直接速凍蜂巢從冷凍蟲體內(nèi)獲取天然生物毒素的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種直接速凍蜂巢從冷凍蟲體內(nèi)獲取天然生物毒素的方法。具體是指用不高于-20℃的冷凍劑對膜翅目細腰亞目針尾部昆蟲的巢和蟲體進行直接冷凍，從冷凍狀態(tài)下提取的毒素類活性物質(zhì)保持天然結(jié)構(gòu)，可以用于制備抗病毒、抗菌、抗風濕、抗腫瘤、抗心腦血管疾病的藥物、日化用品和醫(yī)療器械。本發(fā)明方法是適用于蜜蜂總科和胡蜂總科中的長腹胡蜂科、鈴腹胡蜂科、異腹胡蜂科、狹腹胡蜂科、馬蜂科、胡蜂科、蟻科等膜翅目昆蟲的安全采毒關(guān)鍵技術(shù)。本關(guān)鍵技術(shù)能解決蜜蜂和胡蜂總科蜂毒采集中瓶頸問題，具有顯著的經(jīng)濟價值，可滿足市場短缺和采毒創(chuàng)新技術(shù)的不足。
【專利說明】直接速凍蜂巢從冷凍蟲體內(nèi)獲取天然生物毒素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，本發(fā)明涉及一種用等于或低于零下20°C的冷凍劑對蜜蜂和胡蜂等膜翅目細腰亞目針尾部蜂類昆蟲的蜂巢和蟲體進行直接迅速冷凍，并從冷凍狀態(tài)下的蟲體中獲取毒素類活性物質(zhì)的生物醫(yī)藥取毒方法。是普適于膜翅目細腰亞目針尾部蜂類昆蟲，包括但不限于蜜蜂總科和胡蜂總科中的長腹胡蜂科、鈴腹胡蜂科、異腹胡蜂科、狹腹胡蜂科、馬蜂科、胡蜂科的安全釆毒關(guān)鍵技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]膜翅目(Hymenoptera)，細腰亞目(Apocrita)，針尾部(Aculeata)昆蟲有胡蜂總科(Vespoidea)、泥蜂總科(Sphecoidea)和蜜蜂總科(Apoidea)等3個總科的數(shù)萬種蜂類昆蟲，該蜂類昆蟲的職蜂大都帶有毒囊與螯針，能分泌富含生物活性的蜂毒類生物毒素。
[0003]蜂毒是具有高度生物學活性和藥理學活性的復(fù)雜混合物。胡蜂毒不僅具有過敏性，且可以造成血纖維蛋白溶解作用、對骨骼肌的破壞、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和視覺障礙引發(fā)的過敏性休克等(Lombardini，C 等，Am J Emerg Medj 2009，153:131-135 ;Patriarca，G等，Intl J Immunopathol Pharmacol, 2008,21:669-677 ；SchuItze-Werninghausj C等，Pediatr Allergy Immunol, 1999，10:133-137 ;Puchalska_Niedbal，L 等，Ann AcadMed Stetin，2007，53Suppll:90-93 ;Rocha，T 等，Toxicon，2007，50:589-599);胡蜂毒還顯示對心血管、降壓、抗菌、抑制乙酰膽堿酯酶等許多有前景的生理活性(Rubin，Y等，Cardiovascular haemodynamics of oriental hornet venom sac extract, PharmacolToxicol， 1993，72:268-272 ;Ho，CL 等，Structures and biological activities of newwasp venom peptides isolated feom the black-bellied hornet(Vespa basalis)venom.Toxicon, 1998，36:609-617 ;Konno，K 等，Molecular determinants of bindingof a wasp toxin (PMTXs) and its analogs in the Na+channels proteins.NeurosciLett，2000，285:29-32 ;Ho，CL 等，Enhancing the hypotensive effect and diminishingthe cytolytic