一種綿毛蘑菇菌株及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及綿毛蘑菇菌株的篩選及制備方法，屬于微生物【技術領域】。本發(fā)明的菌株AgaricusvaporariusKXJ（蘑-8）已于2013年10月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNO.8119。利用該菌株制備的液體及固體優(yōu)良菌種，應用于綿毛蘑菇的促繁有著顯著的社會、經濟效益和廣闊的應用前景。
【專利說明】一種綿毛蘑菇菌株及制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬微生物【技術領域】，具體涉及綿毛蘑菇菌株KXJ(蘑-8)及其制備方法。
【背景技術】
[0002]綿毛蘑燕Cfearicw1S raporariiAs入屬于傘菌目、蘑燕科、蘑燕屬，主要分布于新疆、內蒙古等地，夏末至秋季在闊葉或混交林地上大量群生，綿毛蘑菇營養(yǎng)豐富，富含人體必需氨基酸、礦物質、維生素和多糖等營養(yǎng)成分，是一種高蛋白、低脂肪的營養(yǎng)保健食品
在綿毛蘑菇栽培技術中，優(yōu)良菌種的獲得是關鍵技術環(huán)節(jié)，綿毛蘑菇菌株的獲得通常是利用子實體或孢子進行分離、純化，直接應用于綿毛蘑菇的栽培或菌絲體生產，現(xiàn)有技術的不足在于其生物學 特性目前仍處于試驗研究階段，生物轉化率較低，而且還要用熟料栽培，生產工藝及技術要素要求較高，因而制約了綿毛蘑菇商品經濟的發(fā)展，另外只能根據(jù)菌絲形態(tài)及分離物來初步確定是否為綿毛蘑菇純培養(yǎng)物；生產的菌種一般用固體菌種，目前在國內采用液體菌種進行綿毛蘑菇資源的保護應用不廣泛。

【發(fā)明內容】

[0003]本發(fā)明的主要目的就是克服現(xiàn)有技術不足，利用新疆原產地綿毛蘑菇子實體篩選出優(yōu)良菌株，采用生物技術進行菌種鑒定，制備綿毛蘑菇液體及固體優(yōu)良菌種，為綿毛蘑菇資源保護提供優(yōu)良菌種
本發(fā)明采用的真菌是綿毛蘑vaporarius KXJ (蘑-8);保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址:中國北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號；保藏日期:2013年8月26日；保藏登記入冊的編號CGMCC N0.8119
綿毛蘑菇的子實體由菌蓋、菌褶、菌柄三部分組成，單生、散生或簇生，其子實體中型至大型。菌蓋直徑疒20cm，新鮮時污白色、蛋殼黃色，初期半球形，后漸平展，邊緣內卷；菌肉肥厚，白色至淺紅褐色，如遇鐵器傷害迅速變?yōu)榧t色；菌褶離生，致密而不等長，初淺粉色后變黑褐色至黑色；菌柄長3~10cm，粗3-5cm，上部柱形、基部近梭形，菌柄顏色近蓋色，菌柄上部表面布有銀灰色光澤的纖維質，雙層菌幕，外菌幕在菌柄基部形成托狀；孢子印褐紅色至咖啡色；擔子四孢子梗，具棒狀囊體；孢子棕色，內含油滴，短橢圓形，
4.988~7.254 X 5.429~8.426 μ m
本發(fā)明的技術方案:
①采集野生綿毛蘑菇子實體；
②組織分離或孢子分離；
③純化菌株及菌株鑒定；
④生物學特性比較及生產性狀比較；
⑤確定優(yōu)良菌株；
⑥菌種生產及菌種應用；
經過反復篩選，獲得菌絲體產量高、抗污染的綿毛蘑菇液體菌種專用菌株KXJ (蘑-8)本發(fā)明真菌vaporarius KXJ (蘑_8)培養(yǎng)方法(以下為重量百分比):
菌種分離純化培養(yǎng)基:2%綿毛蘑菇下腳料、0.001%VB1、2%葡萄糖、2%瓊脂；
綿毛蘑菇菌株分離及鑒定方法:
1、將綿毛蘑菇子實體組織塊或孢子液接種到上述試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，于18_24°C下培養(yǎng)5-10天，對分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時剔除已污染的試管，挑選出無污染、長勢良好的菌株，獲得綿毛蘑菇分離試管種
2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿上進行菌種純化，2天后取尖端菌絲塊接種在培養(yǎng)基斜面上，于18-24°C下培養(yǎng)5-7天，獲得綿毛蘑菇純化試管種
3、采用供試子實體與對應菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進行PCR擴增及ITS序列測定，通過Blast對比樣品的ITS序列與GENBANK中的綿毛蘑燕(Agaricusvaporarius) Identities=539/544 (99%), Gaps=4/544 (1%),分析確定分離得到的純培養(yǎng)物為綿毛蘑菇菌絲體
本發(fā)明綿毛蘑菇菌種的制備方法分為:液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)兩種
液體菌種制備方法:
液體培養(yǎng)基配方為:糊精3%、酵母粉0.2%、MgS047H20 0.5%, KH2PO4 0.25%，余下為水，pH
自然
1、將綿毛蘑菇的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，于18-24°C下培養(yǎng)5-7天，獲得試管菌種
2、將試管種接種到500ml三角瓶(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為前述液體培養(yǎng)基配方，于20-26°C下?lián)u床培養(yǎng)，轉速為120-160r/min，培養(yǎng)時間5_7天
