一種新型植物育性調(diào)控構(gòu)建體及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及植物育種領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及純合隱性核雄性不育水稻植株的育性恢復(fù)及其用途。進(jìn)一步本發(fā)明涉及構(gòu)建植物雄性不育系、保持系的方法以及遺傳轉(zhuǎn)化材料，更具體地，本發(fā)明涉及一種構(gòu)建體，一種水稻細(xì)胞、組織或器官，一種構(gòu)建水稻雄性不育系和保持系的方法，一種恢復(fù)水稻不育植株雄性育性的方法，一種制備水稻種子的方法，一種遺傳轉(zhuǎn)化材料，一種用于制備雜交水稻的方法，以及水稻雄性不育系在制備雜交水稻中的用途。
【專利說(shuō)明】一種新型植物育性調(diào)控構(gòu)建體及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物育種領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及純合隱性核雄性不育水稻植株的育性恢復(fù)及其用途。進(jìn)一步本發(fā)明涉及構(gòu)建植物雄性不育系、保持系的方法以及遺傳轉(zhuǎn)化材料，更具體地，本發(fā)明涉及一種構(gòu)建體，一種水稻細(xì)胞、組織或器官，一種構(gòu)建水稻雄性不育系和保持系的方法，一種恢復(fù)水稻不育植株雄性育性的方法，一種制備水稻種子的方法，一種遺傳轉(zhuǎn)化材料，一種用于制備雜交水稻的方法，以及水稻雄性不育系在制備雜交水稻中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]雜交育種是選育新品種主要途徑，是近代育種最重要的方法，雜交種的創(chuàng)制、利用和產(chǎn)業(yè)化是國(guó)際農(nóng)業(yè)跨國(guó)集團(tuán)種業(yè)市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)的焦點(diǎn)。由于雜交引起基因重組，后代會(huì)出現(xiàn)組合雙親控制的優(yōu)良性狀基因型，產(chǎn)生加性效應(yīng)，并利用某些基因互作，形成具超親類型新個(gè)體。作物雜交育種具有巨大的發(fā)展?jié)摿Γ呀?jīng)成為提高糧食產(chǎn)量的主要途徑。近幾十年來(lái)，雜種優(yōu)勢(shì)作為一種提高作物產(chǎn)量、改良作物品質(zhì)、提高作物抗蟲、抗病、抗逆的手段已被廣泛利用。利用雜種優(yōu)勢(shì)育種已成為許多作物的主要育種方法。而有效控制作物自花授粉、受精是獲得高純度雜交Fl種子、從而利用作物雜種優(yōu)勢(shì)的關(guān)鍵。而雜交育種中必須要解決的關(guān)鍵問(wèn)題是(1)獲得可用的不育系:一般為雄性不育(由細(xì)胞質(zhì)不育或隱性核不育基因控制)；(2)雜交配組:不育系可與相應(yīng)的父本植物組合生產(chǎn)具有優(yōu)良性狀的雜交后代；(3)不育系的繁殖:不育系能在一定條件下恢復(fù)育性使其得到保持。因此，作物雄性不育系的選育是雜種優(yōu)勢(shì)利用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
[0003]上世紀(jì)七、八十年代，以袁隆平為代表的中國(guó)科學(xué)家們利用水稻野敗型細(xì)胞質(zhì)不育基因資源創(chuàng)制了 “三系”雜交水稻，使水稻產(chǎn)量提高了近20%，被稱為第二次“綠色革命”，為保障我國(guó)糧食供應(yīng)起到了非常重要的作用，使我國(guó)的水稻育種與生產(chǎn)技術(shù)處于世界領(lǐng)先水平，也向世人展示了雜種優(yōu)勢(shì)的強(qiáng)大作用。水稻雜交育種中常用的是“三系”和“兩系”雜交?！叭怠彪s交需要有特定的恢復(fù)系和保持系，育種程序和生產(chǎn)環(huán)節(jié)復(fù)雜，選育新不育系及新組合的周期長(zhǎng)、效率低，種質(zhì)資源的利用率低于5%。另外，三系雜交粳稻優(yōu)勢(shì)不強(qiáng)，不育細(xì)胞質(zhì)較單一，存在某種毀滅性病蟲害暴發(fā)的潛在危險(xiǎn)?！皟上怠彪s交水稻由于不受恢復(fù)系、保持系之間關(guān)系的制約，親本的遺傳多樣性得到明顯改善，選育出高產(chǎn)雜交稻組合的速度明顯加快，促進(jìn)了超級(jí)雜交稻的研究和生產(chǎn)。但目前“兩系”雜交中采用的不育系多為“光溫敏”不育系，其育性受環(huán)境中的溫度和光照影響。這些環(huán)境因素的不穩(wěn)定會(huì)直接影響雜交種子的純度和數(shù)量，加大制種風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重時(shí)會(huì)使企業(yè)和農(nóng)民造成重大經(jīng)濟(jì)損失，限制“兩系”雜交稻的大面積推廣。而且利用目前技術(shù)所能選用的兩系雜交稻不育系十分有限，例如粳稻品種中幾乎沒有很好的兩 系雜交組合，限制了品種資源的充分利用。因而，培育不受環(huán)境影響且可自主繁殖的穩(wěn)定不育系已成為限制“兩系”雜交技術(shù)廣泛應(yīng)用的技術(shù)瓶頸。
[0004]玉米是利用雜種優(yōu)勢(shì)最早，且雜交種在世界上普及推廣最成功的作物。玉米是雌雄異花作物，繁殖系數(shù)高的作物，雜交種生產(chǎn)時(shí)，在隔離區(qū)內(nèi)父、母本按比例種植，母本雄穗剛露出時(shí)拔掉，父本花粉自由授粉雜交。玉米雜交優(yōu)勢(shì)的利用及生產(chǎn)上應(yīng)用雜交種，使得玉米生產(chǎn)水平產(chǎn)生了巨大變化。但是，玉米雜交種生產(chǎn)中存在著常用育種的親本遺傳基礎(chǔ)差異不夠大，并因此影響到主要育種目標(biāo)如高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、抗逆、早熟等的盡快實(shí)現(xiàn)。同時(shí)，在雜交種生產(chǎn)過(guò)程中，存在著母本去雄工作繁重且不徹底、進(jìn)而影響雜交種產(chǎn)量和質(zhì)量不穩(wěn)定的問(wèn)題，急待解決。
[0005]雜種優(yōu)勢(shì)在雙子葉植物如煙草和油菜的生產(chǎn)中也得到應(yīng)用。油菜是世界的第三大油料作物，而中國(guó)油菜總產(chǎn)和面積占世界三分之一，是最大的油菜生產(chǎn)國(guó)，中國(guó)的油菜雜種優(yōu)勢(shì)利用處于世界領(lǐng)先水平。油菜中常用的雜交育種也是基于細(xì)胞質(zhì)不育和細(xì)胞核不育兩大類，存在“三系”和“兩系”雜交育種，因此，與水稻中一樣，存在同樣的種質(zhì)資源利用率低、雜交種純度較低的問(wèn)題。
[0006]因而，目前的植物雜交育種技術(shù)仍有待改進(jìn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決上述技術(shù)問(wèn)題之一或至少提供一種有用的商業(yè)選擇。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提出一種具有能夠有效構(gòu)建新型穩(wěn)定的水稻雄性不育系和相應(yīng)保持系并充分利用水稻種質(zhì)資源用于雜交育種、提高雜交種純度的手段。
[0008]在本發(fā)明的第一方面，發(fā)明人提出了一種調(diào)控植物育性的方法，具體方案描述為:本發(fā)明以植物純合隱性核雄性不育突變體為轉(zhuǎn)化受體材料創(chuàng)制一種新型保持系。通過(guò)將緊密連鎖的2個(gè)目標(biāo)基因(育性恢復(fù)基因和顏色篩選基因)轉(zhuǎn)化至純合隱性不育受體植株中。其中，育性恢復(fù)基因可使轉(zhuǎn)化受體育性恢復(fù)，通過(guò)轉(zhuǎn)化受體自交結(jié)實(shí)可分離得到外源基因(即上述2個(gè)目標(biāo)基因)純合的轉(zhuǎn)基因種子，進(jìn)一步培育成為植株，與不育系授粉雜交得到雜合轉(zhuǎn)基因種子，進(jìn)一步培育為植株作為保持系；保持系可以產(chǎn)生等量的兩類花粉，一半為含有轉(zhuǎn)基因，另一半為不含有轉(zhuǎn)基因。將保持系作父本與純合隱性不育系授粉雜交后，結(jié)實(shí)產(chǎn)生兩類種子，一類為含有轉(zhuǎn)基因的種子，另一類為不含轉(zhuǎn)基因的種子，篩選基因可以用于兩類種子的分揀，分揀出`的非轉(zhuǎn)基因種子用作繁育不育系生產(chǎn)雜交種，轉(zhuǎn)基因種子仍可繼續(xù)用作保持系，與不育系雜交以源源不斷地、穩(wěn)定地生產(chǎn)不育系。
[0009]本發(fā)明中所述的“保持系”的定義是將構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物純合隱性核雄性不育突變體后，產(chǎn)生的含有植物隱性核雄性不育基因和外源基因(即構(gòu)建體含有的2個(gè)目的基因)的后代植株或種子，其中植物隱性核雄性不育基因位點(diǎn)為隱性純合狀態(tài)，外源基因(即2個(gè)目的基因)位點(diǎn)為轉(zhuǎn)基因雜合狀態(tài)。
[0010]本發(fā)明所述的育性恢復(fù)基因可分離自任何植物，所述育性調(diào)控方法可應(yīng)用于任何植物，所述植物包括但不限于玉米(Zea mays)、芥菜(Brassica napus, Brassicarapassp.)、紫花首猜(Medicago sativa)、7_K稻(Oryza sativa)、黑麥(Secale cereale)、高梁(Sorghum bicolor, Sorghum vulgare)、向曰葵(Helianthus annuus)、小麥(Triticumaestivum)、大豆(Glycine max)、煙草(Nicotiana tabacum)、黍(Panicumspp.)、土豆(Solanum tuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、棉花(Gossypium hirsutum)紅薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(Cofea spp.)、椰子(Cocosnucifera)、菠蘿(Ananas comosus)、橘樹(Citrus spp.)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camellia sinensis)、香蕉(Musa spp.)、魚尋梨(Persea americana)、無(wú)花果(Ficuscasica)、番石槽(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、撤攬(Olea europaea)、燕麥(Avena sativa)、大麥(Hordeum vulgare)、油菜(Brassica napus)蔬菜、裝飾植物和針葉樹。優(yōu)選地，植物包括玉米、大豆、向日葵、紅花、芥菜、小麥、大麥、黑麥、紫花苜蓿、水稻、棉花、油菜和高粱。