activity of hornet mastoparan B by D—amino acid substitution，Toxicon, 2001，39:1561-1566 ;Dami，MP 等，Antibacterial and proteolyticactivity in venom from the endoparasitic wasp Pimpla hypochondriaca(Hymenoptera:1chneumonidae)，J Insect Physiol，2003，49:945-954 ;Wang，幾等，Isolatedprolongation of activated partial thromboplastin time following wasp sting, ActaPaediatr Taiwan，2005，46:164-165 ;Abt，M 等，Characterization of phenoloxidaseactivity in venom from the ectoparasitoid Nasonia vitripennis(Walker)(Hymenoptera:Pteromalidae).J Invertebr Pathol, 2007，94:108-118 ;Polsinelli，GA等，Insect-specific irreversible inhibitors of acetylcholine-esterase inpests including the bed bug,the eastern yellowjacket, German and Americancockroaches, and the confused flour beetle, Chem Biol Interact，2010，187:142—147 ;Ye，J 等，A defensin antimicrobial peptide from the venoms of Nasonia vitripennis,Toxicon, 2010, 56:101-106)。
[0004]我國南部分布著大量的胡蜂種群，胡蜂是膜翅目細腰亞目針尾部胡蜂總科昆蟲的總稱，世界上已知有5000多種，中國記載的有200余種，在中國分布甚廣。胡蜂毒在國際市場上的售價居高不下，國外基本壟斷了其研究和關(guān)鍵技術(shù)。開發(fā)蜂毒系列產(chǎn)品，對于我國戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，以及增進山區(qū)養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟收入、脫貧都具有重要意義。廣闊的醫(yī)藥前景也給蜂毒采集工作者帶來了機遇和挑戰(zhàn)。如何采取得到大量的、質(zhì)量可控的胡蜂蜂毒是擺在我國科研工作者面前的關(guān)鍵技術(shù)之瓶頸。我國目前常見的采取蜂毒的模式是:用捕捉到的職蜂取毒囊分離出蜂毒；或者用電脈沖法刺激職蜂用尾針蟄刺取毒器上的玻璃板，將蜂毒留在取毒器玻璃板上，再予以收集。
[0005]蜜蜂是膜翅目細腰亞目針尾部蜜蜂總昆蟲的通稱，全世界已知約1.5萬種，中國已知約1000種。中華蜜蜂(中蜂)、意大利蜂(意蜂)、東北黑蜂、伊犁黑蜂、卡尼鄂拉蜂、高加索蜂等幾種蜜蜂為重要的資源昆蟲。蜜蜂蜂毒中含有蜂毒肽、蜂毒明肽、肥大細胞脫顆粒肽、心臟肽等，對神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等分別發(fā)揮不同的藥理作用，有很大的醫(yī)藥價值。2013年3月美國華盛頓大學公開了蜜蜂蜂毒能夠殺死HIV病毒而不傷害正常組織細胞，更是強化了蜂毒類生物活性物質(zhì)對于未來解除疾病折磨的可能性。然而，我國相關(guān)蜂毒采集工作仍是使用上述常規(guī)的電動脈沖采毒器，蜂群由于受到的刺激信息不足，攻擊意愿并不強烈，造成采毒效率不能達到最高水平。由是觀之，隨著蜂毒類活性物質(zhì)的生物醫(yī)藥用途日益增多，對蜂毒的需求將會幾何級別的增長，因而，走在世界前面，率先在我國進一步加強蜂毒采集的技術(shù)攻關(guān)是十分必要的。
