)，pH 值為 5.7~5.8。
[0021]增殖培養(yǎng)基:WPM基本培養(yǎng)基+6-ΒΑ(0.1 mg.L—1)+NAA(0.02 mg.L—1) + 蔗糖(30g.L-1) + 卡拉膠(6.5 g.L-1)，pH 值為 5.7~5.8。
[0022]所述的生根培養(yǎng)基為:WPM基本培養(yǎng)基+IBA(2.5mg.L-1)+蔗糖(30g.L-1) +卡拉膠(6.5 g.L—lpH 值為 5.7~5.8。
[0023]將上述配置好的培養(yǎng)基注入玻璃瓶中，經高溫高壓消毒20分鐘，待用，其中，溫度為 120-125 V，壓力為 1.1 KG/CM2。
[0024]本實施例選材:從美國原產地德克薩斯、田納西、路易斯安娜和阿肯色等州引進水櫟種源種子進行育苗造林試驗，分別在江蘇省林科院、宜興市林場、無錫惠山森林公園等地營建種源試驗林，選出樹高、胸徑、冠幅、分枝、抗逆性等綜合性狀表現優(yōu)良的水櫟路易斯安那種源9903號，確定為優(yōu)良種源，為本發(fā)明所用材料。
[0025]一種水櫟組織培養(yǎng)繁殖方法，包括以下步驟:
(1)選材:于十月末在引種的十年生水櫟樹上采集種子，采用水浸法除去壞種子，將選出的種子置于沙、蔬菜顆粒肥、蘆葦炭、草碳混合物的基質中培養(yǎng)，所述步驟(1)中的沙、蔬菜顆粒肥、蘆葦炭、草碳混 合物體積比為4:1:1:1，取水櫟種子繁育的優(yōu)良實生幼苗嫩莖為接種材料；
(2)消毒處理:將幼苗嫩莖進行消毒處理；
(3)試管芽苗培養(yǎng):在無菌條件下，將步驟(2)中消毒后的外植體剪去接觸消毒液的傷口，留f 2cm帶芽莖段接種在經消毒的含有啟動培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)瓶中，然后將其置于普通日光燈為光源的環(huán)境下，其中光照強度為1600-25001χ，每日光照時間為16小時，溫度為(25 ± 2) °C，濕度為50%~65%，培養(yǎng)25天，分化長成試管芽苗；
(4)壯苗培養(yǎng):由于初代誘導的小苗因受頑拗現象的影響直接增殖極易枯死，因此先進行壯苗培養(yǎng)，將步驟(3)中獲得的試管芽苗，剪切帶有1~2個腋芽的莖段或頂芽后，在超凈的工作臺上及無菌條件下，接種于經消毒的含有壯苗培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)瓶中，在光照強度為1600-25001χ，每日光照時間為16小時，溫度為(25±2)°C，濕度為50%~65%的條件下，進行壯苗培養(yǎng)，18天后進入下一步驟；
(5)增殖培養(yǎng):將從步驟(4)中長成的試管芽苗，剪切帶有f2個腋芽的莖段或頂芽后，在超凈的工作臺上及無菌條件下，轉接于經消毒的含有增殖培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)瓶中，然后將其置于普通日光燈為光源的環(huán)境下，在光照強度為1600-25001χ，每日光照時間為16小時，溫度為(25±2) °C，濕度為50%~65%的條件下，對芽苗進行增殖培養(yǎng)，增殖系數為2.45~4 ；
(6)生根培養(yǎng):將步驟(5)中獲得的試管苗，去掉基部組織和部分葉片，留3~4片葉片，在超凈的工作臺上及無菌條件下，接種于經消毒的含有生根培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)瓶中，在光照強度為1600-25001χ，每日光照時間為16小時，溫度為(25±2)°C，濕度為50%~65%的條件下，進行生根培養(yǎng)15天后轉至不含激素的WPM培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)18天后生根率在50% ；
(7)移栽、成活:將步驟(6)中獲得的生根瓶苗，取出洗凈，移栽到含有泥炭和黃心土的基質中，其中泥炭與黃心土的體積比為1:1，然后澆透水，用塑料薄膜覆蓋容器口，保持溫度25~30 V，相對濕度75%~85%，培養(yǎng)30~35天，新葉完全展開，移栽成活率在80%~83%。
【權利要求】
1.一種水櫟組織培養(yǎng)繁殖方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)選材:于十月末在引種的十年生水櫟樹上采集種子，采用水浸法除去壞種子，將選出的種子置于沙、蔬菜顆粒肥、蘆葦炭、草碳混合物的基質中培養(yǎng)，取水櫟種子繁育的優(yōu)良實生幼苗嫩莖為接種材料；所述沙、蔬菜顆粒肥、蘆葦炭、草碳混合物體積比為4:1:1:1 ; (2)消毒處理:將幼苗嫩莖進行消毒處理； (3)試管芽苗培養(yǎng):在無菌條件下，將步驟(2)中消毒后的外植體剪去接觸消毒液的傷口，留f 