3、將搖瓶菌種接種到25L自動發(fā)酵生產線的發(fā)酵罐中，通氣量為1:0.8ν/(ν.π?η);攪拌轉速為120-160r/min ;接種量為5-10% ;罐壓:0.04Mpa ； pH為6.0 ;溫度為20-26°C ;通氣培養(yǎng)72-96小時，獲得綿毛蘑菇液體菌種
固體菌種制備方法:
固體培養(yǎng)基配方為:棉籽殼90%、麩皮9%、碳酸鈣1%、ρΗ自然
1、將綿毛蘑菇的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，于18-24°C下培養(yǎng)5-7天，獲得試管菌種
2、將試管種接種到500ml三角瓶(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為前述液體培養(yǎng)基配方，于20-26°C下?lián)u床培養(yǎng)，轉速為120-160 r/min，培養(yǎng)時間5_7天
2、采用前述固體培養(yǎng)基配方。將培養(yǎng)料混合后，加水拌均勻后，裝入750ml的大口瓶中，壓緊封口后在120°C滅菌60分鐘，接入液體菌種，于20-26°C培養(yǎng)15-20天，直到菌絲長滿
【具體實施方式】:
實施例一:
1、將綿毛蘑菇子實體組織塊接種到上述菌種分離純化培養(yǎng)基斜面上，于18°C下培養(yǎng)10天，對分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時剔除已污染的試管，挑選出無污染、長勢良好的菌株，獲得綿毛蘑菇分離試管種
2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿上進行菌種純化，2天后取菌絲塊接種在培養(yǎng)基斜面上，于18°C下培養(yǎng)7天，獲得綿毛蘑菇純化試管種3、采用供試子實體與對應菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進行PCR擴增及ITS序列測定，通過Blast對比樣品的ITS序列與GENBANK中的綿毛蘑燕(Agaricusvaporarius) Identities=539/544 (99%), Gaps=4/544 (1%),分析確定分離得到的純培養(yǎng)物為綿毛蘑菇菌絲體
4、將vaporariusKXJ (蘑_8)的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上,培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，18°C下培養(yǎng)7天，獲得試管種
5、將試管種接種到500ml三角瓶中(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為糊精3%、酵母粉0.2%、MgS047H20 0.5%，KH2PO4 0.25%，余下為水，pH自然。于20°C下?lián)u床培養(yǎng)，轉速為120rpm，培養(yǎng)時間7天，獲得一級液體菌種
將一級液體菌種接種到25L自動發(fā)酵生產線的發(fā)酵罐中，通氣量為1:0.8v/(v *min)；攪拌轉速為120r/min ;接種量為5% ;罐壓:0.04Mpa ； pH為6.0 ;溫度為20°C ;通氣培養(yǎng)96小時，獲得綿毛蘑菇液體菌種
實施例二:
菌種制備的步驟與實施例一相同 1、將綿毛蘑菇子實體組織塊接種到上述菌種分離純化培養(yǎng)基斜面上，于20°C下培養(yǎng)6天，對分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時剔除已污染的試管，挑選出無污染、長勢良好的菌株，獲得綿毛蘑菇分離試管種
2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿上進行菌種純化，2天后取尖端菌絲塊接種在培養(yǎng)基斜面上，于20°C下培養(yǎng)6天，獲得綿毛蘑菇純化試管種
3、采用供試子實體與對應菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進行PCR擴增及ITS序列測定，通過Blast對比樣品的ITS序列與GENBANK中的綿毛蘑燕(Agaricusvaporarius) Identities=539/544 (99%), Gaps=4/544 (1%),分析確定分離得到的純培養(yǎng)物為綿毛蘑菇菌絲體
4、將vaporariusKXJ (蘑_8)的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上,培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，20°C下培養(yǎng)6天，獲得試管種
5、將試管種接種到500ml三角瓶中(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為糊精3%、酵母粉0.2%、MgS047H20 0.5%，KH2PO4 0.25%，余下為水，pH自然。于22°C下?lián)u床培養(yǎng)，轉速為140rpm，培養(yǎng)時間6天，獲得一級液體菌種
將一級液體菌種接種到25L自動發(fā)酵生產線的發(fā)酵罐中，通氣量為1:0.8v/(v *min)；攪拌轉速為140r/min ;接種量為8% ;罐壓:0.04Mpa ； pH為6.0 ;溫度為22°C ;通氣培養(yǎng)84小時，獲得綿毛蘑菇液體菌種
實施例三:
1、將綿毛蘑菇子實體組織塊接種到上述菌種分離純化培養(yǎng)基斜面上，于22°C下培養(yǎng)5天，對分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時剔除已污染的試管，挑選出無污染、長勢良好的菌株，獲得綿毛蘑菇分離試管種
2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿上進行菌種純化，2天后取尖端菌絲塊接種在培養(yǎng)基斜面上，于22°C下培養(yǎng)5天，獲得綿毛蘑菇純化試管種
3、采用供試子實體與對應菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進行PCR擴增及ITS序列測定，通過Blast對比樣品的ITS序列與GENBANK中的綿毛蘑燕Agaricusvaporarius) Identities=539/544 (99%), Gaps=4/544 (1%),分析確定分離得到的純培養(yǎng)物為綿毛蘑菇菌絲體
4、將vaporariusKXJ (蘑_8)的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上,培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，22°C下培養(yǎng)5天，獲得試管種
5、將試管種接種到500ml三角瓶中(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為糊精3%、酵母粉0.2%、MgS047H20 0.5%，KH2PO4 0.25%，余下為水，pH自然。于24°C下?lián)u床培養(yǎng)，轉速為160rpm，培養(yǎng)時間5天，獲得一級液體菌種
將一級液體菌種接種到固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基配方為棉籽殼90%、麩皮9%、碳酸|丐1%、PH自然。將各原料按比例稱量后混合均勻，加水拌勻后裝入750ml的菌種瓶中，每瓶裝500ml, 120°C滅菌60分鐘后，接種后置于24°C培養(yǎng)15天，獲得綿毛蘑菇固體菌種
實施例四:
1、將綿毛蘑菇子實體組織塊接種到上述菌種分離純化培養(yǎng)基斜面上，于24°C下培養(yǎng)5天，對分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時剔除已污染的試管，挑選出無污染、長勢良好的菌株，獲得綿毛蘑菇分離試管種
2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿上進行菌種純化，2天后取菌絲塊接種在培養(yǎng)基斜面上，于24°C下培養(yǎng)5天，獲得綿毛蘑菇純化試管種
3、采用供試子實體與對應菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進行PCR擴增及ITS序列測定，通過Blast對比樣品的ITS序列與GENBANK中的綿毛蘑燕(Agaricusvaporarius) Identities=539/544 (99%), Gaps=4/544 (1%),分析確定分離得到的純培養(yǎng)物為綿毛蘑菇菌絲體
4、將vaporariusKXJ (蘑_8)的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上,培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，24°C下培養(yǎng)5天，獲得試管種
5、將試管種接種到 500ml三角瓶中(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為糊精3%、酵母粉0.2%、MgS047H20 0.5%，KH2PO4 0.25%，余下為水，pH自然。于26°C下?lián)u床培養(yǎng)，轉速為160rpm，培養(yǎng)時間5天，獲得一級液體菌種
將一級液體菌種接種到固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基配方為棉籽殼90%、麩皮9%、碳酸|丐1%、PH自然。將各原料按比例稱量后混合均勻，加水拌勻后裝入750ml的菌種瓶中，每瓶裝500ml, 120°C滅菌60分鐘后，接種后置于26°C培養(yǎng)20天，獲得綿毛蘑菇固體菌種。
【權利要求】
1.一種綿毛蘑燕菌株，其特征在于所述菌株為Cfearicw1S vaporarius) KXJ (蘑-8),該菌株的保藏號為CGMCCN0.8119。
2.根據(jù)權利要求1所述的綿毛蘑菇菌株的制備方法，所述菌株是經過常規(guī)的液體和固體發(fā)酵培養(yǎng)獲得的，其特征在于所述液體和固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下:(1)液體培養(yǎng)基配方為:糊精3%-5%、酵母粉 0.2%-0.4%、MgSO4.7Η20 0.5%，KH2PO4，0.25%，余下為水，pH自然； (2)固體培養(yǎng)基配 方為:棉籽殼75-87%、麩皮15-9%、石膏1%、腐殖土3%，含水量60%、pH自然。
【文檔編號】A01H4/00GK103858668SQ201310620805
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2013年11月29日 優(yōu)先權日:2013年11月29日
【發(fā)明者】張微思, 羅孝坤, 郭永紅, 徐丕曦, 何容 申請人:昆明菌苑食品有限公司