[0006]從我國專利技術(shù)發(fā)展的歷史看，李光宏和黃世梅在1986年申請了實用新型專利《封閉式蜜蜂蜂毒采集器》(CN85203663U) ；1989年李鐵生和郭凡修共同申請了實用新型專利《電動閃光型胡蜂蜂毒自動`采集器》(CN2037925U);其中描述了使用紅白光束誘使胡蜂排毒的一種儀器。1994年徐文龍等申報的實用新型專利《繼箱型蜂毒采集器》(CN2168397Y)，其原理也是基于通過電流使蜜蜂進入尺寸形狀與蜂箱之繼箱一致的采毒箱進行毒液收集。2000年張金華設(shè)計的實用新型《速凍式蜂毒原液采集器》(CN2391418Y)，其特色是采用液氮冷凍室避免了采集過程中蜂毒的揮發(fā)。2006年，楊雷等公開了一種《自動采集蜂毒的方法及裝置》(CN1714631A)，描述了由電源、自動控制器、收集器組成的采集蜂毒的裝置；2007年，張文禮等設(shè)計并申請了實用新型專利《副蓋式蜜蜂電子取毒器》(CN2927685Y):主要是發(fā)明了將取毒板面向下朝向蜂箱，避免了空氣中塵埃和雜質(zhì)落在采毒的面板上，保證了蜂毒的純度。
[0007]但是，上述方法都無法解決胡蜂蜂毒采毒過程中遭遇到的無法控制胡蜂群攻擊的強烈程度，取毒量小，浪費大，毒素采集成本居高不下等問題。再者，已公開的許多方法都是僅適用于蜜蜂(尤其是中華蜜蜂、意大利蜂)毒素的采集，而不適用于攻擊性較強的胡蜂總科的昆蟲采毒。受到驚嚇或者意識到危險的胡蜂群對人體的攻擊幾乎是快速而致命、難以逃脫的。因此，野外取毒時，工作人員需要在全身穿戴嚴密的專業(yè)防護服的情況下完成采毒任務(wù)，在炎熱的地帶采毒是一項十分艱巨的工作，十分容易發(fā)生脫水、虛脫、流汗遮掩視線造成操作失誤等危險。并且，采集蜂毒時由于蜂群大量攻擊穿戴防護服的工作人員，造成寶貴的蜂毒大量浪費在無法回收收集蜂毒的防護服上。況且，采集到的蜂毒，如在外部空間開放式放置一段時間后，蜂毒成分開始發(fā)生微妙的生理生化變化，易造成蜂毒減效和失效。然而，如何創(chuàng)造一種有效的采集蜂毒的關(guān)鍵技術(shù)，使之既可以避免采毒人員的危險，又能夠有效解決并提高價值較高的胡蜂蜂毒采集量，使采集或者養(yǎng)殖一窩胡蜂可以得到更多的蜂毒量，擴大農(nóng)村山區(qū)養(yǎng)殖戶的單產(chǎn)量及收入，增加山區(qū)貧困養(yǎng)殖戶的脫貧數(shù)量，進一步滿足重大疾病治療對于蜂毒的不斷增長的市場需求，以往已有的報道及經(jīng)驗尚十分缺乏。而市場是急需一批創(chuàng)新性的養(yǎng)殖和采集蜂毒技術(shù)的集合及綜合應(yīng)用的。
[0008]再者，以往許多采毒者是應(yīng)用將蜂體窒息殺死，再剝?nèi)》潴w毒囊取毒的方法。該方法缺陷在于:蜂體活體常溫下解剖時，毒液容易沾染在毒囊壁上；且毒囊很容易被擠破而造成流失等導(dǎo)致的不必要的蜂毒物理損失。再者，長時間操作未冷凍蜂體時，死去的蜂體毒囊中的蜂毒類生化物質(zhì)易發(fā)生變質(zhì)、蛋白變性、多肽氧化等不利情況，不利于蜂毒大分子的原始結(jié)構(gòu)保存。
[0009]因此，如何巧妙地應(yīng)用現(xiàn)代昆蟲生理學特性，結(jié)合生物冷凍技術(shù)不破壞多肽類3維空間結(jié)構(gòu)等生物學特征，結(jié)合完全的蜂體解剖技術(shù)手段，將蜂巢中的蜂群一網(wǎng)打盡，提供一個幾乎無危險的環(huán)境以允許細心操作，發(fā)掘出新的足量的蜂毒，是迫在眉睫的?；诖?，本發(fā)明人經(jīng)過長期艱苦而危險的多批次實驗，最終找出能夠使蜂群迅速冷凍失去行動能力、同時保持了蜂毒活性肽的原始結(jié)構(gòu)、使每窩蜂巢采毒量迅速有效增加的組合式關(guān)鍵技術(shù)方法。本方法同時適用于胡蜂總科和蜜蜂總科的蜂毒采集工作。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的是提供一種從膜翅目細腰亞目針尾部蜂類昆蟲體內(nèi)獲取生物毒素活性物質(zhì)的方法；其特征是:該類活性物質(zhì)是從速凍的蜂巢中的冷凍蜂類昆蟲體內(nèi)取出的，具體而言，是從迅速冷凍條件下的昆蟲體內(nèi)的毒囊中取出的。
