一種以川貝母根為外植體的川貝母愈傷組織的培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種以川貝母根為外植體的川貝母愈傷組織的培養(yǎng)方法，該方法以川貝母根尖為外植體成功誘導出有效組份含量高的川貝母愈傷組織，并完成了川貝母愈傷組織的快速增殖培養(yǎng)，該方法不僅為利用生物技術大規(guī)模生產(chǎn)川貝母有效成分提供了一種新途徑，也可在一定程度上解決川貝母藥材資源短缺的問題，滿足藥材市場對川貝母有效組份的需求。
【專利說明】一種以川貝母根為外植體的川貝母愈傷組織的培養(yǎng)方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種川貝母愈傷組織的培養(yǎng)方法，特別是涉及一種以川貝母根為外植體的川貝母愈傷組織的培養(yǎng)方法。
【背景技術】
[0002]川貝母(Fritillariacirrhosa D.Don)是百合科植物，生長在海拔3500m—4500m的高度，主產(chǎn)于四川、西藏、云南等省區(qū)。川貝母具有清熱潤肺，化痰止咳之功效，用于肺熱燥咳，干咳少痰，陰虛勞嗽，咯痰帶血等癥狀，是稀有的治療咳嗽等的良藥。由于川貝母價格昂貴，加之近年來無計劃盲目的采挖，自然資源日趨枯竭，預計在近幾十年內(nèi)也難以緩解。組織培養(yǎng)技術生長周期短，繁殖率高，擺脫了大自然中四季、晝夜的變化以及災害性氣候的不利影響，且條件均一，對植物生長極為有利，便于穩(wěn)定地進行周年培養(yǎng)生產(chǎn)，因此應用組織培養(yǎng)的方法進行川貝母快速繁殖是解決川貝母藥材資源短缺問題的有效方法之一。
[0003]根據(jù)2010年藥典規(guī)定，川貝母植物的入藥部位是其生長在地下部分的鱗莖。我們利用分光光度法測定了生長三年的野生川貝母植株的鱗莖和根器官中的總生物堿含量發(fā)現(xiàn)，根中的總生物堿含量為0.071%,比鱗莖中的總生物堿含量0.068%還稍高。但目前在川貝母植物的組織培養(yǎng)方面，還未見有采用川貝母植物根為外植體的愈傷組織誘導培養(yǎng)方法的報道，分析原因，一方面是因為川貝母植物的根器官存在取材和保存方面的問題；另一方面則是因為在無菌培養(yǎng)過程中，植物根器官存在著消毒和快速脫分化的技術難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

`[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種以川貝母根為外植體的川貝母愈傷組織的培養(yǎng)方法。
[0005]為達到上述目的，本發(fā)明采用的解決方案包括如下步驟:
[0006](I)外植體的選擇和消毒處理:切取生長二年以上的川貝母植株上的根，先用濃度為0.02%~0.05%的升汞溶液沖洗干凈，然后置于15~20°C的條件下陰干3~6小時，再在超凈臺上，用配制的升汞溶液消毒處理3~6min，所述配制的升汞溶液是按每100ml濃度為0.1%升汞溶液中滴加0.5~1.0ml濃度為0.3~0.5%的聚乙二醇辛基苯基醚溶液配制的;
[0007](2)愈傷組織的誘導培養(yǎng):切取步驟(1)中已消毒的川貝母根尖0.5~2cm的長度，接入改良的MS+2iP0.5~1.5mg ? I^+NAA0.3~1.0mg ? I71+頭孢曲松鈉200~SOOmg-T1+香蕉汁100~300mg -T1的愈傷組織誘導培養(yǎng)基中，在溫度為10~18°C、每天光照4~10小時和光照強度為1500~20001x的條件下進行培養(yǎng)，所述改良的MS基本培