[0011]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該知曉，本發(fā)明中所提到的雄性不育是指雄配子不能正常發(fā)育的現(xiàn)象，一旦形成，是可遺傳的，該種雄性不育的植株，雌蕊能正常發(fā)育。本發(fā)明中所提到的雄性不育基因，是指導(dǎo)致雄配子不能正常發(fā)育的關(guān)鍵基因之一被突變、遏制或受到其它影響所造成的結(jié)果，其野生型序列結(jié)構(gòu)可作為雄性不育恢復(fù)基因。
[0012]為了更好的實(shí)施本方案，所述雄性不育為完全不育，即不育株花粉完全無(wú)活性或徹底無(wú)花粉，育性恢復(fù)基因最好有徹底恢復(fù)育性的恢復(fù)能力(即將完全不育植株的育性恢復(fù)至90%以上)。
[0013]到目前為止，已經(jīng)文獻(xiàn)發(fā)表公開的育性基因有很多，其中包括Arabidopsis ABORTED MICROSPORES (AMS)基因，Sorensen et al., The PlantJournal (2003)33 (2):413-423) ；Arabidopsis MSI 基因(Wilson et al., ThePlant Journal(2001)39(2):170-181) ；NEF1 基因(Ariizumi et al., The PlantJournal(2004)39(2):170-181) ；Arabidopsis AtGPATl 基因(Zheng et al., ThePlant Cell (2003) 15:1872-1887) ；Arabdiopsis dde2_2 突變(其顯示出丙二烯氧化物合酶(syntase)基因的缺陷)(Malek et al.，Planta(2002) 216:187-192)；Arabidopsis 匿名(faceless)花粉-1 基因(flpl) (Ariizumi et al, Plant Mol.Biol.(2003)53:107-116) ；Arabidopisis MALE MEIOCYTE DEATHl 基因(Yang et al., ThePlant Cell (2003) 15:1281-1295);絨氈層特異性鋅指基因 TAZl (Kapoor et al., ThePlant Cell (2002) 14:2353-2367)和 TAPETUM DETERMINANT1 基因(Lan et al, The PlantCell (2003) 15:2792-2804)。
[0014]本發(fā)明所述的顏`色篩選基因，包括但不限于紅色熒光基因、青色熒光蛋白基因、黃色熒光蛋白基因、熒光素酶基因、綠色熒光蛋白基因、花青甙Pi基因和草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶編碼基因。
[0015]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該知曉，在獲得任意一個(gè)純合隱性核雄性不育突變體材料，及其相應(yīng)的雄性不育恢復(fù)基因后，均可應(yīng)用本發(fā)明所公開的方案構(gòu)建含有育性恢復(fù)基因和顏色篩選基因的載體，轉(zhuǎn)化相應(yīng)的純合隱性核雄性不育突變體植物材料，通過(guò)轉(zhuǎn)化受體自交結(jié)實(shí)可分離得到外源基因(即育性恢復(fù)基因和顏色篩選基因)純合的轉(zhuǎn)基因種子，進(jìn)一步培育成為植株，與不育系授粉雜交得到雜合轉(zhuǎn)基因種子，進(jìn)一步培育成為植株作為保持系；其中獲得的保持系可以繼續(xù)與不育系雜交用于生產(chǎn)不育系和相應(yīng)的保持系，以獲得穩(wěn)定分離的50%的保持系和50%的不育系，獲得的不育系可直接用于雜交制種。
[0016]在本發(fā)明的第二方面，具體地，發(fā)明人提出了一種調(diào)控水稻育性的方法，具體方案描述為:發(fā)明人以純合隱性核雄性不育水稻突變體為轉(zhuǎn)化受體材料創(chuàng)制一種新型保持系。通過(guò)將緊密連鎖的2個(gè)目標(biāo)基因(育性恢復(fù)基因和顏色篩選基因)轉(zhuǎn)化至純合隱性不育受體植株中。其中，育性恢復(fù)基因可使轉(zhuǎn)化受體育性恢復(fù)，通過(guò)轉(zhuǎn)化受體自交結(jié)實(shí)可分離外源基因純合的轉(zhuǎn)基因種子，進(jìn)一步培育成為植株，與不育系授粉雜交得到雜合轉(zhuǎn)基因種子，進(jìn)一步培育成為植株作為保持系；保持系可以產(chǎn)生等量的兩類花粉，一半為含有轉(zhuǎn)基因，另一半為不含有轉(zhuǎn)基因。將保持系作父本與純合隱性不育系授粉雜交后，結(jié)實(shí)產(chǎn)生兩類種子，一類為含有轉(zhuǎn)基因的種子，另一類為不含轉(zhuǎn)基因的種子，顏色篩選基因可以用于兩類種子的分揀，分揀出的非轉(zhuǎn)基因種子用作不育系生產(chǎn)雜交種，而轉(zhuǎn)基因種子仍可繼續(xù)用作保持系，與不育系雜交以源源不斷地、穩(wěn)定地生產(chǎn)不育系。
[0017]更具體地，，本發(fā)明可以水稻核隱性不育ms26 / ms26突變體為遺傳轉(zhuǎn)化受體材料，將緊密連鎖的2個(gè)目標(biāo)基因(Ms26即0sCYP704B2和熒光色選基因)遺傳轉(zhuǎn)化至上述受體材料，目標(biāo)基因之一的育性恢復(fù)基因0sCYP704B2 (對(duì)應(yīng)野生型Ms26基因)可使轉(zhuǎn)化受體育性恢復(fù)，通過(guò)自交結(jié)實(shí)，可分離外源基因純合的種子，進(jìn)一步培育為轉(zhuǎn)基因植株，與不育系授粉雜交使不育系育性恢復(fù)，并結(jié)實(shí)得到轉(zhuǎn)基因雜合的種子，進(jìn)一步培育為植株，即為，穩(wěn)定的保持系(mS26/mS26，轉(zhuǎn)基因雜合);另一目標(biāo)基因即熒光色選基因用于保持系與相應(yīng)的不育系授粉雜交后，不育系植株上結(jié)實(shí)的轉(zhuǎn)基因種子和非轉(zhuǎn)基因種子的分揀，分揀出的非轉(zhuǎn)基因種子用作不育系生產(chǎn)雜交種，轉(zhuǎn)基因種子繼續(xù)用作保持系與不育系進(jìn)行授粉雜交以源源不斷地穩(wěn)定地生產(chǎn)不育系和保持系。由于該技術(shù)利用生物技術(shù)生產(chǎn)非轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，解決了水稻雜交制種過(guò)程中面臨的瓶頸問(wèn)題，即三系法資源利用率低而兩系法中不育系育性不穩(wěn)定的問(wèn)題。 [0018]在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了一種調(diào)控植物育性的構(gòu)建體，該構(gòu)建體包括:第一表達(dá)盒，所述第一表達(dá)盒含有第一核酸分子，所述第一核酸分子編碼植物雄性不育恢復(fù)基因；以及第二表達(dá)盒，所述第二表達(dá)盒含有第二核酸分子，所述第二核酸分子編碼篩選基因(如熒光色選基因)。利用該構(gòu)建體，能夠有效地將植物雄性不育恢復(fù)基因和篩選基因引入到植物純合隱性核雄性不育突變體植株中，通過(guò)自交結(jié)實(shí)，可分離外源基因純合的轉(zhuǎn)基因種子，進(jìn)一步培育為植株，與不育系授粉雜交得到轉(zhuǎn)基因雜合的種子，進(jìn)一步培育為植株，即為穩(wěn)定的保持系，不攜帶外源基因的種子及植株作為不育系。由此，可以有效地用于植物雜交育種。
[0019]其中，所述的第一表達(dá)盒還可以進(jìn)一步包括:第一啟動(dòng)子，所述第一啟動(dòng)子與所述第一核酸分子可操作地相連，所述第一啟動(dòng)子為雄配子發(fā)育過(guò)程中的特異性啟動(dòng)子，具體的所述雄配子特異性啟動(dòng)子可以啟動(dòng)所連接的第一核酸分子特異性地在雄配子中的表達(dá)并可以恢復(fù)上述純合隱性核雄性不育水稻突變體的育性；以及第一終止子，所述第一終止子與所述第一核酸分子可操作地相連。
[0020]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述第二表達(dá)盒進(jìn)一步包括:第二啟動(dòng)子，所述第二啟動(dòng)子與所述第二核酸分子可操作地相連，所述第二啟動(dòng)子為愈傷組織和/或種子、種皮、胚和胚乳等特異性的啟動(dòng)子；第二終止子，所述第二終止子與所述第二核酸分子可操作地相連。
[0021]在本發(fā)明的第四方面，具體的，本發(fā)明提出了調(diào)控水稻育性的構(gòu)建體，該構(gòu)建體包括:第一表達(dá)盒，所述第一表達(dá)盒含有第一核酸分子，所述第一核酸分子編碼水稻雄性不育恢復(fù)基因；以及第二表達(dá)盒，所述第二表達(dá)盒含有第二核酸分子，所述第二核酸分子編碼篩選基因(如熒光色選基因)。利用該構(gòu)建體，能夠有效地將水稻雄性不育恢復(fù)基因和篩選基因引入到純合隱性核雄性不育水稻突變體植株中，通過(guò)自交結(jié)實(shí)，可分離外源基因純合的轉(zhuǎn)基因種子，進(jìn)一步培育為植株，與不育系授粉雜交得到轉(zhuǎn)基因雜合種子，進(jìn)一步培育為植株，即為穩(wěn)定的保持系，不攜帶外源基因的種子作為不育系。由此，可以有效地用于水稻雜交育種。