[0011]其中，膜翅目 細腰亞目針尾部蜂類昆蟲是指膜翅目細腰亞目針尾部中的胡蜂總科(Vespoidea)、泥蜂總科、蜜蜂總科(Apoidea)昆蟲；優(yōu)選蜜蜂總科中的中華蜜蜂(中蜂)、意大利蜂(意蜂)和胡蜂總科中的長腹胡蜂科、鈴腹胡蜂科、異腹胡蜂科、狹腹胡蜂科、馬蜂科、胡蜂科昆蟲。
[0012]本發(fā)明的再一目的是提供了一種適用于采取昆蟲生物毒素的冷凍劑，具體是指工業(yè)制冷劑液態(tài)二氧化碳、干冰、液氮、液氦中的一種或多種制成的或者聯(lián)合使用的、能使昆蟲在低溫下失去攻擊能力的冷凍劑。
[0013]本發(fā)明的再一目的是提供了一種取毒技術(shù)，也即使用上述冷凍劑噴灌、噴淋、澆灌形式對蜜蜂巢和胡蜂巢進行冷凍后，打開蜜蜂巢或者胡蜂巢，對已經(jīng)冷凍的蜜蜂或者胡蜂的毒囊進行摘取分離而得到毒素類活性物質(zhì)。
[0014]本發(fā)明的又一目的是提供了一種從膜翅目昆蟲胡蜂和蜜蜂中得到具有經(jīng)濟效益的蜂毒類活性物質(zhì)，作為制藥企業(yè)使用的原料藥物。
[0015]發(fā)明人長期觀察后發(fā)現(xiàn):一般來說，在遇到空氣氣溫降低的情況下，胡蜂蜂群會逐漸減少活動強度，蜷曲不動，而本冷凍劑速凍技術(shù)就是能快速使整個蜂巢降溫，在職蜂能夠開展攻擊之前使之進入類似冬眠狀態(tài)，直至完全失去出巢攻擊能力；同時，大量惰性氣體或二氧化碳使蜂類昆蟲窒息。進一步的冷凍，會使得整個蜂巢中的蜂王、職蜂蜂體均變成堅硬的蟲體，使得胡蜂毒囊和蜜蜂毒囊很容易用手術(shù)刀予以剝離，不沾染周邊其他組織殘留；使得職蜂的毒液全部在保留于毒囊的情況下就被采集得到；采毒量大大增加。[0016]本發(fā)明人將上述對蜜蜂和胡蜂群快速冷凍技術(shù)和手術(shù)剝離毒囊技術(shù)有機地結(jié)合起來，作為采集蜜蜂和胡蜂蜂毒的關(guān)鍵技術(shù)，從而發(fā)明了創(chuàng)新性的“冷凍剝離毒囊全面采毒”技術(shù)。發(fā)明人團隊發(fā)現(xiàn):在使用同一蜂群、同一取毒器、同一取毒電壓、同一采毒操作員的情況下，用迅速冷凍蜂巢法獲取胡蜂和蜜蜂毒類活性物質(zhì)時，能使蜜蜂毒采毒量比僅僅使用常規(guī)采毒器法采毒量提高34±8% ;胡蜂蜂毒采集量提高了 38±7% ;行之有效地實現(xiàn)了單次取毒得到的蜜蜂或胡蜂毒素產(chǎn)率得到有效提高，且保證了采集蜂毒的質(zhì)量不受外界采毒器的污染和干擾。該取毒效果屬于意想不到的發(fā)現(xiàn)。該關(guān)鍵技術(shù)對于貧困山區(qū)胡蜂養(yǎng)殖農(nóng)民有著顯著的經(jīng)濟效益和推廣應(yīng)用前景。本發(fā)明人經(jīng)查新發(fā)現(xiàn)，以往國內(nèi)外專利及文章專著中均無使用“冷凍剝離毒囊全面采毒”技術(shù)綜合作業(yè)采集膜翅目昆蟲生物毒素的相關(guān)報道。該生理生物采毒技術(shù)具有確切的新穎性和創(chuàng)造性，從而構(gòu)成本發(fā)明。
[0017]本發(fā)明的關(guān)鍵技術(shù)及其有益之處在于:使用冷凍劑對蜂巢整體實施冷凍簡單易行，但是非常有效。巢中昆蟲保留了所有生物毒素于蟲體毒囊中；而用手術(shù)刀剝離凍硬的冷凍毒囊時，又避免了活體未冷凍時毒液容易沾染于毒囊壁、容易被擠破而造成的毒素類活性物質(zhì)物理損失。同時還避免了未冷凍條件下長時間操作蜂體時，死去的蜂體毒囊中的蜂毒類生化物質(zhì)在常溫下發(fā)生變質(zhì)、蛋白變性、多肽氧化的不利情況，保證了蜂毒大分子的原始結(jié)構(gòu)?？捎糜谀こ崮亢淇偪浦械拈L腹胡蜂科、鈴腹胡蜂科、異腹胡蜂科、狹腹胡蜂科、馬蜂科、胡蜂科以及蜜蜂總科中的中蜂和意蜂等蜂類昆蟲毒素的采集。夜晚和白天均可對蜂群進行蜂毒采集工作。具有顯著的經(jīng)濟價值，滿足市場的短缺和采毒創(chuàng)新技術(shù)的不足。本發(fā)明中的技術(shù)及方法使用的原料來源方便易得，制備步驟簡便，利于產(chǎn)業(yè)化。更為重要的是:對于開發(fā)市場廣大的生物毒素藥物提供了物質(zhì)基礎(chǔ)來源，以及提供了創(chuàng)新性地獲取蜜蜂和胡蜂毒素的普適關(guān)鍵技術(shù)。通過規(guī)范化養(yǎng)殖胡蜂及采毒又能給連片特困地區(qū)的農(nóng)民增加收入、脫貧，具有顯著的巨大社會效益和經(jīng)濟效益。