養(yǎng)基為硝酸氨含量減半的MS基本培養(yǎng)基；
[0008](3)愈傷組織的增殖培養(yǎng):選取步驟(2)中培養(yǎng)的質(zhì)地較緊密和顏色為白色的愈傷組織，切成0.3~1.0cm3的大小后轉接入B5+2, 4_D1.0~4.0mg.!^+KT0.1~1.0mg.L-1+多效唑0.5~2.0mg -r1+活性炭1.0~2.0mg -L^1的增殖培養(yǎng)基中，在溫度為15~22°C、每天光照2~5小時和光照強度為300~6001x的條件下進行愈傷組織的增殖培養(yǎng)；[0009]上述所有培養(yǎng)基的pH值為5.6~6.5、蔗糖35~45g.L'瓊脂5.0~6.0g.L'
[0010]上述步驟(1)中所選擇的根的直徑為2~4mm。
[0011]上述步驟(2)中所述川貝母根尖以平放方式接入愈傷組織誘導培養(yǎng)基中。
[0012]本發(fā)明選取生長二年生以上的川貝母植株上的根為外植體，經(jīng)有效消毒處理后，培育出有效成分含量高的愈傷組織，并完成了愈傷組織的快速增殖培養(yǎng)，該方法不僅為利用生物技術大規(guī)模生產(chǎn)川貝母有效成分提供了一種新途徑，也可在一定程度上解決川貝母藥材資源短缺的問題，同時也可對野生川貝母資源起到一定的保護作用。
【具體實施方式】
[0013]實施例1
[0014](I)外植體的選擇和消毒處理:切取生長二年以上的川貝母植株上直徑為2mm的根，先用濃度為0.02%的升汞液將根表面沖洗干凈，然后置于15°C的條件下陰干3小時，再放在超凈臺上，用按每100ml濃度為0.1%的升汞溶液中滴加0.5ml濃度為0.3%的聚乙二醇辛基苯基醚溶液配制的升萊溶液消毒處理3min,最后用無菌水洗3次；
[0015](2)愈傷組織的誘導培養(yǎng):切取步驟(1)中已消毒的川貝母根尖0.5cm的長度，以平放方式接入硝酸氨含量減半的改良MS+2iP0.5mg ? L^+NAA0.3mg ? L—1+頭孢曲松鈉200mg ? r1+香蕉汁IOOmg ? L—1的愈傷組織誘導培養(yǎng)基中，在溫度10°C、每天光照4小時和光照強度為15001x的條件下培養(yǎng)30天，統(tǒng)計其愈傷組織的誘導率為67.49%，外植體的染菌率 19.59% ；
[0016](3)愈傷組織的增殖培養(yǎng):選取步驟(2)中培養(yǎng)的質(zhì)地較緊密和顏色為白色的愈傷組織，切成 0.3cm3 大小后轉接入 B5+2, 4-D1.0mg ? I^+KT0.1mg ? I71+ 多效唑 0.5mg ? I71+活性炭1.0mg ? L—1的增殖培養(yǎng)基中，在溫度15°C、每天光照2小時和光照強度為3001x的條件下培養(yǎng)30天，其愈傷組織的增殖倍數(shù)為2.04倍，且增殖的愈傷組織生長健康、無褐化和玻璃化現(xiàn)象產(chǎn)生；
[0017]上述所有培養(yǎng)基的pH值為6.0、蔗糖40g ? L'瓊脂5.5g ? L'
[0018]實施例2
[0019](I)外植體選擇和消毒處理:切取生長二年以上的川貝母植株上直徑為4mm的根，先用濃度為0.03%的升萊液將根表面沖洗干凈，然后放在18°C的條件下陰干4小時,再放在超凈臺上，用按每100ml濃度為0.1%的升汞溶液中滴加0.7ml濃度為0.4%的聚乙二醇辛基苯基醚溶液配制的升萊溶液消毒處理5min,最后用無菌水洗5次；
