三倍體丹參脫毒新品種的快速選育方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種三倍體丹參脫毒新品種的快速選育方法。包括：取三倍體丹參莖尖或新生幼葉進(jìn)行脫毒處理后作為組織培養(yǎng)材料，接種在1/2MS培養(yǎng)基上，在20-25℃，光強(qiáng)度3000Lux，光周期14小時(shí)/天條件下進(jìn)行培養(yǎng)，待葉緣切割面分化出叢生芽；進(jìn)行分瓶擴(kuò)大繁殖，每瓶3-5棵苗；新根3-5公分時(shí)進(jìn)行瓶苗移栽，按常規(guī)三倍體丹參大田種植方法進(jìn)行田間栽培管理；測(cè)定丹參酮ⅡA、丹酚酸B和隱丹參酮含量；根據(jù)三倍體丹參脫毒新品種藥材產(chǎn)量和主要藥物有效成分含量測(cè)定結(jié)果確定三倍體丹參脫毒新品種的選育結(jié)果。本發(fā)明二年內(nèi)可選育出三倍體丹參脫毒新品種，解決了因生物及非生物脅迫而引起的丹參新品種退化問(wèn)題，理論上講，這種脫毒三倍體丹參優(yōu)勢(shì)可以保持?jǐn)?shù)百年。
【專利說(shuō)明】三倍體丹參脫毒新品種的快速選育方法
【技術(shù)領(lǐng)域】 [0001] 本發(fā)明涉及一種植物新品種的選育方法，特別是三倍體丹參脫毒新品種(系)的快速選育方法。
【背景技術(shù)】
[0002]丹參miltiorrhiza Bunge)是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥中應(yīng)用最早、最廣泛的中藥之一，是著名的活血化淤藥，在臨床上被廣泛用于治療冠心病、心絞痛、缺血性中風(fēng)等疾病。隨著我國(guó)人口老齡化，心血管疾病成為危害人類健康的主要疾病，發(fā)病率逐年上升，對(duì)藥物需求量增大。目前我國(guó)以丹參為原料生產(chǎn)的復(fù)方中藥有100多種，對(duì)優(yōu)質(zhì)丹參藥材的需求量巨大。自上世紀(jì)60~70年代，各地野生丹參轉(zhuǎn)變家種成功后，生產(chǎn)有了較大發(fā)展，1978年收購(gòu)4 000噸，銷售6500噸，2007年產(chǎn)量達(dá)23000~24000噸，已成為一種重要的栽培藥用植物。最近，中藥界普遍把丹參視為中藥的“模式中藥”，中國(guó)科學(xué)院藥用植物研究所還啟動(dòng)了丹參基因組測(cè)序工作，突顯了丹參作為傳統(tǒng)中藥研究的地位。然而，隨著栽培丹參的發(fā)展，凸顯我國(guó)丹參遺傳改良與新品種培育中的問(wèn)題，主要有:①與其它栽培作物相比栽培丹參尚處在起步階段，目前我國(guó)還沒(méi)有一個(gè)通過(guò)雜交選育出來(lái)的丹參新品種，現(xiàn)有栽培丹參都是由野生直接變家種來(lái)，野生、半野生、栽培丹參之間的遺傳相似系數(shù)在0.75~0.8之間，說(shuō)明我國(guó)栽培丹參中很少有變異的積累-人工選擇；②現(xiàn)在全國(guó)還沒(méi)有一個(gè)公認(rèn)的丹參主栽品種，只有四川從現(xiàn)有混雜的川丹參群體中經(jīng)過(guò)系統(tǒng)篩選分離純化出了大葉型(SA)和小葉型(SI)兩個(gè)品種。因此，我國(guó)丹參的遺傳改良與新品種培育勢(shì)在必行，尋找一條有效的丹參新品種培育方法已是當(dāng)務(wù)之急。近年來(lái)很多單位都已開展了有關(guān)丹參雜交育種及其相關(guān)的基礎(chǔ)研究。高山林(2006)最先培育了丹參四倍體新品種，丹參產(chǎn)量提高了 50%，有效化學(xué)成分提高了 50~80%。江蘇省從栽培品種混合種植的天然雜交當(dāng)代(Fl)中選出皺葉、單葉、小葉和原型4個(gè)品系新材料，正在擴(kuò)大種植。河南省從裕丹參變異群體中已選出5個(gè)變異類型。山東省在對(duì)丹參開花與繁育特性研究的基礎(chǔ)上，提出直接利用丹參的自然變異進(jìn)行系統(tǒng)育種是丹參初期最有效的育種方法。陜西省已篩選到丹參雄性不育系Sh-B的三個(gè)不育類型Sh-Bl、Sh-B2、Sh-B3。