具體實施方案
[0018]為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面分別用對意大利蜜蜂和胡蜂總科中的長腹胡蜂科、鈴腹胡蜂科、異腹胡蜂科、狹腹胡蜂科、馬蜂科、胡蜂科的膜翅目昆蟲進行毒素采集的實驗結(jié)果，說明本發(fā)明中的“冷凍剝離毒囊全面采毒”技術(shù)關(guān)鍵技術(shù)在生物毒素研發(fā)領(lǐng)域中的應(yīng)用和功效。必須說明，本發(fā)明的實施例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)對本發(fā)明進行的簡單改進都屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
[0019]實施例1:胡蜂科金黃虎頭蜂Vespa mandarinia Smith的“冷凍剝離毒囊全面采毒”試驗1.1采集胡蜂毒地點:云南德宏州梁河縣境內(nèi)高山，海拔1382米，林中。蜂體標本據(jù)云南省大理學院藥用特種昆蟲開發(fā)國家地方聯(lián)合工程研究中心毛本勇教授鑒定為Vespamandarinia Smith (金環(huán)胡蜂,又名金黃虎頭蜂)。
[0020]1.2采集胡蜂毒裝置:冷凍劑(液氮)儲藏罐、耐低溫加壓泵及噴頭、低溫手術(shù)室(室溫為4攝氏度的冷屋)、手術(shù)剪、手術(shù)刀、手術(shù)鑷子、棕色玻璃瓶、大鑷子、Tris-Buffer緩沖液。
[0021]1.3采集胡蜂毒方法:穿戴防護服的情況下，將接上耐低溫加壓泵的液氮罐提至蜂巢旁邊，打開長柄噴霧·器的開關(guān)，將液氮對準蜂巢職蜂的出口處噴灑，阻礙職蜂的出洞攻擊。隨著準備出洞的職蜂消失，加大液氮噴淋力度，將噴口堵在蜂巢巢穴出口進行噴淋，大約10分鐘后，蜂巢急劇降溫。至確認無職蜂活動時，逐步打開蜂巢，挑揀已被迅速冷凍的蜂體。將職蜂蜂體在低溫手術(shù)室中進行深度冷凍(浸入液氮中20秒左右)。用手術(shù)剪減去蜂腹(含全部毒囊)，用手術(shù)刀對剖開蜂腹，用手術(shù)鑷子夾出整個毒囊。剝?nèi)ツ覛?，將呈冷凍狀態(tài)的蜂毒顆粒放置入裝有低溫Tris-Buffer緩沖液的棕色瓶中。
[0022]1.4實驗結(jié)果與說明:經(jīng)梅特勒十萬分之一電子天平稱重，采取的523頭職蜂中共獲得蜂毒1472暈克。
[0023]實施例2:胡蜂科金黃虎頭蜂Vespa mandarinia Smith的常規(guī)米毒試驗
[0024]2.1采集胡蜂毒地點:與實施例1.1項下的蜂巢距離為2.1公里處，大小及生長狀態(tài)環(huán)境相似的一窩金黃虎頭蜂。蜂體標本據(jù)云南省大理學院藥用特種昆蟲開發(fā)國家地方聯(lián)合工程研究中心毛本勇教授鑒定為Vespa mandarinia Smith(金環(huán)胡蜂,又名金黃虎頭蜂)。
[0025]2.2采集胡蜂毒裝置:使用本工程研究中心改裝的同一批次的副蓋式蜂毒采集器，木框，長80公分，寬50公分；內(nèi)嵌4片長20公分/寬33公分取毒玻璃；輸入電壓12V,輸出自動間歇脈動電壓。
[0026]2.3采集胡蜂毒方法:將采毒器置于蜂巢前，按照常規(guī)采毒規(guī)程，打開取毒器電源開關(guān)，敲擊地面及蜂巢口，吸引胡蜂出來攻擊蜂毒采集器。30分鐘后，關(guān)閉電源，掃掉不再排毒的金黃虎頭蜂，收集玻璃板上的蜂毒，裝入特制冷凍瓶中，梅特勒十萬分之一電子天平稱重。