[0022]其中，所述調(diào)控水稻育性的構(gòu)建體的第一表達(dá)盒還可以進(jìn)一步包括:第一啟動(dòng)子，所述第一啟動(dòng)子與所述第一核酸分子可操作地相連，所述第一啟動(dòng)子為雄配子特異性啟動(dòng)子，具體的所述雄配子特異性啟動(dòng)子可以啟動(dòng)所連接的第一核酸分子特異性地在雄配子中的表達(dá)，并可以恢復(fù)上述純合隱性核雄性不育水稻突變體的育性；以及第一終止子，所述第一終止子與所述第一核酸分子可操作地相連。具體地，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)于育性恢復(fù)基因0sCYP704B2 (Ms26)，可以采用0sCYP704B2的內(nèi)源啟動(dòng)子、ORF區(qū)或基因組序列及終止區(qū)的序列，均為野生型水稻基因組序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述第一啟動(dòng)子具有如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述第一終止子具有如SEQID NO:12所示的核苷酸序列。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用該啟動(dòng)子和終止子的組合，能夠顯著地提聞表達(dá)相應(yīng)蛋白的效率，進(jìn)而能夠提聞利用該構(gòu)建體構(gòu)建保持系和不育系的效率，并且能夠更有效地使水稻mS26/mS26不育受體植株的育性得到恢復(fù)。
[0023]其中，所述調(diào)控水稻育性的構(gòu)建體的第二表達(dá)盒進(jìn)一步包括:第二啟動(dòng)子，所述第二啟動(dòng)子與所述第二核酸分子可操作地相連，所述第二啟動(dòng)子為愈傷組織和/或種子、種皮、胚和胚乳等特異性的啟動(dòng)子；第二終止子，所述第二終止子與所述第二核酸分子可操作地相連。具體地，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述第二啟動(dòng)子包括一個(gè)35S增強(qiáng)子和LTP2啟動(dòng)子，其中35s增強(qiáng)子具有如SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列，LTP2具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述第二終止子具有如SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列。由此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，RFP (r)的開放讀碼框連接于來(lái)自大麥且為愈傷組織和種子(種皮)特異性啟動(dòng)子LTP2和來(lái)自馬鈴薯的終止子PIN II之間，在LTP2啟動(dòng)子前還有一個(gè)來(lái)自煙草花葉病毒的35S增強(qiáng)子序列，重組成RFP(r)基因表達(dá)盒(35S::LTP2:: RFP(r):: PINII)。含有該表達(dá)框的水稻愈傷及種子在熒光激發(fā)下呈現(xiàn)非常容易辨認(rèn)的紅色，因此該表達(dá)框在本發(fā)明中用于遺傳轉(zhuǎn)化的篩選標(biāo)記和用于辨認(rèn)和分選保持系和不育系種子。
[0024]由此，可以通過(guò)常`規(guī)技術(shù)，將前述構(gòu)建體引入到相應(yīng)的植物細(xì)胞、組織或器官中，以便得到可以后續(xù)用于研究、雜交的樣本。因而，在本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提出了一種植物細(xì)胞、組織或器官。根據(jù)上述內(nèi)容可知，該植物細(xì)胞、組織或器官中含有前面所述的構(gòu)建體。
[0025]在本發(fā)明中，所述將核苷酸序列或構(gòu)建體“引入”到植株，表示可通過(guò)直接轉(zhuǎn)化的方法獲得，如對(duì)植物細(xì)胞、組織或器官進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、微粒轟擊、電穿孔，或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法的任何一種；或者，可通過(guò)將具有異源核苷酸序列的植株與另一植株雜交來(lái)獲得，使其后代具有該異源核苷酸序列。具體地，可以通過(guò)常規(guī)技術(shù)，例如農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將前述構(gòu)建體引入到水稻的細(xì)胞、組織或器官中，以便得到可以后續(xù)用于研究、雜交的樣本。因而，本發(fā)明提出了一種水稻細(xì)胞、組織或器官。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該水稻細(xì)胞、組織或器官中含有前面所述的構(gòu)建體。
[0026]在本發(fā)明的第六方面，本發(fā)明提出了一種構(gòu)建植物雄性不育系和保持系的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括:將前面所述的構(gòu)建體引入到第一植物純合隱性雄性不育植株中，以便獲得攜帶外源基因的第二植株，所述第二水稻植株能夠產(chǎn)生可育雄性配子，通過(guò)自交結(jié)實(shí)，可分離得到外源基因純合的轉(zhuǎn)基因種子，并進(jìn)一步培育成為植株與不育系授粉雜交，使不育系恢復(fù)結(jié)實(shí)，得到的種子遺傳背景與第二植株相同(即純合隱性雄性不育基因位點(diǎn)，雜合外源基因位點(diǎn))，使該第二植株得到擴(kuò)繁，從而構(gòu)建為穩(wěn)定的保持系；將所述第二植株或由第二植株擴(kuò)繁后得到的保持系(即純合隱性雄性不育基因位點(diǎn)，雜合外源基因位點(diǎn))與不育系授粉雜交，使不育系植株恢復(fù)結(jié)實(shí)，產(chǎn)生一半的不攜帶外源基因的種子，從而構(gòu)建植物雄性不育系。進(jìn)一步，所構(gòu)建的保持系可以產(chǎn)生等量的攜帶外源基因的花粉和不攜帶外源基因的花粉，與不育系授粉雜交后，使不育系植株恢復(fù)結(jié)實(shí)，獲得兩類分別攜帶和不攜帶外源基因的種子。其中，攜帶外源基因的種子作為保持系，可以與不育系雜交源源不斷地繼續(xù)生產(chǎn)不育系和保持系，而不攜帶外源基因的植株可以作為不育系用作雜交的親本。
[0027]在本發(fā)明的第七方面，具體地，本發(fā)明提出了一種構(gòu)建水稻雄性不育系和保持系的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括:將前面所述的構(gòu)建體引入到第一水稻純合隱性雄性不育植株中，以便獲得攜帶外源基因的第二水稻植株，所述第二水稻植株能夠產(chǎn)生可育雄性配子，通過(guò)自交結(jié)實(shí)，可分離得到外源基因純合的轉(zhuǎn)基因種子，并進(jìn)一步培育成為植株與不育系雜交，使不育系恢復(fù)結(jié)實(shí)，得到的種子遺傳背景與第二植株相同(即純合隱性雄性不育基因位點(diǎn)，雜合外源基因位點(diǎn))，使該第二水稻植株得到擴(kuò)繁，從而構(gòu)建為穩(wěn)定的保持系；將所述第二水稻植株或由第二水稻植株擴(kuò)繁后得到的保持系(即純合隱性雄性不育基因位點(diǎn)，雜合外源基因位點(diǎn))與不育系授粉雜交，使不育系植株恢復(fù)結(jié)實(shí)，產(chǎn)生一半的不攜帶外源基因的種子，從而構(gòu)建水稻雄性不育系。進(jìn)一步，所構(gòu)建的保持系可以產(chǎn)生等量的攜帶外源基因的花粉和不攜帶外源基因的花粉，與不育系授粉雜交后，使不育系植株恢復(fù)結(jié)實(shí)，獲得兩類分別攜帶和不攜帶外源基因的種子。其中，攜帶外源基因的種子作為保持系，可以與不育系雜交源源不斷地繼續(xù)生產(chǎn)不育系和保持系，而不攜帶外源基因的植株可以作為不育系用作雜交的親本。由此，可以有效地用于水稻雜交。
[0028]在本發(fā)明的第八方面，本發(fā)明提出了一種恢復(fù)水稻不育植株雄性育性的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括:將前面所述的構(gòu)建體引入到水稻純合隱性雄性不育植株中。
[0029]在本發(fā)明的第九方面，本發(fā)明提出了一種制備水稻種子的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括以下步驟:將前面所述的構(gòu)建體引入到水稻植株中；以及將所述水稻植株自交，可分離得到外源基因純合的轉(zhuǎn)基因種子，并進(jìn)一步培育成為植株與與不育系雜交，以獲得含有前面所述的構(gòu)建體的種子。
[0030]在本發(fā)明的第十方面，本發(fā)明提出了一種水稻轉(zhuǎn)化材料。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該水稻轉(zhuǎn)化材料的基因組中包含選自SEQ ID NO:3和9至少一種DNA序列。由此，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明提出了一種植物材料，其中，所述植物材料的基因組中包含了選自SEQID NO:3和9的至少一種DNA序列或其互補(bǔ)序列。并且本發(fā)明提出了由該植物衍生得到的種子、細(xì)胞和組織。
[0031]在本發(fā)明的第十一方面，本發(fā)明提出了一種用于制備雜交水稻的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法采用新型水稻雄性不育系和保持系，該新型水稻雄性不育系和保持系是通過(guò)前面構(gòu)建水稻雄性不育系和保持系的方法構(gòu)建的。 [0032]在本發(fā)明的第十二方面，本發(fā)明提出了水稻雄性不育系在制備雜交水稻中的用途。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述水稻雄性不育系是通過(guò)前面構(gòu)建水稻雄性不育系的方法構(gòu)建的。
[0033]在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提出了一種構(gòu)建水稻雄性不育系的方法，其是利用分子標(biāo)記和雜交創(chuàng)制新型水稻不育系。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括:采用水稻ms26/ms26雄性不育植株作為母本，所述水稻純合隱性雄性不育植株包含Ms26基因的純合隱性等位基因；將所述母本與輪回親本進(jìn)行回交轉(zhuǎn)育，以便獲得具有所述輪回親本性狀的水稻雄性不育系，其中，所述輪回親本不具有Ms26基因的純合隱性等位基因。由此，利用本發(fā)明的方法，可以在ms26純合隱性雄性水稻不育系的基礎(chǔ)上，開發(fā)更多的不同遺傳背景的不育系。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用常規(guī)回交育種方法，所有不同類型的水稻都可以創(chuàng)制成相應(yīng)的不育系，使雜種優(yōu)勢(shì)資源利用率達(dá)到95%以上。