[0020](2)愈傷組織的誘導培養(yǎng):切取步驟(1)中已消毒的川貝母根尖1.5cm的長度，以平放方式接入硝酸氨含量減半的改良MS+2iP1.0mg ? L^+NAA0.6mg ? L—1+頭孢曲松鈉300mg ? r1+香蕉汁200mg ? L—1的愈傷組織誘導培養(yǎng)基中，在溫度15°C、每天光照6小時和光照強度為18001x的條件下培養(yǎng)30天，統(tǒng)計其愈傷組織的誘導率為85.41%，外植體的染菌率為0% ；
[0021](3)愈傷組織的增殖培養(yǎng):選取步驟(2)中培養(yǎng)的質(zhì)地較緊密和顏色為白色的愈傷組織，切成 1.0cm3 的大小后轉接入 B5+2，4-D3.0mg.171+KT0.5mg.171+ 多效唑 1.0mg.171+活性炭1.5mg ? L—1的培養(yǎng)基中，在溫度18°C、每天光照3小時和光照強度為4001x的條件下培養(yǎng)30天，其愈傷組織的增殖倍數(shù)為3.26倍，且增殖的愈傷組織生長健康、無褐化和玻璃化現(xiàn)象產(chǎn)生；
[0022]上述所有培養(yǎng)基的pH值為6.0、蔗糖40g ? L_\瓊脂5.5g ? L'
[0023]實施例3
[0024](I)外植體的選擇和消毒處理:切取生長二年以上的川貝母植株上直徑為4mm的根，先用濃度為0.05%的升萊液將根表面沖洗干凈，然后放在20°C的條件下陰干6小時,再放在超凈臺上，用按每100ml濃度為0.1%的升汞溶液中滴加Iml濃度為0.5%的聚乙二醇辛基苯基醚溶液配制的升萊溶液消毒處理6min,最后用無菌水洗5次；
[0025](2)愈傷組織的誘導培養(yǎng):切取步驟(1)中已消毒的川貝母根尖2cm的長度，以平放方式接入硝酸氨含量減半的改良MS+2iPl.5mg ? L^+NAAl.0mg ? L—1+頭孢曲松鈉SOOmg-T1+香蕉汁300mg -T1的愈傷組織誘導培養(yǎng)基中，在溫度18°C、每天光照10小時和光照強度為20001x的條件下培養(yǎng)30天，統(tǒng)計其愈傷組織的誘導率為84.82%，外植體的染菌率為0% ；
[0026](3)愈傷組織的增殖培養(yǎng):選取步驟(2)中培養(yǎng)的質(zhì)地較緊密和顏色為白色的愈傷組織，切成 1.0cm3 的大小后轉接入 B5+2，4-D4.0mg.171+KTl.0mg.171+ 多效唑 2.0mg.171+活性炭2.0mg ? L—1的培養(yǎng)基中，在溫度22°C、每天光照5小時和光照強度為6001x的條件下培養(yǎng)30天，其愈傷組織的增殖倍數(shù)為3.09倍；增殖的愈傷組織無褐化，但有10.34%的愈傷組織有輕微的玻璃化現(xiàn)象產(chǎn)生；
[0027]上述所有培養(yǎng)基的pH值為6.0、蔗糖40g ? L_\瓊脂5.5g ? L' [0028]實施例4
[0029]將實施例2步驟(1)中選取的川貝母根的直徑改為2mm，其它步驟同實施例2，培養(yǎng)30天后，愈傷組織的誘導率78.62%，外植體的染菌率為0%。
[0030]實施例5
[0031]將實施例2步驟(1)中所述“用按每100ml濃度為0.1%的升汞溶液中滴加0.7ml濃度為0.4%的聚乙二醇辛基苯基醚溶液配制的升汞溶液消毒處理5min”改為“用按每100ml濃度為0.1%的升汞溶液中滴加1.0ml濃度為0.5%的聚乙二醇辛基苯基醚溶液配制的升汞溶液消毒處理6min”，其它步驟同實施例2，培養(yǎng)30天后，愈傷組織的誘導率80.42%，外植體的染菌率也為0%。
[0032]實施例6
[0033]將實施例2步驟(1)中所述“在每100ml的0.1%的升汞溶液中滴加0.7ml濃度為