[0027]2.4實驗結(jié)果與說 明:本次使用常規(guī)采毒法采集得到的金黃虎頭蜂蜂毒為830毫克。比第一次實施“冷凍剝離毒囊全面采毒”技術(shù)時(實施例1)獲取蜂毒量降低了 43.7% ；差別顯著。本發(fā)明所有實施例都是在嚴格控制變量的基礎(chǔ)上進行的。實施例中各實施之實驗所采取之胡蜂毒均經(jīng)過《藥用特種昆蟲開發(fā)國家地方聯(lián)合工程研究中心》質(zhì)檢室進行HPLC (Agilentl200)指紋圖譜檢測，SDS-PAGE電泳檢測。實施例1和2獲得之胡蜂毒均屬于品質(zhì)相同的金黃虎頭蜂蜂毒。
[0028]實施例3:馬蜂科黃裙馬蜂(Polistes sagittarius Saussure)的常規(guī)采毒與“冷凍剝離毒囊全面采毒”技術(shù)采毒所得蜂毒量的比較試驗
[0029]3.1實驗地點:云南文山州富寧縣。2窩黃裙馬蜂相距1.9公里左右。山林中。蜂體標本經(jīng)云南省大理學院藥用特種昆蟲開發(fā)國家地方聯(lián)合工程研究中心楊自忠教授鑒定為馬蜂科黃裙馬蜂(Polistes sagittarius Saussure)。
[0030]3.2常規(guī)采毒裝置及方法:采集胡蜂毒裝置同實施例2中2.2所述，使用本工程研究中心改裝的同一批次的副蓋式蜂毒采集器，木框，長80公分，寬50公分；內(nèi)嵌4片長20公分/寬33公分取毒玻璃；輸入電壓6V,輸出自動間歇脈動電壓。將米毒器置于蜂巢前，按照常規(guī)采毒規(guī)程，打開取毒器電源開關(guān)，敲擊地面及蜂巢口，吸引胡蜂出來攻擊蜂毒采集器。30分鐘后，關(guān)閉電源，掃掉不再排毒的黃裙馬蜂，收集玻璃板上的蜂毒，裝入特制冷凍瓶中，梅特勒十萬分之一電子天平稱重。得到黃裙馬蜂蜂毒82毫克。
[0031]3.3 “冷凍剝離毒囊全面采毒”技術(shù)采毒裝置及方法:同實施例1。其關(guān)鍵技術(shù)是:用液態(tài)二氧化碳進行速凍噴淋；按照實施例1中1.3所述操作程序收集冷凍后毒囊中的黃裙馬蜂蜂毒，精制后裝入特制冷凍瓶中，梅特勒十萬分之一電子天平稱重。得到黃裙馬蜂蜂毒111暈克。
[0032]3.4實驗結(jié)果與說明:使用“冷凍剝離毒囊全面采毒”技術(shù)采集黃裙馬蜂毒素比常規(guī)采毒法得到的黃裙馬蜂毒素重量高出35.4%。說明使用“冷凍剝離毒囊全面采毒”技術(shù)采集馬蜂科昆蟲毒素有著較大的先進性和實I用性。
[0033]實施例4:鈴腹胡蜂科帶鈴腹胡蜂(Popalidia fasciata Fabricius)的常規(guī)采毒與“冷凍剝離毒囊全面采毒”技術(shù)采毒所得蜂毒量的比較試驗
[0034]4.1實驗地點:云南省文山州廣南縣那倫鄉(xiāng)。2窩帶鈴腹胡蜂相距1.6公里左右。海拔908公尺公路邊山林中。標本經(jīng)云南省大理學院藥用特種昆蟲開發(fā)國家地方聯(lián)合工程研究中心楊自忠教授鑒定為膜翅目鈴腹胡蜂科帶鈴腹胡蜂(Popalidia fasciataFabriciusX
[0035]4.2常規(guī)采毒裝置及方法:采集胡蜂毒裝置同實施例2中2.2所述，使用本工程研究中心改裝的同一批次的副蓋式蜂毒采集器，木框，長80公分，寬50公分；內(nèi)嵌4片長20公分/寬33公分取毒玻璃；輸入電壓6V,輸出自動間歇脈動電壓。將米毒器置于蜂巢前，按照常規(guī)采毒規(guī)程，打開取毒器電源開關(guān)，敲擊地面及蜂巢口，吸引胡蜂出來攻擊蜂毒采集器。30分鐘后，關(guān)閉電源，掃掉不再排毒的帶鈴腹胡蜂，收集玻璃板上的蜂毒，裝入特制冷凍瓶中，梅特勒十萬分之一電子天平稱重。得到帶鈴腹胡蜂蜂毒36毫克。
[0036]4.3 “冷凍剝離毒囊全面采毒”技術(shù)采毒裝置及方法:同實施例1。其關(guān)鍵技術(shù)是:用液態(tài)二氧化碳對帶鈴腹胡蜂蜂巢進行速凍噴淋；按照實施例1中1.3所述操作程序收集冷凍后帶鈴腹胡蜂毒囊中的蜂毒，精制后裝入特制冷凍瓶中，梅特勒十萬分之一電子天平稱重。得到帶鈴腹胡蜂蜂毒51毫克。
[0037]4.4實驗結(jié)果與說明:使用“冷凍剝離毒囊全面采毒”技術(shù)采集帶鈴腹胡蜂毒素比常規(guī)采毒法得到的帶鈴腹胡蜂毒素重量高出41.7%。說明使用“冷凍剝離毒囊全面采毒”技術(shù)采集鈴腹胡蜂科昆蟲毒素有著較大的先進性和實用性。