[0034]本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過(guò)本發(fā)明的實(shí)踐了解到。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0035]本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對(duì)實(shí)施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:
[0036]圖1為根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的植物表達(dá)載體pZNl的結(jié)構(gòu)示意圖，其中，自右邊界(RB)到左邊界(LB)，依次包含了 0sCYP704B2基因表達(dá)框，35S增強(qiáng)子::Ltp2啟動(dòng)子::紅色熒光蛋白基因(RFP): ιΡΙΝΙΙ終止子表達(dá)框；
[0037]圖2為根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的植物表達(dá)載體pZNl的構(gòu)建示意圖；
[0038]圖3顯示了 根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例，水稻核隱性不育ms26 / ms26突變體為遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料，通過(guò)轉(zhuǎn)化圖1和圖2的構(gòu)建體所得到的轉(zhuǎn)化體通過(guò)自交結(jié)實(shí)，可分離得到外源基因純合的轉(zhuǎn)基因種子(圖3-1 )，并進(jìn)一步培育成為植株與不育系授粉雜交擴(kuò)繁(圖3-2)，得到外源基因雜合的轉(zhuǎn)基因種子培育成植株后進(jìn)一步與不育系雜交，使不育系恢復(fù)結(jié)實(shí)得到不育系和保持系的示意圖(圖3-3)；
[0039]圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的保持系與不育系授粉雜交后，不育系植株結(jié)實(shí)產(chǎn)生的突光種子和非突光種子的結(jié)果；
[0040]圖5顯示根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例，通過(guò)分子標(biāo)記輔助篩選(MAS)的方法來(lái)通過(guò)回交轉(zhuǎn)育構(gòu)建不育系的流程示意圖。
[0041]圖6顯示在載體的熒光基因的啟動(dòng)子前增加了 35S增強(qiáng)子(35S enhancer)后，該載體產(chǎn)生的種子的熒光強(qiáng)度都要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于不增加35S增強(qiáng)子序列的其他載體的轉(zhuǎn)基因種子，其中LTP2為啟動(dòng)子，RFP為紅色熒光蛋白基因。
[0042]發(fā)明詳細(xì)描述
[0043]下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。下面通過(guò)參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0044]本文提到的所有參考文獻(xiàn)都通過(guò)引用并入本文。
[0045]除非有相反指明，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。除非有相反指明，本文所使用的或提到的技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。材料、方法和例子僅作闡述用，而非加以限制。
[0046]術(shù)語(yǔ)“第一”、“第二”僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相對(duì)重要性或者隱含指明所指示的技術(shù)特征的數(shù)量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隱含地包括一個(gè)或者更多個(gè)該特征。在本發(fā)明的描述中，“多個(gè)”的含義是兩個(gè)或兩個(gè)以上，除非另有明確具體的限定。
[0047]本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的:發(fā)明人以水稻純合核隱性不育突變體為遺傳轉(zhuǎn)化受體材料，通過(guò)將緊密連鎖的2個(gè)目標(biāo)基因轉(zhuǎn)化至不育系，其中，育性恢復(fù)基因可使轉(zhuǎn)化受體及保持系育性恢復(fù)，篩選基因可以用于保持系與不育系雜交后，不育系植株結(jié)實(shí)的轉(zhuǎn)基因種子和非轉(zhuǎn)基因種子的分揀，分揀出的非轉(zhuǎn)基因種子用作不育系生產(chǎn)雜交種，轉(zhuǎn)基因種子用作保持系與不育系授粉雜交來(lái)源源不斷地、穩(wěn)定地生產(chǎn)不育系和保持系。例如，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，可以以水稻純合核隱性不育ms26 / ms26突變體為轉(zhuǎn)化受體材料，將緊密連鎖的2個(gè)目標(biāo)基因轉(zhuǎn)化至不育系:育性恢復(fù)基因0sCYP704B2 (Ms26)可使轉(zhuǎn)化受體及保持系育性恢復(fù)，熒光色選基因用于保持系與不育系雜交后，不育系結(jié)實(shí)中的轉(zhuǎn)基因種子和非轉(zhuǎn)基因種子的分揀，分揀出的非轉(zhuǎn)基因種子用作不育系生產(chǎn)雜交種，轉(zhuǎn)基因種子用作保持系與不育系雜交來(lái)源源不斷地、穩(wěn)定地生產(chǎn)不育系和保持系。該技術(shù)利用生物技術(shù)生產(chǎn)非轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，解決了水稻雜交制種過(guò)程中面臨的瓶頸問(wèn)題，即三系法資源利用率低而兩系法中不育系育性不穩(wěn)定的問(wèn)題。
[0048]由此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，本發(fā)明提出了一種構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該構(gòu)建體包括:第一表達(dá)盒，所述第一表達(dá)盒含有第一核酸分子，所述第一核酸分子編碼水稻雄性不育恢復(fù)基因；以及第二表達(dá)盒，所述第二表達(dá)盒含有第二核酸分子，所述第二核酸分子編碼篩選基因。利用該構(gòu)建體，能夠有效地將水稻雄性不育恢復(fù)基因和篩選基因引入到水稻植株例如水稻純合隱性雄性不育植株中，從而得到攜帶外源基因的可育株經(jīng)過(guò)自交結(jié)實(shí)，分離出外源基因純合的種子培育成植株后，與不育系授粉雜交擴(kuò)繁后使不育系結(jié)實(shí)而收獲的種子，可以作為保持系，不攜帶外源基因的不育系種子及其植株可以用作雜交之中的親本。由此，可以有效地用于水稻雜交。
[0049]在本文中，構(gòu)建體的形式不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的具體示例，其可以為質(zhì)粒、噬菌體、人工染色體、粘粒(Cosmid)、病毒的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，構(gòu)建體(有時(shí)也稱為表達(dá)載體、遺傳載體`或載體)呈質(zhì)粒的形式。質(zhì)粒作為遺傳載體，具有操作簡(jiǎn)單，可以攜帶較大片段的性質(zhì)，便于操作和處理。質(zhì)粒的形式也不受特別限制，既可以是環(huán)形質(zhì)粒，也可以是線性質(zhì)粒，即可以是單鏈的，也可以是雙鏈的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要進(jìn)行選擇。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以采用Ti載體，例如可以采用將第一和第二表達(dá)盒設(shè)置在表達(dá)載體PZNl的T-DNA之左右邊界之間。由此，可以通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法將第一和第二表達(dá)盒轉(zhuǎn)化至受體植株，例如水稻ms26/ms26隱性核雄性不育突變體中，由此，可以獲得不含除草劑抗性標(biāo)記基因和抗生素抗性標(biāo)記基因的水稻轉(zhuǎn)基因株系，經(jīng)過(guò)自交結(jié)實(shí)，并按照本發(fā)明的方法進(jìn)一步擴(kuò)繁后獲得穩(wěn)定的保持系，如此獲得的保持系有如下特點(diǎn):(I)保持系產(chǎn)生兩類花粉，一半花粉不含外源基因，一半含有外源基因；(2)保持系與不育系雜交，不育系可結(jié)實(shí)，所結(jié)可育種子與不育種子的比例為1:1，可育株(帶有外源基因)用作保持系，可以通過(guò)與不育系雜交方便地、源源不斷地生產(chǎn)不育系和保持系，不育株(不含轉(zhuǎn)基因成分)在生產(chǎn)上用作雜交制種的親本；(3)因?yàn)椴挥瓴缓D(zhuǎn)基因，因此用其生產(chǎn)的雜交種子不含轉(zhuǎn)基因，用此雜交種生產(chǎn)的水稻商品糧食更不含轉(zhuǎn)基因，從而消除了轉(zhuǎn)基因生物安全的隱患。該新型雜交育種體系充分利用水稻雜種優(yōu)勢(shì)，提供了切實(shí)可行的技術(shù)新突破。
[0050]在本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)“核酸”可以是任何包含脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于經(jīng)過(guò)修飾的或者未經(jīng)修飾的DNA、RNA，其長(zhǎng)度不受任何特別限制。對(duì)于用于構(gòu)建重組細(xì)胞的載體，優(yōu)選核酸為DNA，因?yàn)镈NA相對(duì)于RNA而言，其更穩(wěn)定，并且易于操作。