2cm帶芽莖段接種在經消毒的含有啟動培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)瓶中，然后將其置于普通日光燈為光源的環(huán)境下，濕度為50%飛5%，培養(yǎng)22~25天，分化長成試管芽苗；所述啟動培養(yǎng)基配方為:WPM基本培養(yǎng)基、0.01 mg.L_16-BA>0.02mg.1^1NAAJOg.171 鹿糖、6.5 g.171 卡拉膠；所述啟動培養(yǎng)基的pH值控制在5.7^5.8 ； (4)壯苗培養(yǎng):將步驟(3)中獲得的試管芽苗，剪切帶有廣2個腋芽的莖段或頂芽后，轉接于經消毒的含有壯苗培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)瓶中，濕度為50%~65%的條件下，進行壯苗培養(yǎng)，15~18天后進入下一步驟；所述壯苗培養(yǎng)基配方為:WPM基本培養(yǎng)基、0.01mg.^-ΒΑ,Ο.02mg.L_1NAA>0.5 mg.L—1玉米素、30g.L—1鹿糖、6.5 g.L—1卡拉膠；所述壯苗培養(yǎng)基配方pH值控制在5.7~5.8 ； (5)增殖培養(yǎng):將從步驟(4)中長成的試管芽苗，剪切帶有廣2個腋芽的莖段或頂芽后，轉接于增殖培養(yǎng)基中，濕度50%~65% ;增殖培養(yǎng)15~20天；所述增殖培養(yǎng)基配方為:WPM基本培養(yǎng)基、0.lmg.Ll-BA、0.02 mg.L^1NAA, 30g.1 蔗糖、6.5 g.1 卡拉膠；增殖培養(yǎng)基pH值控制在5.7~5.8 ; (6)生根培養(yǎng):將步驟(5)中獲得的試管苗，去掉基部組織和部分葉片，留3~4片葉片，在無菌條件下，接種于經消毒的含有生根培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)瓶中，在光照強度為1600-25001χ，每日光照時間為16小時，溫度為(25±2) °C，濕度為50%~65%的條件下，進行生根培養(yǎng)15天后轉至不含激素的WPM培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)15~20天；所述生根培養(yǎng)基配方為:WPM基本培養(yǎng)基、1.5mg.T1IBAdOg.L—1蔗糖、6.5 g.L—1卡拉膠，所述生根培養(yǎng)基的pH值為 5.7~5.8 ； (7)移栽、成活:將步驟(6)中獲得的生根瓶苗，取出洗凈，移栽到含有泥炭和黃心土的基質中，然后澆透水，用塑料薄膜覆蓋容器口，保持溫度25~30 V，相對濕度75%~85%，培養(yǎng)30~35天。
2.根據權利要求1所述的水櫟組織培養(yǎng)繁殖方法，其特征在于:所述步驟(3)、步驟(4)、步驟(5)、步驟(6)中的培養(yǎng)條件為:光照強度為1600-25001χ，每日光照時間為16h，溫度為(25±2)°C。
3.根據權利要求1所述的水櫟組織培養(yǎng)繁殖方法，其特征在于:所述步驟(2)中的消毒處理過程包括:選取的外植體剪切成3~4cm長的小段，用洗衣粉溶液浸泡5 min,自來水沖洗10次，轉入超凈工作臺，放入無菌燒杯中，用70%的酒精進行表面消毒30 S，無菌水沖洗3次，再用濃度為0.1%的升汞溶液消毒4.5分鐘，最后用無菌水沖洗6次。
4.根據權利要求1或2所述的水櫟組織培養(yǎng)繁殖方法，其特征在于:所述步驟(7)中的泥炭與黃心土的體積比為1: f 1: 1.5。
5.根據權利要求1~4所述的水櫟組織培養(yǎng)繁殖方法，其特征在于:所述的WPM基本培養(yǎng)基即木本植物組織培養(yǎng)基的具體配方如下:硝酸銨 NH4N03400 mg/L硝酸鈣 Ca (NO3) 2.4H20556 mg/L氯化鈣 CaCl2.2H2096 mg/L硫酸鎂 MgSO4.7H20370 mg/L磷酸二氫鉀 KH2PO4170 mg/L硫酸鉀 K2S04990 mg/L乙二胺四乙酸二鈉Na2.EDTA 37.3 mg/L硫酸亞鐵 FeSO4.7H2027.8 mg/L硫酸錳 MnSO4.H2O22.3 mg/L硫酸鋅 ZnSO4.7H208.6 mg/L硼酸 H3BO36.2 mg/L鑰酸鈉 Na2MoO4.2H200.25 mg/L硫酸銅 CuSO4.5H200.025 mg/L氯化鈷 CoCl2.6 H2O0.025 mg/L肌醇 C6H12O6.2H20100 mg/L甘氨酸 NH2.CH2.COOH2 mg/L鹽酸硫胺素 C12H17ClOS.2HC1 I mg/L鹽酸吡 唆醇 C8HltlNO5P0.5 mg/L煙酸 NC5H4COOH0.5 mg/L 。
【文檔編號】A01H4/00GK103535280SQ201310519136
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年10月29日 優(yōu)先權日:2013年10月29日
【發(fā)明者】黃利斌, 張敏, 陳智敏, 竇全琴, 董筱昀 申請人:江蘇省林業(yè)科學研究院