然而，至今尚未見(jiàn)丹參雜交育種取得突破性進(jìn)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明提供的是一種三倍體丹參脫毒新品種的快速培育方法，可以克服常規(guī)新品種選育周期長(zhǎng)，需要5-8年的缺陷。本發(fā)明選育周期只需2年。它是建立在本項(xiàng)發(fā)明人早先發(fā)明的“丹參三倍體培育方法”的基礎(chǔ)上，將產(chǎn)生變異的三倍體丹參或由于外界脅迫造成品種退化的三倍體丹參的體細(xì)胞作為外植體，采用組織培養(yǎng)快繁與脫毒技術(shù)相結(jié)合的方法，將其快速繁殖起來(lái)。不但第二年就可進(jìn)行新品種比較試驗(yàn)，而且經(jīng)過(guò)脫毒處理，恢復(fù)了三倍體丹參本來(lái)就存在的多倍體優(yōu)勢(shì)和雜種優(yōu)勢(shì)，三倍體丹參脫毒新品種表現(xiàn)生長(zhǎng)旺盛(圖5)，藥材產(chǎn)量和藥物有效成分都能獲得顯著提高。
[0004]本發(fā)明提供的是一種三倍體丹參脫毒新品種的選育方.法，包括以下步驟:以三倍體丹參莖尖或新生幼葉為外植體，先進(jìn)行脫毒處理，然后進(jìn)行組織培養(yǎng)快繁。要使瓶苗達(dá)到一定數(shù)量，第2年就可進(jìn)行三倍體丹參脫毒新品種評(píng)比試驗(yàn)，選育出藥材產(chǎn)量提高20%以上，藥物有效成分丹酚酸B和丹參酮II A提高0.5-1倍以上，綜合生物性狀好的三倍體丹參脫毒新品種。
[0005]本發(fā)明提供的是一種三倍體丹參脫毒新品種的選育方法，包括以下步驟:
⑴取材:以下3種材料來(lái)源之一，均可進(jìn)行三倍體丹參毒新品種的選育工作:①在三倍
體丹參大田中新發(fā)現(xiàn)的變異植株莖尖或新生幼葉(圖1);②三倍體丹參雜交(2x早X4x古或4x早Χ2χ ?)當(dāng)代種子幼苗莖尖或幼葉大田生產(chǎn)種植8年以上的三倍體丹參莖尖或新生幼葉；
⑵脫毒處理:在無(wú)菌操作條件下先用75%酒精消毒I分鐘，再用0.1%升汞消毒10分鐘，無(wú)菌蒸懼水沖洗5遍；
⑶光照培養(yǎng):在光照周期14小時(shí)/天，光強(qiáng)度3000Lux，室溫20-25°C條件下進(jìn)行培養(yǎng)； ⑷擴(kuò)大繁殖:待叢生芽生長(zhǎng)出1-2片葉時(shí)，進(jìn)行分瓶擴(kuò)大繁殖，每瓶分裝3-5棵苗；
(5)瓶苗移栽:待瓶苗長(zhǎng)出新根，根長(zhǎng)3-5公分時(shí)，進(jìn)行瓶苗移栽。移栽前2天打開瓶蓋進(jìn)行練苗； (6)移栽苗管理:剛移出的瓶苗要加強(qiáng)管理，成活率可達(dá)90%以上；
⑴三倍體丹參脫毒新品系(種)品種評(píng)比試驗(yàn):按常規(guī)新品種評(píng)比試驗(yàn)要求進(jìn)行，每個(gè)新選育出來(lái)的三倍體丹參脫毒新品(種)大田種植面積要達(dá)到2-3畝；
⑶三倍體丹參脫毒新品系(種)主要藥物有效成分測(cè)定:按《藥典》規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定丹參酮II A和隱丹參酮含量。
[0006]⑶三倍體丹參脫毒新品種的確定:根據(jù)三倍體丹參脫毒新品系大田種植藥材產(chǎn)量和主要藥物有效成分含量測(cè)定，最后才能確定三倍體丹參脫毒新品種的選育成功。
[0007]按本發(fā)明的以上程序，2年內(nèi)即可選育出藥材產(chǎn)量提高20%以上，藥物有效成分丹酚酸B和丹參酮II A提高0.5-1倍以上，綜合生物性狀好的三倍體丹參脫毒新品種，并科學(xué)的解決了因生物及非生物脅迫引起的三倍體丹參品種退化而造成的丹參藥材減產(chǎn)難題。
[0008]【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】:
圖1:在三倍體丹參大田中發(fā)現(xiàn)的變異株。
[0009]圖2:三倍體丹參取材與脫毒處理；(a)取材，(b)脫毒。