[0051]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，水稻雄性不育恢復(fù)基因的類型并不受特別限制，可以采用但不限于Ms26，Ms22，Ms45，Msl，等等。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述水稻雄性不育恢復(fù)基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，其編碼具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。即，可以采用的水稻雄性不育恢復(fù)基因?yàn)?sCYP704B2(Ms26)，由此，可以將其作為水稻受體ms26/ms26純合突變體(完全雄性不育)的野生型育性恢復(fù)基因。0sCYP704B2基因編碼的蛋白屬于細(xì)胞色素P-450家族，在花藥發(fā)育的P8到PlO階段的絨粘層和小孢子中特異表達(dá)。該基因突變后會(huì)導(dǎo)致絨粘層膨脹，花粉外壁殘缺而發(fā)育終止及花藥角質(zhì)層終止發(fā)育，從而導(dǎo)致植株雄性不育，而雌性育性正常。進(jìn)一步的化學(xué)成分分析發(fā)現(xiàn)，在該基因缺失突變體的花藥中，幾乎檢測(cè)不到角質(zhì)單體，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)該基因的功能是催化產(chǎn)生含有16和18個(gè)碳鏈的羥基脂肪酸。
[0052]根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述水稻雄性不育恢復(fù)基因0sCYP704B2 (Ms26)具有如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。與野生型的0sCYP704B2(Ms26)基因相比，SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列分別引入了三個(gè)單核苷酸突變，但不改變其編碼的氨基酸序列，這三個(gè)單核苷酸突變?cè)?sCYP704B2基因編碼區(qū)上的位置及具體突變分別為:238位核苷酸A突變?yōu)镃 ；240位的核苷酸G突變?yōu)镃 ；243位的核苷酸G突變?yōu)镃。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用該SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列能夠便于在各種分子鑒定中區(qū)別外源基因與內(nèi)源基因，并且能夠更有效地使水稻mS26/mS26不育受體植株的育性得到恢復(fù)。水稻受體ms26/ms26純合突變體是經(jīng)過(guò)輻射誘導(dǎo)所得，突變是由3103bp缺失(包含0sCYP704B2大部分片段)導(dǎo)致(缺失區(qū)段物理位置:ensembl plants oryza japonica groupversion64.6 (MSU6) chromosome3:3, 701, 319-3，704, 421)。大片段缺失突變使回復(fù)突變的概率極低，因此不育性狀穩(wěn)定，從而保障了不育系的穩(wěn)定性，降低雜交制種風(fēng)險(xiǎn)。
[0053]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述第一表達(dá)盒還可以進(jìn)一步包括:第一啟動(dòng)子，所述第一啟動(dòng)子與所述第一核酸分子可操作地相連，所述第一啟動(dòng)子為雄配子特異性啟動(dòng)子；以及第一終止子，所述第一終止子與所述第一核酸分子可操作地相連。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，第一啟動(dòng)子和第一終止子的類型并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，對(duì)于0sCYP704B2 (Ms26)基因，可以采用0sCYP704B2的內(nèi)源啟動(dòng)子、ORF區(qū)或基因組序列及終止區(qū)的序列，均為野生型水稻基因組序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述第一啟動(dòng)子具有如SEQ ID NO: 11所示的核苷酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述第一終止子具有如SEQID NO: 12所示的核苷酸序列。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用該啟動(dòng)子和終止子的組合，能夠進(jìn)一步顯著地提高表達(dá)相應(yīng)蛋白的效率，進(jìn)而能夠提高利用構(gòu)建體構(gòu)建保持系和不育系的效率，并且能夠更有效地使水稻mS26/mS26不育受體植株的育性得到恢復(fù)。
[0054]另外，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，構(gòu)建體還可以進(jìn)一步包括:第二表達(dá)盒，所述第二表達(dá)盒包含第二核酸分子， 所述第二核酸分子編碼篩選基因，所述篩選基因?yàn)榘l(fā)光基因。由此，便于通過(guò)篩選基因的表達(dá)來(lái)確定植物及其部分是否含有構(gòu)建體所引入的基因。[0055]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以采用選自紅色熒光基因、青色熒光蛋白基因、黃色熒光蛋白基因、熒光素酶基因、綠色熒光蛋白基因、花青甙Pi基因和草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶編碼基因的至少一種作為篩選基因，但不限于這些可以作為篩選的基因。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，可以采用紅色熒光蛋白作為篩選基因。紅色熒光蛋白基因(RFP)，來(lái)源于礁珊瑚(Discosoma sp.),是表達(dá)框內(nèi)唯一非糧食作物來(lái)源的基因序列。紅色突光蛋白最大吸收波長(zhǎng)為558nm,最大發(fā)射波長(zhǎng)為583nm。將RFP編碼的氨基酸序列通過(guò)與過(guò)敏原及毒蛋白序列比對(duì)顯示，相似性極低，無(wú)毒性及致敏性。RFP常用作遺傳轉(zhuǎn)化的篩選基因，從未發(fā)生過(guò)轉(zhuǎn)基因生物安全事題。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述篩選基因RFP具有如SEQ ID N0:3所述的核苷酸序列。SEQ ID NO:3所述的核苷酸序列與野生型RFP基因(其核苷酸序列如SEQID NO:4所示)相比，具有兩個(gè)單核苷酸突變，命名為RFP (r)。這兩個(gè)單核苷酸突變分別為:由第21位堿基C轉(zhuǎn)換為G、由第315位堿基G轉(zhuǎn)換為C。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)位點(diǎn)的突變可以更加有效地表達(dá)紅色熒光蛋白，增強(qiáng)紅色熒光蛋白基因在水稻中的表達(dá)。
[0056]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述第二表達(dá)盒進(jìn)一步包括:第二啟動(dòng)子，所述第二啟動(dòng)子與所述第二核酸分子可操作地相連，所述第二啟動(dòng)子為愈傷組織和/或種子、種皮、胚和胚乳等特異性的啟動(dòng)子；第二終止子，所述第二終止子與所述第二核酸分子可操作地相連。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述第二啟動(dòng)子具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述第二終止子具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。由此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，RFP(r)的開放讀碼框連接于來(lái)自玉米且為愈傷組織和種子(種皮)特異性啟動(dòng)子LTP2和來(lái)自馬鈴薯的終止子PIN II之間，在LTP2啟動(dòng)子前還有一個(gè)來(lái)自煙草花葉病毒的35S增強(qiáng)子序列，重組成RFP(r)基因表達(dá)盒(35Senhancer::LTP2::RFP(r):: PINII)。含有該表達(dá)框的水稻愈傷及種子在熒光激發(fā)下呈現(xiàn)非常容易辨認(rèn)的紅色，因此該表達(dá)框在本發(fā)明中用于遺傳轉(zhuǎn)化的篩選標(biāo)記和用于辨認(rèn)和分選保持系和不育系種子。
[0057]由此，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以利用根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的構(gòu)建體，以純合隱性核雄性不育水稻(mS26/mS26)作為轉(zhuǎn)化的受體，進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，得到整合含有以下緊密連鎖的兩個(gè)外源基因RFP (r)和`Ms26 (0sCYP704B2育性基因)的水稻植株，進(jìn)一步經(jīng)過(guò)自交結(jié)實(shí)、擴(kuò)繁后獲得保持系。外源基因的插入與內(nèi)源純合隱性核雄性不育位點(diǎn)(mS26/mS26)是非連鎖的，因此得到的轉(zhuǎn)基因水稻保持系含有獨(dú)立的純合的mS26/mS26隱性不育位點(diǎn)及雜合的外源基因(包括RFP (r)和0sCYP704B2基因)整合位點(diǎn)。
[0058]由此，可以通過(guò)常規(guī)技術(shù)，例如農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將前述構(gòu)建體引入到水稻的細(xì)胞、組織或器官中，以便得到可以后續(xù)用于研究、雜交的樣本。因而，在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種水稻細(xì)胞、組織或器官。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該水稻細(xì)胞、組織或器官中含有前面所述的構(gòu)建體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述水稻細(xì)胞、組織或器官來(lái)自水稻純合隱性雄性不育植株。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述水稻純合隱性雄性不育植株包含Ms26基因的純合隱性等位基因。由此，本發(fā)明的水稻細(xì)胞、組織或器官，可以有效地用于構(gòu)建保持株并進(jìn)一步與不育株雜交。前面關(guān)于構(gòu)建體所描述的特征和優(yōu)點(diǎn)，也適用于該水稻細(xì)胞、組織或器官，不再贅述。