[0038]實施例5:異腹胡蜂科變側(cè)異腹胡蜂(Parapolybia varia varia Fabricius)的常規(guī)采毒與“冷凍剝離毒囊全面采毒”技術(shù)采毒所得蜂毒量的比較試驗
`[0039]5.1實驗地點:云南省文山州麻栗坡縣。2窩變側(cè)異腹胡蜂相距2.1公里左右。海拔690~720公尺公路邊山林中。蜂體標本經(jīng)云南省大理學院藥用特種昆蟲開發(fā)國家地方聯(lián)合工程研究中心楊自忠教授鑒定為膜翅目異腹胡蜂科變側(cè)異腹胡蜂(Parapolybia variavaria Fabricius)。
[0040]5.2常規(guī)采毒裝置及方法:采集胡蜂毒裝置同實施例2中2.2所述，使用本工程研究中心改裝的同一批次的副蓋式蜂毒采集器，木框，長80公分，寬50公分；內(nèi)嵌4片長20公分/寬33公分取毒玻璃；輸入電壓6V,輸出自動間歇脈動電壓。將米毒器置于蜂巢前，按照常規(guī)采毒規(guī)程，打開取毒器電源開關(guān)，敲擊地面及蜂巢口，吸引胡蜂出來攻擊蜂毒采集器。30分鐘后，關(guān)閉電源，掃掉不再排毒的變側(cè)異腹胡蜂，收集玻璃板上的蜂毒，裝入特制冷凍瓶中，梅特勒十萬分之一電子天平稱重。得到變側(cè)異腹胡蜂蜂毒65毫克。
[0041]5.3 “冷凍剝離毒囊全面采毒”技術(shù)采毒裝置及方法:同實施例1。其關(guān)鍵技術(shù)是:用液態(tài)二氧化碳對變側(cè)異腹胡蜂蜂巢進行速凍噴淋；按照實施例1中1.3所述操作程序收集冷凍后變側(cè)異腹胡蜂毒囊中的蜂毒，精制后裝入特制冷凍瓶中，梅特勒十萬分之一電子天平稱重。得到變側(cè)異腹胡蜂蜂毒91毫克。
[0042]5.4實驗結(jié)果與說明:得到實驗結(jié)果顯示，使用“冷凍剝離毒囊全面采毒”技術(shù)采集變側(cè)異腹胡蜂毒素比常規(guī)采毒法得到的變側(cè)異腹胡蜂毒素重量高出40.0%。說明使用“冷凍剝離毒囊全面采毒”技術(shù)采集異腹胡蜂科昆蟲毒素有著較大的先進性和實用性。
[0043]實施例6:狹腹胡蜂科光全狹腹胡蜂(Holischnogaster micans Saussure)的常規(guī)采毒與“冷凍剝離毒囊全面采毒”技術(shù)采毒所得蜂毒量的比較試驗
[0044]6.1實驗地點:云南省孟連縣勐馬鎮(zhèn)。2窩光全狹腹胡蜂相距2.2公里左右。海拔961~990公尺鄉(xiāng)村道路路邊山林中。蜂體標本經(jīng)云南省大理學院藥用特種昆蟲開發(fā)國家地方聯(lián)合工程研究中心郭云膠教授鑒定為膜翅目狹腹胡蜂科光全狹腹胡蜂(Holischnogaster micans Saussure)。
[0045]6.2常規(guī)采毒裝置及方法:采集胡蜂毒裝置同實施例2中2.2所述，使用本工程研究中心改裝的同一批次的副蓋式蜂毒采集器，木框，長80公分，寬50公分；內(nèi)嵌4片長20公分/寬33公分取毒玻璃；輸入電壓6V,輸出自動間歇脈動電壓。將米毒器置于蜂巢前，按照常規(guī)采毒規(guī)程，打開取毒器電源開關(guān)，敲擊地面及蜂巢口，吸引光全狹腹胡蜂出來攻擊蜂毒采集器。30分鐘后，關(guān)閉電源，掃掉不再排毒的光全狹腹胡蜂，收集玻璃板上的蜂毒，裝入特制冷凍瓶中，梅特勒十萬分之一電子天平稱重。得到光全狹腹胡蜂蜂毒23毫克。
[0046]6.3 “冷凍剝離毒囊全面采毒”技術(shù)采毒裝置及方法:同實施例1。其關(guān)鍵技術(shù)是:用液氮對光全狹腹胡蜂蜂巢進行速凍噴淋；按照實施例1中1.3所述操作程序收集冷凍后光全狹腹胡蜂毒囊中的蜂毒，精制后裝入特制冷凍瓶中，梅特勒十萬分之一電子天平稱重。得到光全狹腹胡蜂蜂毒32毫克。
[0047]6.4實驗結(jié)果與說明 :使用“冷凍剝離毒囊全面采毒”技術(shù)采集光全狹腹胡蜂毒素比常規(guī)采毒法得到的光全狹腹胡蜂毒素重量高出39.1%。說明使用“冷凍剝離毒囊全面采毒”技術(shù)采集狹腹胡蜂科昆蟲毒素有著較大的先進性和實用性。
[0048]實施例7:意大利密蜂(Apis mellifera ligustica Spinola)的常規(guī)采毒與“冷凍剝離毒囊全面采毒”技術(shù)采毒所得蜂毒量的比較試驗