[0010]圖3:三倍體丹參組織培養(yǎng)與克隆快繁。
[0011]圖4:三倍體丹參瓶苗移栽。
[0012]圖5:三倍體丹參脫毒新品種大田種植生長(zhǎng)勢(shì)。
[0013]圖6:三倍體丹參脫毒新品種根部藥材。
[0014]
【具體實(shí)施方式】
[0015]本發(fā)明突出的特點(diǎn)和顯著進(jìn)步可以從下述實(shí)例中得以體現(xiàn)，但它不會(huì)對(duì)本發(fā)明作任何限制。
[0016]本發(fā)明提供的是一種三倍體丹參脫毒新品種的選育方法包括以下步驟:
取材是關(guān)健，所取的材料必須是新發(fā)現(xiàn)的三倍體丹參變異植株莖尖或新生長(zhǎng)幼葉、三倍體丹參雜交當(dāng)代種子幼苗新生長(zhǎng)的幼葉或大田生產(chǎn)8年以上出現(xiàn)明顯品種退化的三倍體植株莖尖或新生幼葉。
[0017]脫毒處理必須徹底，要嚴(yán)格按著無(wú)菌操作手續(xù)，徹底消滅接種材料上可能攜帶的細(xì)菌和病毒。在超凈臺(tái)內(nèi)將切取的材料先用75%酒精消毒I分鐘，再用0.1%升汞消毒10分鐘，無(wú)菌蒸餾水沖洗5遍，再將材料接種在1/2MS培養(yǎng)基上，進(jìn)行培養(yǎng)。
[0018]光照培養(yǎng)，光照培養(yǎng)室除滿足光照培養(yǎng)周期14小時(shí)/天，光強(qiáng)度3000Lux，室溫20-25°C條件外，還要保持光照培養(yǎng)室的濕度在50%左右、通風(fēng)和清潔衛(wèi)生，減少外來(lái)污染。
[0019]擴(kuò)大繁殖的空間很大，根據(jù)擴(kuò)大繁殖的數(shù)量，時(shí)間可能拉的很長(zhǎng)。因?yàn)槿〔牡臄?shù)量直接影響著擴(kuò)大繁殖種苗的數(shù)量，為保證三倍體丹參脫毒種苗擴(kuò)繁15000棵，取材步驟必須有一定數(shù)量。
[0020]瓶苗移栽，待瓶苗長(zhǎng)出3-5公分新根時(shí)，進(jìn)行瓶苗移栽，移栽前2天打開瓶蓋進(jìn)行練苗。瓶苗移栽方法和營(yíng)養(yǎng)土對(duì)瓶苗移栽成活率有很大影響。移栽前要把培養(yǎng)基洗凈，移栽的基質(zhì)要事先經(jīng)滅菌靈消毒堆肥發(fā)酵處理過(guò)的磨菇泥渣與砂土按3:1混合基質(zhì)，每個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽移栽一棵苗。移栽瓶苗要加強(qiáng)管理，移栽第一周50%光照,保持50-70%濕度,成活率可達(dá)90%以上。
[0021]三倍體丹參脫毒新品系(種)新品種評(píng)比試驗(yàn)，按常規(guī)新品種評(píng)比試驗(yàn)要求進(jìn)行。一般農(nóng)作物新品種評(píng)比試驗(yàn)設(shè)三亇重復(fù)，每個(gè)重復(fù)0.5-1畝地。藥用植物新品種評(píng)比試驗(yàn)也可參照此要求進(jìn)行,設(shè)三個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)I畝地,每畝5000棵苗。
[0022]主要藥物有效成分測(cè)定，按《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，丹參酮II A不得少于0.2 %，丹酚酸B不得少于3.0%。
[0023]三倍體丹參脫毒新品種的確定。三倍體丹參脫毒新品種的確定，要根據(jù)藥材產(chǎn)量、主要藥物有效成分含量和主要生物學(xué)性狀三方面來(lái)確定。一般藥材產(chǎn)量增產(chǎn)20%以上，丹參酮II A提高0.5-1倍以上，丹酚酸B提高0.5倍以上，綜合生物學(xué)性狀好，抗生物及非生物脅迫能力強(qiáng)的三倍體丹參脫毒新品系可以確定為三倍體丹參脫毒新品種。