[0059]由此，在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了一種構(gòu)建水稻保持系并進(jìn)一步生產(chǎn)雄性不育系的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，參考圖3，該方法包括:[0060]第一步:將前面所述的構(gòu)建體引入到第一水稻純合隱性雄性不育植株中，以便獲得攜帶外源目的基因的第二水稻植株，所述第二水稻植株能夠產(chǎn)生可育雄性配子，并且第二水稻植株中的外源目的基因處于雜合狀態(tài)；
[0061]第二步，進(jìn)而培育所得到的第二水稻植株，使其自交后結(jié)實(shí)，可以獲得25%的種子為ms26/ms26純合隱性和外源目的基因純合背景和50%的種子為ms26/ms26純合隱性和外源目的基因雜合背景(即為保持系種子)，種子發(fā)芽后，通過(guò)基因組PCR及定量PCR可以將此兩類種子鑒定出來(lái)；
[0062]第三步，培育第二步得到的25%的mS26/mS26純合隱性和外源目的基因純合背景的種子為植株，自交擴(kuò)繁，所結(jié)實(shí)的種子全部為mS26/mS26純合隱性和外源目的基因純合
背景 ；
[0063]第四步，培育第三步得到的種子為植株，該植株產(chǎn)生的全部花粉都含有外源目的基因，通過(guò)為純合隱性雄性不育系植株授粉雜交，可以使不育系恢復(fù)結(jié)實(shí)，所得到的種子全部為mS26/mS26純合隱性和外源目的基因雜合背景，即為保持系種子；通過(guò)第三步和第四步使得保持系種子得到擴(kuò)繁；
[0064]第五步，培育第四步的保持系種子為植株(背景為mS26/mS26純合隱性突變位點(diǎn)和外源目的基因雜合)，也可以培育第二步得到的50%的背景為mS26/mS26純合隱性和外源目的基因雜合的種子(保持系)為植株，保持系植株產(chǎn)生的花粉一半含有外源目的基因，一半不含外源目的基因，與純合隱性雄性不育系植株授粉雜交后，雄性不育系植株恢復(fù)結(jié)實(shí)，并產(chǎn)生兩類種子，其中一半含有外源目的基因?yàn)榧t色熒光種子(背景為mS26/mS26純合隱性突變位點(diǎn)和外源目的基因雜合)，可以進(jìn)一步作為保持系與不育系授粉雜交生產(chǎn)不育系及保持系種子，另一半不含有外源目的基因?yàn)榉菬晒庹７N子(背景為mS26/mS26純合隱性突變位點(diǎn)和不含有外源目的基因成分)，可以進(jìn)一步作為不育系進(jìn)行雜交育種。兩類種子根據(jù)其有無(wú)熒光可以方便地通過(guò)色選儀檢測(cè)并分選出來(lái)。
[0065]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，第一水稻純合隱性雄性不育植株包含Ms26基因的純合隱性等位基因。另外，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以通過(guò)熒光檢測(cè)進(jìn)行種子分揀，即通過(guò)檢測(cè)水稻種子是否攜帶發(fā)光基因，例如是否發(fā)出熒光來(lái)進(jìn)行分揀，區(qū)分其是否攜帶外源基因，如圖4所示。前面關(guān)于構(gòu)建體所描述的特征和優(yōu)點(diǎn)，也適用于該方法，不再贅述。
[0066]在本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提出了一種恢復(fù)水稻不育植株雄性育性的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括:將前面所述的構(gòu)建體引入到水稻純合隱性雄性不育植株中。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述水稻純合隱性雄性不育植株包含Ms26基因的純合隱性等位基因。前面關(guān)于構(gòu)建體所描述的特征和優(yōu)點(diǎn)，也適用于該方法，不再贅述。
[0067]在本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提出了一種制備水稻種子的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括以下步驟:將前面所述的構(gòu)建體引入到水稻植株中，進(jìn)一步自交結(jié)實(shí)、再經(jīng)過(guò)擴(kuò)繁為保持系；將所述水稻保持系與不育系授粉雜交，以在不育系植株上獲得兩類種子，即含有前面所述的構(gòu)建體的保持系種子和不含前述構(gòu)建體的不育系種子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述水稻植株為水稻純合隱性雄性不育植株。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述水稻純合隱性雄性不育植株包含Ms26基因的純合隱性等位基因。
[0068]在本發(fā)明的第六方面，本發(fā)明提出了一種遺傳轉(zhuǎn)化材料。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述遺傳轉(zhuǎn)化材料是通過(guò)將前面所述的構(gòu)建體引入到水稻純合隱性雄性不育植株中獲得的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述水稻純合隱性雄性不育植株包含Ms26基因的純合隱性等位基因。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法引入所述構(gòu)建體。
[0069]在本發(fā)明的第七方面，本發(fā)明提出了一種用于制備雜交水稻的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述水稻雄性不育系是通過(guò)前面構(gòu)建水稻雄性不育系的方法構(gòu)建的。該方法采用水稻雄性不育系，可以進(jìn)一步進(jìn)行水稻雜交，提高水稻雜交的效率。前面關(guān)于構(gòu)建體所描述的特征和優(yōu)點(diǎn)，也適用于該方法，不再贅述。
[0070]在本發(fā)明的第八方面，本發(fā)明提出了水稻雄性不育系在制備雜交水稻中的用途。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述水稻雄性不育系是通過(guò)前面構(gòu)建水稻雄性不育系的方法構(gòu)建的。由此，可以進(jìn)一步利用本發(fā)明的水稻雄性不育系進(jìn)行水稻雜交，提高水稻雜交的效率。前面關(guān)于構(gòu)建體所描述的特征和優(yōu)點(diǎn)，也適用于該用途，不再贅述。
[0071]在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提出了一種構(gòu)建水稻雄性不育系的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括采用水稻純合隱性雄性不育植株作為母本，所述水稻純合隱性雄性不育植株包含ms26基因的純合隱性等位基因；將母本與輪回親本進(jìn)行回交轉(zhuǎn)育，以便獲得具有所述輪回親本性狀的水稻雄性不育系，其中，所述輪回親本不具有Ms26基因的純合隱性等位基因。由此，利用本發(fā)明的方法，可以在ms26純合隱性雄性水稻不育系的基礎(chǔ)上，發(fā)展更多的不同遺傳背景的不育系。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用常規(guī)回交育種方法，所有不同類型的水稻都可以創(chuàng)制成相應(yīng)的不育系(即可以源源不斷地生產(chǎn)相應(yīng)的不育系品種)，使雜種優(yōu)勢(shì)資源利用達(dá)到95%以上。
[0072]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以作為輪回親本的品系不受特別限制，根據(jù)具體的實(shí)施例，輪回親本可以具有選自配合力強(qiáng)、株型好、抗病、抗蟲和高產(chǎn)的至少一種性狀。由此，可以獲得具有這些性狀的雄性水稻不育系。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，輪回親本可以為選自天豐、華 268、華恢 624、華 211、華恢 3411、華恢 451、華恢 2855、R608、華恢 374、華恢 3501、H451、R608、華占、黃華占、H268、H819、滬閩粳等的至少一種。
[0073]根據(jù)本發(fā)明的具`體實(shí)施例，參考圖5，可以通過(guò)分子輔助篩選(MAS)的方法來(lái)通過(guò)回交轉(zhuǎn)育構(gòu)建不育系。具體地，如圖5所示，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，將所述母本與輪回親本進(jìn)行至少3次回交。另外，在進(jìn)行回交的過(guò)程中，可以通過(guò)分子標(biāo)記輔助進(jìn)行前景選擇和背景選擇。
[0074]進(jìn)一步，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述構(gòu)建水稻雄性不育系的方法可以包括下列步驟:
[0075]首先，將ms26/ms26突變體(MS26純合隱性雄性水稻不育系)與輪回親本進(jìn)行雜交，得到雜交Fl ；
[0076]接下來(lái)，將Fl與輪回親本進(jìn)行回交，得到BClFl ；
[0077]接下來(lái)，將BClFl與輪回親本進(jìn)行回交，得到BC2F1 ；
[0078]接著，將BC2F1進(jìn)行自交，得到BC2F2 ；
[0079]接著，將BC2F2與輪回親本進(jìn)行回交，以便得到BC3F1 ；
[0080]最后，將BC3F1進(jìn)行自交，得到新構(gòu)建的不育系BC3F2。