[0049]7.1實驗地點:云南省曲靖市羅平縣。2窩意大利蜜蜂相距3公里左右。海拔955~968公尺鄉(xiāng)村道路路邊油菜花地中。蜂體標本經(jīng)云南省大理學院藥用特種昆蟲開發(fā)國家地方聯(lián)合工程研究中心毛本勇教授鑒定為膜翅目意大利蜜蜂(Apis mellifera ligusticaSpinolaX
[0050]7.2常規(guī)采毒裝置及方法:采集蜜蜂毒裝置同實施例2中2.2所述，使用本工程研究中心改裝的同一批次的副蓋式蜂毒采集器，木框，長80公分，寬50公分；內(nèi)嵌4片長20公分/寬33公分取毒玻璃；輸入電壓3V,輸出自動間歇脈動電壓。將米毒器置于意大利蜜蜂蜂巢前，按照常規(guī)采毒規(guī)程，打開取毒器電源開關(guān)，敲擊蜂巢，吸引蜜蜂出來攻擊蜂毒采集器。30分鐘后，關(guān)閉電源，掃掉不再排毒的意大利蜜蜂，收集玻璃板上的蜂毒，裝入特制冷凍瓶中，梅特勒十萬分之一電子天平稱重。得到蜜蜂蜂毒26毫克。
[0051]7.3 “冷凍剝離毒囊全面采毒”技術(shù)采毒裝置及方法:同實施例1。其關(guān)鍵技術(shù)是:用液氮對意大利蜜蜂蜂巢進行速凍噴淋；按照實施例1中1.3所述操作程序收集冷凍后意大利蜜蜂毒囊中的蜂毒，精制后裝入特制冷凍瓶中，梅特勒十萬分之一電子天平稱重。得到蜜蜂蜂毒35毫克。
[0052]7.4實驗結(jié)果與說明:使用“冷凍剝離毒囊全面采毒”技術(shù)采集意大利蜜蜂毒素比常規(guī)采毒法得到的意大利蜜蜂毒素重量高出34.6%。說明使用“冷凍剝離毒囊全面采毒”技術(shù)采集蜜蜂總科昆蟲毒素有著較大的先進性和實用性。[0053]在上述說明書闡述本發(fā)明時，同時提供了實施例的目的是舉例說明本發(fā)明的實際操作過程和本發(fā)明的意義。在進入本發(fā)明權(quán)利要求和其等同物范圍內(nèi)時，本發(fā)明的實際應(yīng)用包括所有一般變化、配合·，或改進。
【權(quán)利要求】
1.一種獲取毒素類活性物質(zhì)的方法；其特征是:該類活性物質(zhì)是從冷凍條件下的膜翅目細腰亞目針尾部蜂類昆蟲體內(nèi)的毒囊中取出的；其中，膜翅目細腰亞目針尾部蜂類昆蟲是指膜翅目Hymenoptera中的細腰亞目Apocrita之針尾部Aculeata的胡蜂總科Vespoidea、泥蜂總科Sphecoidea、蜜蜂總科Apoidea昆蟲。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于冷凍條件是指用或低于攝氏零下20度的冷凍劑對膜翅目細腰亞目針尾部蜂類昆蟲的蜂巢和蟲體進行直接冷凍，從而使蟲體喪失活動能力，避免了對取毒人的攻擊而得以實現(xiàn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征為所述的冷凍劑是指工業(yè)制冷劑液態(tài)二氧化碳、干冰、液氮、液氦中的一種或多種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一的方法，其特征為所述的毒素類活性物質(zhì)是在使用冷凍劑噴灌、噴淋、澆灌形式對膜翅目細腰亞目針尾部蜂類昆蟲的巢穴進行冷凍后，將巢穴打開，對已經(jīng)冷凍的蟲體毒囊進行摘取分離而得到的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一的方法，其特征為所述的膜翅目細腰亞目針尾部蜂類昆蟲是指胡蜂總科中的長腹胡蜂科、鈴腹胡蜂科、異腹胡蜂科、狹腹胡蜂科、馬蜂科、胡蜂科的膜翅目昆蟲。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一的方法，其特征為所述的膜翅目細腰亞目針尾部蜂類昆蟲是指蜜蜂總科中的中華蜜蜂、意大利蜂、東北黑蜂、伊犁黑蜂、卡尼鄂拉蜂、高加索蜂。
【文檔編號】A01K59/00GK103655630SQ201310624443
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月28日
【發(fā)明者】趙昱, 趙婉宸, 江滇, 郭云膠, 劉建平 申請人:大理學院