[0024]實(shí)施例1 2012年10月在三倍體丹參生產(chǎn)大田中發(fā)現(xiàn)2棵發(fā)生變異的三倍體丹參植株。我們暫命名為:RY1、RY2。隨后，我們采集這2棵變異植株的新生幼葉，進(jìn)行脫毒處理和組培快繁:首先，用流水沖洗幼葉，洗凈泥砂，在超凈工作臺(tái)內(nèi)，按無(wú)菌操作程序，用75%酒精消毒30-60秒一0.1 %升汞消毒15分鐘，無(wú)菌水沖洗5次，用解剖刀將材料切割成1-2平方厘米大小，接種在1/2MS + 6BA0.5-lmg/L培養(yǎng)基上，直接誘導(dǎo)叢生芽，接種20-30天后，待大量叢生芽產(chǎn)生后，進(jìn)行試管苗的大量克隆增殖，待叢生芽生長(zhǎng)出真葉時(shí)，轉(zhuǎn)接到1/2MS + IBAO0 2mg/L培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，在光照12小時(shí)/天，光強(qiáng)度3000Lux，室溫25°C條件下培養(yǎng)，待試管苗新根長(zhǎng)至1-2厘米時(shí)，打開瓶蓋，練苗3-5天，進(jìn)行瓶苗移栽，用長(zhǎng)鑷子取出瓶苗，洗去培養(yǎng)基，移入事先堆積發(fā)酵好的營(yíng)養(yǎng)土中(營(yíng)養(yǎng)土為蘑菇泥渣與砂土 3:1混合，用多菌靈消毒，堆積發(fā)酵)，移栽苗的管理，移栽的瓶苗前20天，要半遮光，保持50-70 %濕度，成活率可達(dá)90%以上。2012年12月-2013年4月移栽的瓶苗放在不加溫的溫室內(nèi)，溫度保持在5°C以上。2013年4月20日移栽于大田中(圖4)，三倍體丹參脫毒新品種表現(xiàn)生長(zhǎng)旺盛(圖5)。2013年11月11日收獲三倍體丹參脫毒新品種。經(jīng)測(cè)算丹參藥材產(chǎn)量折合2000公斤/畝，丹參酮IIA、丹酚酸B、隱丹參酮均達(dá)到或超過(guò)《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。表1為三倍體丹參脫毒新品系(種)根部藥材藥物有效成分測(cè)定結(jié)果:采用高效液相色譜法測(cè)定其含量，主要以丹酚酸B、丹參酮II A為測(cè)定指標(biāo))
表1三倍體丹參脫毒新品系(種)根部藥材藥物有效成分測(cè)定數(shù)據(jù)
【權(quán)利要求】
1.一種三倍體丹參脫毒新品系(種)的快速選育方法，其特征在于包括以下步驟: ⑴取材，選自:①在三倍體丹參大田中新發(fā)現(xiàn)的變異植株莖尖或新生幼葉(圖1);②三倍體丹參雜交(2x早Χ4χ ?或4x早Χ2χ ? )當(dāng)代種子幼苗莖尖或幼葉大田生產(chǎn)種植8年以上的三倍體丹參莖尖或新生幼葉； ⑵脫毒處理:在無(wú)菌操作條件下，進(jìn)行材料的脫毒處理； ⑶組織培養(yǎng):按無(wú)菌操作程序，將材料接種在1/2MS培養(yǎng)基上，在20-25 °C，光強(qiáng)度3000LUX，光周期14小時(shí)/天條件下進(jìn)行培養(yǎng)，20天后在葉緣切割面可分化出叢生芽；⑷組培苗克隆繁殖:待叢生芽分化出幼葉時(shí)，進(jìn)行分瓶擴(kuò)大繁殖，每瓶以3-5棵苗為 且； (5)瓶苗移栽:待新根3-5公分時(shí)進(jìn)行瓶苗移栽，移栽前2-3天先打開瓶蓋練苗； (6)移栽苗管理:加強(qiáng)移栽苗管理； ⑴三倍體丹參脫毒新品種評(píng)比試驗(yàn):按通常三倍體丹參大田種植方法進(jìn)行田間栽培管理； ⑶三倍體丹參脫毒新品系(種)主要藥物有效成分測(cè)定:按《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定，對(duì)三倍體丹參脫毒新品系(種)丹參酮II A、丹酚酸B和隱丹參酮進(jìn)行測(cè)定； ⑶三倍體丹參脫毒新品種的確定:根據(jù)三倍體丹參脫毒新品種藥材產(chǎn)量和主要藥物有效成分含量測(cè)定結(jié)果，最后確定三倍體丹參脫毒新品種的選育結(jié)果。