[0081]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以通過(guò)分子標(biāo)記對(duì)回交和自交產(chǎn)物進(jìn)行前景(ms26和外源基因)選擇和背景選擇(輪回親本)，以加速新型不育系的創(chuàng)制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，用于回交轉(zhuǎn)育的水稻純合隱性雄性不育植株可以是通過(guò)前面所述的構(gòu)建不育系的方法構(gòu)建獲得的。前面關(guān)于構(gòu)建體所描述的特征和優(yōu)點(diǎn)，也適用于該方法，不再贅述。
[0082]需要說(shuō)明的是，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的構(gòu)建體及其用途是本申請(qǐng)的發(fā)明人經(jīng)過(guò)艱苦的創(chuàng)造性勞動(dòng)和優(yōu)化工作才完成的?！揪唧w實(shí)施方式】述中，除非另有說(shuō)明，“多個(gè)”的含義是兩個(gè)或兩個(gè)以上。
[0083]下面根據(jù)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明。需要說(shuō)明的是，這些實(shí)施例僅僅是為了說(shuō)明本發(fā)明，而不能以任何方式解釋為對(duì)本發(fā)明的限制。另外，除非特別說(shuō)明，在下面的實(shí)施例中所涉及的方法為常規(guī)方法，所涉及的材料和制劑也為市售可得的。
具體實(shí)施例
[0084]若未特別指明，實(shí)施例中所采用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，可以參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版或者相關(guān)產(chǎn)品進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0085]實(shí)施例1:水稻育性調(diào)控載體構(gòu)建
[0086]通過(guò)裝配下述DNA元件，構(gòu)建圖1所示的被稱為pZNl的表達(dá)載體:
[0087]第一步:人工合成LTP2::RFP::PINII序列，其DNA序列如SEQ ID N0:1所示。PCR擴(kuò)增人工合成的Pin I1-RFP(2SNP)-ltp2序列，擴(kuò)增引物為:
[0088]Fi:ctt Igccggc丨 cgcattcgcaaaacacacctagac ；方框內(nèi)為限制性內(nèi)切酶 Nae I 酶切位點(diǎn)； [0089]Rl: CAA |GTTTAAAC| ATTGCAGTAC jGGCGCGC^ AACCGTCTCTTCGTGAGAATAACCG，方框內(nèi)分別為Pme I和Asc I酶切位點(diǎn).[0090]擴(kuò)增得Pin I1-RFP (2SNP)-ltp2 片段(SEQ ID NO:1)連 T 測(cè)序正確后，用 Nae I和 Pme I
[0091]雙酶切連入Xmn I與Pme I酶切的pCAMBIA1300質(zhì)粒，鑒定正確即得中間載體1.[0092]第二步:從水稻基因組DNA中，分別擴(kuò)增cypl和cyp2，cypl的擴(kuò)增引物為:
[0093]F2:TAT ^GCGCGCC] GATTGGTCGAACACGAGGTAGGCG,方框內(nèi)為 Asc I 酶切位點(diǎn);
[0094]R2: TCGAAGGACCGCACCGTGACC |GTCGAC| ATG，方框內(nèi)為 Sal I 酶切位點(diǎn)，陰影堿基
為為了區(qū)分水稻內(nèi)源CYP序列同時(shí)使用水稻使用頻率高的密碼子而特意引入的三個(gè)SNP)，
[0095]cyp2擴(kuò)增引物為:
[0096]F3: CAT '|GTCGAC[ GGTCACGGTGCGGTCCTTCGA，方框內(nèi)為 Sal I 酶切位點(diǎn)，陰影堿基為為了區(qū)分水稻內(nèi)源CYP序列同時(shí)使用水稻使用頻率高的密碼子而特意引入的三個(gè)SNP;
[0097]R3: ATA j3TTTAAAC| AGGTGGAAGACAAGGTGGTGAGGAT，方框內(nèi)為 Pme I 酶切位點(diǎn))兩
個(gè)片段，連T-載體測(cè)序正確后，再分別用AscI，Sal I和Sal I7Pme I雙酶切，同時(shí)連入用Asc I，Pme I雙酶切的中間載體1，鑒定正確即得中間載體2。
[0098]第三步:PCR擴(kuò)增人工合成的35S增強(qiáng)子序列，擴(kuò)增引物為:
[0099]F4:TT Xi(,(.’(,UK.(’.ATCACATCAATCCACTTGCTTTGA，方框內(nèi)為 Asc I 酶切位點(diǎn);[0100]R4:GA ^GCGCGCC CGTCAACATGGTGGAGCACGACAC,方框內(nèi)為 Asc I 酶切位點(diǎn)，擴(kuò)
增得35S增強(qiáng)子片段連T測(cè)序正確后，用Asc I酶切后連入Asc I酶切開的中間載體2，鑒定正確即得載體PZN1。
[0101]實(shí)施例2:保持系的獲得、擴(kuò)繁及不育系的生產(chǎn)及原理
[0102]通過(guò)設(shè)計(jì)并驗(yàn)證，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建水稻保持系，并進(jìn)一步生產(chǎn)雄性不育系的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，參考圖3，該方法包括:
[0103]第一步:將實(shí)施例1所述的構(gòu)建體(含有育性恢復(fù)基因和色選基因表達(dá)框)通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化引入到水稻純合隱性雄性不育植株(mS26/mS26)中，獲得攜帶外源基因的TO代水稻植株能夠產(chǎn)生可育雄性配子，并且TO代轉(zhuǎn)基因植株的外源基因處于雜合狀態(tài)(圖3-1)；
[0104]第二步，培育第一步所得到的TO代轉(zhuǎn)基因植株，使其自交后結(jié)實(shí)，獲得的Tl代種子根據(jù)遺傳背景可分為三類，其中25%的種子為mS26/mS26純合隱性和外源基因純合背景，50%的種子為mS26/mS26純合隱性和外源基因雜合背景(可直接作為保持系，進(jìn)入以下第五步與不育系雜交)，還有25%的種子為ms/ms純合隱性雄性不育且不含有轉(zhuǎn)基因；通過(guò)種子熒光色選將不含有外源基因的25%的非熒光種子分離出來(lái)，并進(jìn)一步培育其它的75%的所有熒光種子發(fā)芽后，通過(guò)提取幼苗葉片的基因組DNA，進(jìn)行基因組PCR或Q-PCR技術(shù)可以將兩類含有外源基因成分的種子或幼苗分別鑒定出來(lái)(圖3-1)；
[0105]第三步，培育第二步中25%的ms26/ms26純合隱性和外源基因純合背景的Tl代種子或幼苗為Tl代植株，通過(guò)自交后結(jié)實(shí)的T2種子全部為mS26/mS26純合隱性和外源基因純合背景，為紅色熒光種子；
[0106]第四步，培育第三步中T2代種子為T2代植株，這些植株均為mS26/mS26純合隱性和外源基因純合背景，通過(guò)這`些植株為純合隱性雄性不育系植株授粉雜交，可以使不育系植株恢復(fù)正常結(jié)實(shí)，得到的種子全部為mS26/mS26純合隱性和外源基因雜合背景，為紅色熒光種子，即為保持系，由此通過(guò)第三步和第四步得以快速擴(kuò)繁保持系的種子(圖3-2)；
[0107]第五步，培育第四步的保持系種子為植株(背景為mS26/mS26純合隱性和外源基因雜合)，也可以同時(shí)培育第一步中產(chǎn)生的50%的背景為mS26/mS26純合隱性和外源基因雜合的保持系種子為植株，這些來(lái)源的保持系產(chǎn)生的花粉一半含有外源基因，另外一半不含外源基因，與純合隱性雄性不育系植株授粉雜交，使雄性不育系得以結(jié)實(shí)，產(chǎn)生的種子中一半即50%含有外源基因且為紅色熒光種子(背景為ms26/ms26純合隱性突變位點(diǎn)和外源基因雜合)，可以進(jìn)一步作為保持系；另一半50%不含有外源基因且為正常顏色的非熒光種子(背景為mS26/mS26純合隱性突變位點(diǎn)和不含有轉(zhuǎn)基因成分)，即為不育系。這兩類種子可以通過(guò)色選儀分選出來(lái)，含有熒光的種子作為保持系重復(fù)第四步的實(shí)驗(yàn)，可以繼續(xù)擴(kuò)繁得到等量保持系和不育系的種子，而不含外源轉(zhuǎn)基因的非熒光種子被作為不育系進(jìn)行雜交育種或制種(圖3-3) ο
[0108]實(shí)施例3:水稻轉(zhuǎn)化
[0109]利用熱激法將質(zhì)粒pZNl轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌AGLO菌株，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)水稻進(jìn)行共轉(zhuǎn)化，具體的轉(zhuǎn)化受體材料為水稻ms26/ms26完全雄性不育純合突變體，關(guān)于該材料的具體描述見中國(guó)專利CN200910309083.1 以及The Plant Cell Vol.22:173-190，2010年 I 月，該材料目前公眾是可以獲取的，通過(guò)將這兩篇文獻(xiàn)參照并入本文。通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程得到PZNl載體的水稻轉(zhuǎn)基因材料。[0110]需要說(shuō)明的是，也可以通過(guò)常規(guī)的基因敲除的方法，將水稻Ms26基因全部或部分敲除后，得到水稻ms26/ms26完全雄性不育純合突變體。
[0111]實(shí)施例4:T0代轉(zhuǎn)基因植株所結(jié)實(shí)的種子分離比分析