2.一種三倍體丹參脫毒新品種的快速選育方法，其特征在于包括以下步驟: ⑴取材:選自以下三種材料來(lái)源之一:①在三倍體丹參種植大田中新發(fā)現(xiàn)的變異植株的莖尖或新生幼葉；②三倍體丹參雜交(2x早Χ4χ ?或4x早Χ2χ ? )當(dāng)代種子幼苗之新生幼葉大田栽培生產(chǎn)8年以上三倍體丹參植株莖尖或新生幼葉；按無(wú)菌操作程序，在超凈工作臺(tái)上，用解剖刀切取1-2平方厘米大小的葉片，進(jìn)行脫毒處理； ⑵脫毒處理:在超凈臺(tái)內(nèi)將切取的材料先用75%酒精消毒I分鐘，再用0.1%升汞消毒10分鐘，無(wú)菌蒸餾水沖洗5遍，將材料接種在1/2MS培養(yǎng)基上，在組織培養(yǎng)室中進(jìn)行光照培養(yǎng); ⑶光照培養(yǎng):⑵所述的光照培養(yǎng)是在周期14小時(shí)/天，光強(qiáng)度3000Lux，室溫20-25°C條件下進(jìn)行培養(yǎng)；在上述條件下培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)20天沿接種材料切割面會(huì)產(chǎn)生大量叢生芽；⑷擴(kuò)大繁殖:待⑶所述的叢生芽生長(zhǎng)出1-2片葉時(shí)，進(jìn)行分瓶擴(kuò)大繁殖，每瓶分裝3-5棵苗； (5)瓶苗移栽:待瓶苗長(zhǎng)出新根，根長(zhǎng)3-5公分時(shí)，進(jìn)行瓶苗移栽；移栽前2天打開瓶蓋進(jìn)行練苗； (6)移栽苗管理:剛移出的瓶苗要半遮光，保持50-70%的濕度，成活率達(dá)90%以上； ⑴三倍體丹參脫毒新品種品種評(píng)比試驗(yàn):按常規(guī)新品種評(píng)比試驗(yàn)要求進(jìn)行，每個(gè)新選育出來(lái)的三倍體丹參脫毒新品種大田種植面積要達(dá)到1.5-3畝地； ⑶三倍體丹參脫毒新品種主要藥物有效成分含量測(cè)定:按《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定丹參酮II A、丹酚酸B和隱丹參酮含量； ⑶三倍體丹參脫毒新品種的確定:根據(jù)三倍體丹參脫毒新品系大田種植藥材產(chǎn)量和主要藥物有效成分含量測(cè)定，最后確定三倍體丹參脫毒新品種的選育結(jié)果。
3.按照權(quán)利要求2所述的快速選育方法，其特征在于所述的取材是選取三倍體丹參種植大田中新發(fā)現(xiàn)的變異植株的莖尖或新生幼葉。
4.按照權(quán)利要求2所述的快速選育方法，其特征在于步驟③要保持光照培養(yǎng)室的濕度在50%，并保持通風(fēng)和清潔衛(wèi)生。
5.按照權(quán)利要求2所述的快速選育方法，其特征在于步驟④擴(kuò)大繁殖數(shù)量為15000棵。
6.按照權(quán)利要求2所述的快速選育方法，其特征在于步驟(5)所述的瓶苗移栽方法為:移栽前要把培養(yǎng)基洗凈，移栽的基質(zhì)要事先經(jīng)滅菌靈消毒堆肥發(fā)酵處理過(guò)的磨菇泥渣與砂土按3:1混合基質(zhì),每個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽移栽一棵苗。
7.按照權(quán)利要求2所述的快速選育方法，其特征在于步驟⑦所述的評(píng)比試驗(yàn)設(shè)三亇重復(fù)，每個(gè)重復(fù)I畝地，每畝5000棵苗。
8.按照權(quán)利要求2所述的快速選育方法，其特征在于步 驟(8)主要藥物有效成分測(cè)定，丹參酮II A不得少于0.2%，丹酚酸B不得少于3.0%。
9.按照權(quán)利要求2所述的快速選育方法，其特征在于步驟⑶所述的三倍體丹參脫毒新品種的確定:藥材產(chǎn)量增產(chǎn)20%以上，丹參酮II A提高I倍以上，丹酚酸B提高0.5倍以上。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK103583367SQ201310582544
【公開日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2013年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月20日
【發(fā)明者】陳瑞陽(yáng) 申請(qǐng)人:陳瑞陽(yáng)