[0112]通過(guò)實(shí)施例3得到的TO代轉(zhuǎn)基因幼苗(背景為mS26/mS26純合隱性和外源基因雜合)，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室煉苗，同時(shí)通過(guò)提取幼苗葉片基因組DNA，并利用定量PCR初步鑒定轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)后，選擇外源基因?yàn)閱慰截惒迦氲闹仓?，移栽到大棚和田間進(jìn)行培育，與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓?野生型非轉(zhuǎn)基因水稻品種武運(yùn)粳7號(hào))進(jìn)行表型比較分析，二者之間沒有觀察到明顯的形態(tài)上的不同，且轉(zhuǎn)基因植株的雄性育性得到恢復(fù)。結(jié)實(shí)后分單株單穗收獲，隨機(jī)選取30個(gè)植株的分別30個(gè)單穗，分析了熒光種子與非熒光種子的分離比例，結(jié)果表明所有單穗的種子分離比均為熒光種子:非熒光種子=3:1，完全符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的預(yù)期。此外，發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，由于載體設(shè)計(jì)時(shí)，為了增強(qiáng)熒光在種子中的強(qiáng)度，在載體的熒光基因的啟動(dòng)子前增加了 35S增強(qiáng)子的序列，而該載體產(chǎn)生的種子的熒光強(qiáng)度都要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于不增加增強(qiáng)子序列的其他載體的轉(zhuǎn)基因種子。種子中更容易分辨的高表達(dá)熒光基因，將對(duì)種子的分揀的精確度起到?jīng)Q定性作用，這是該技術(shù)成功的關(guān)鍵之一(圖6)。
[0113]實(shí)施例5:保持系植株花粉育性檢測(cè)
[0114]通過(guò)實(shí)施例3得到的水稻轉(zhuǎn)基因材料，按照實(shí)施例2所描述的實(shí)驗(yàn)過(guò)程，得到了保持系(背景為ms26/ms26純合隱性突變位點(diǎn)和外源基因雜合)。對(duì)保持系植株和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓?野生型非轉(zhuǎn)基因水稻品種武運(yùn)粳7號(hào))進(jìn)行表型分析，二者之間沒有觀察到明顯的形態(tài)上的不同，且其雄性生育能力也基本相同。
[0115]例如，以轉(zhuǎn)化受體品系對(duì)應(yīng)的野生型非轉(zhuǎn)基因水稻品種武運(yùn)粳7號(hào)(可育，下面簡(jiǎn)稱為CKl)和轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因水稻品系武運(yùn)粳7號(hào)ms26突變體(不育，下面簡(jiǎn)稱為CK2)為對(duì)照，進(jìn)行花粉可染率檢測(cè)。
[0116]在水稻開花晚期，從轉(zhuǎn)基因水稻(保持系)、CKl及CK2小區(qū)各隨機(jī)抽取單株，各株取一朵花，每朵花取I個(gè)花藥，置于載玻片中央，滴加一滴1%的I2-1K溶液，用鑷子和解剖針釋放花粉后，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)可染色花粉數(shù)和花粉總數(shù)。在CKl正?？捎虲K2正常不育的前提下，分析轉(zhuǎn)基因水稻(保持系)的花粉可染率。結(jié)果顯示可育對(duì)照(CKl)的可育率在98.6%~100%之間；不育對(duì)照(CK2)可育率為O ;而多個(gè)隨即抽取的轉(zhuǎn)基因(保持系)植株中，花粉染色比例均與可育對(duì)照(CKl)相同，證明育性正常。即轉(zhuǎn)基因(保持系)株系由于在武運(yùn)粳7號(hào)mS26/mS26突變體中轉(zhuǎn)化了前述的構(gòu)建體，使得花粉育性從不育轉(zhuǎn)為正常。
[0117]實(shí)施例6:保持系與不育系授粉雜交后，不育系所產(chǎn)生熒光種子與非熒光種子分離比例
[0118]通過(guò)實(shí)施例3得到的水稻轉(zhuǎn)基因材 料，按照實(shí)施例2所描述的實(shí)驗(yàn)過(guò)程進(jìn)行田間試驗(yàn)后，得到了保持系(背景為mS26/mS26純合隱性突變位點(diǎn)和外源基因雜合)，與不育系進(jìn)行授粉雜交后，使得不育系植株恢復(fù)結(jié)實(shí)，對(duì)不育系植株上的熒光與非熒光種子的分離比例進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果顯示不育系植株上的熒光和非熒光種子的比例均為1:1 (圖4)，表明本發(fā)明中所提供的表達(dá)載體各元件(育性恢復(fù)基因和熒光色選基因)作為整體表達(dá)良好。即所構(gòu)建的保持系(熒光種子)可以產(chǎn)生等量的攜帶外源基因的花粉和不攜帶外源基因的花粉，與不育系授粉雜交后，使不育系植株恢復(fù)結(jié)實(shí)，獲得兩類分別攜帶和不攜帶外源基因的種子，其中，攜帶外源基因的熒光種子作為保持系，可以與不育系雜交源源不斷地繼續(xù)生產(chǎn)不育系和保持系，而不攜帶外源基因的非熒光正常種子培育的植株可以作為不育系用作雜交育種的親本。
[0119]表1:保持系與不育系植株授粉雜交后，不育系所結(jié)熒光種子與非熒光種子數(shù)比例
[0120]
【權(quán)利要求】
1.一種方法，用于創(chuàng)制植物保持系，其特征在于所述方法包括: a)提供第一植株，其為純合隱性核雄性不育的不育系； b)向第一植株中引入構(gòu)建體，所述構(gòu)建體含有第一核酸分子和第二核酸分子，其中所述第一核酸分子為育性恢復(fù)基因，第二核酸分子為篩選基因；和 c)獲得的含所述構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植株既為保持系。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的保持系可用于繁殖雄性不育系，所述方法包括:根據(jù)所述保持系所含外源構(gòu)建體的純合或雜合情況，分成兩種途徑進(jìn)行雄性不育系的繁殖: i)轉(zhuǎn)基因雜合的保持系，通過(guò)與權(quán)利要求1a中所述的第一植株雜交繁殖出穩(wěn)定分離的不育系和保持系； ii)轉(zhuǎn)基因純合的保持系，先與不育系雜交獲得轉(zhuǎn)基因雜合的保持系，再與不育系雜交繁殖出穩(wěn)定分離的不育系和保持系。
3.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述的第一核酸分子與第三核苷酸序列可操作地相連，所述第三核苷酸序列指導(dǎo)偏好于植物雄性細(xì)胞的表達(dá)。
4.權(quán)利要求1-3之任一所述的方法，其中所述的第二核酸分子與第四核苷酸序列可操作地相連，所述第四核苷酸序列指導(dǎo)偏好于愈傷組織和/或種子中的表達(dá)。
5.權(quán)利要求1或2 所述的方法，其中所述的第一植株為水稻雄性不育突變體植株。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的第一核酸分子為水稻雄性不育恢復(fù)基因。
7.權(quán)利要求5或6所述的方法，其中所述的水稻雄性不育突變體為水稻ms26基因的雄性不育突變體。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的水稻雄性不育恢復(fù)基因具有如SEQID N0:9所示的核苷酸序列。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其中所述的水稻雄性不育恢復(fù)基因編碼具有如SEQID NO:10所示的氨基酸序列。
10.權(quán)利要求1-9之任一所述的方法，其中所述的第二核酸分子選自紅色熒光基因、青色熒光蛋白基因、黃色熒光蛋白基因、熒光素酶基因、綠色熒光蛋白基因、花青苷Pl基因和草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶編碼基因構(gòu)成的組。
11.權(quán)利要求10所述的方法，其中所述的紅色熒光基因具有如SEQID NO:3所示的核苷酸序列。
12.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的紅色熒光基因編碼具有如SEQID NO:5所示的氨基酸序列。
13.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述的第一植株為油菜雄性不育突變體植株。
14.一種構(gòu)建體，其特征在于，包含:第一表達(dá)盒，所述第一表達(dá)盒含有第一核酸分子，所述第一核酸分子編碼植物雄性不育恢復(fù)基因；以及第二表達(dá)盒，所述第二表達(dá)盒含有第二核酸分子，所述第二核酸分子編碼篩選基因。
15.權(quán)利要求14所述的構(gòu)建體，其中所述的第一核酸分子與第三核苷酸序列可操作地相連，所述第三核苷酸序列指導(dǎo)偏好于植物雄性細(xì)胞的表達(dá)。
16.權(quán)利要求14或15所述的構(gòu)建體，其中所述的第二核酸分子與第四核苷酸序列可操作地相連，所述第四核苷酸序列指導(dǎo)偏好于愈傷組織和/或種子中的表達(dá)。
17.權(quán)利要求14所述的構(gòu)建體，其中所述的第一核酸分子為水稻雄性不育恢復(fù)基因。
18.權(quán)利要求14或17所述的構(gòu)建體，其中所述的水稻雄性不育突變體為ms26基因的雄性不育突變體。
19.權(quán)利要求18所述的構(gòu)建體，其中所述的水稻雄性不育恢復(fù)基因具有如SEQID NO:9所示的核苷酸序列。
20.權(quán)利要求19所述的構(gòu)建體，其中所述的水稻雄性不育恢復(fù)基因編碼具有如SEQIDNO: 10所示的氨基酸序列。
21.權(quán)利要求14-20之任一所述的構(gòu)建體，其中所述的第二核酸分子選自紅色熒光基因、青色熒光蛋白基因、黃色熒光蛋白基因、熒光素酶基因、綠色熒光蛋白基因、花青苷Pl基因和草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶編碼基因構(gòu)成的組。
22.權(quán)利要求21所述的構(gòu)建體，其中所述的紅色熒光基因具有如SEQID NO:3所示的核苷酸序列。
23.權(quán)利要求22所述的構(gòu)建體，其中所述的紅色熒光基因編碼具有如SEQID NO:5所示的氨基酸序列。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK103805630SQ201310548284
【公開日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2013年11月7日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月12日
【發(fā)明者】唐曉艷, 王海洋, 周君莉 申請(qǐng)人:未名興旺系統(tǒng)作物設(shè)計(jì)前沿實(shí)驗(yàn)室（北京）有限公司, 興旺投資有限公司