0.4%的聚乙二醇辛基苯基醚溶液進行消毒處理5min”改為“在每100ml的0.1%的升汞溶液中滴加0.5ml濃度為0.3%的聚乙二醇辛基苯基醚溶液進行消毒處理3min”其它步驟同實施例2，培養(yǎng)30天后，愈傷組織的誘導率82.42%，外植體的染菌率也為17.59%。
[0034]實施例7
[0035]將實施例2步驟(2)中所切取的川貝母根尖的長度改為0.5cm，其它步驟同實施例2，培養(yǎng)30天后，愈傷組織的誘導率70.12%，外植體的染菌率為0% ；
[0036]實施例8
[0037]在實施例2步驟(2)中，將切取的川貝母根尖以豎直插入的方式接入培養(yǎng)基中，其它步驟同實施例2，培養(yǎng)30天后，愈傷組織的誘導率50.38%。
[0038]實施例9[0039]將實施例2步驟(2)中愈傷組織誘導培養(yǎng)基改為改良MS+2iP0.5mg ? L^+NAA0.3mg ? I71+ 頭孢曲松鈉 200mg ? I71+ 香蕉汁 IOOmg ? L—1，其它步驟同實施例2，培養(yǎng)30天后，愈傷組織的誘導率80.72%。
[0040]實施例10
[0041]將實施例2步驟(3)中愈傷組織改切成0.5cm3的大小，其它步驟同實施例2，增殖培養(yǎng)30天，其愈傷組織的增殖倍數(shù)為2.38倍。
[0042]實施例11
[0043]將實施例2步驟(3)中愈傷組織的增殖培養(yǎng)基改為B5+2, 4-D1.0mg ? I^+KTl.0mg ? I71+ 多效唑 0.5mg ? I71+ 活性炭 1.0mg ? L—1，其它步驟同實施例2，增殖培養(yǎng)30天，其愈傷組織的增殖倍數(shù)為2.15倍。
[0044]實施例12
[0045]將實施例2步驟(3)中愈傷組織的增殖培養(yǎng)條件改為:在溫度15°C，每天光照2小時和光照強度為光照6001x的條件下培養(yǎng)30天，其它步驟同實施例2，其愈傷組織的增殖倍數(shù)為2.98倍。
[0046]比較實施例1
[0047]在實施例2步驟(1)中，改選為生長一年的川貝母植株上直徑為1.3mm以下的根，其它步驟同實施例2，培養(yǎng)30天后，其愈傷組織的誘導率為20.45%。
[0048]比較實施例2·[0049]在實施例2的步驟(1)中，取消把川貝母根尖放在18 °C的遮光條件下陰干4小時這一環(huán)節(jié)，其它步驟同實施例2，外植體的染菌率為27.62%。
[0050]比較實施例3
[0051]在實施例2步驟(1)中,取消用升汞沖洗、以及取消在升汞溶液中滴加聚乙二醇辛基苯基醚，其它步驟同實施例2，培養(yǎng)30天后，外植體的染菌率為40.69%。
[0052]比較實施例4
[0053]將實施例2步驟(2)中愈傷組織的誘導培養(yǎng)改為MS+2iP0.5mg -L^1+NAA0.3mg -L^1,其它步驟同實施例2，培養(yǎng)30天后，愈傷組織的誘導率為48.34%。
[0054]比較實施例5
[0055]將實施例2步驟(2)中愈傷組織的誘導培養(yǎng)條件該為:溫度30°C，每天光照14小時，光照強度為30001x，其它步驟同實施例2，培養(yǎng)30天后，愈傷組織的誘導率為53.32%。
[0056]比較實施例6
[0057]在實施例2步驟(3)中，改選質(zhì)地較疏松和顏色為無色的愈傷組織進行增殖培養(yǎng)，其它步驟同實施例2，培養(yǎng)30天后，愈傷組織的增殖倍數(shù)1.72倍，且增殖的愈傷組織出現(xiàn)了較嚴重的玻璃化現(xiàn)象。
[0058]比較實施例7
[0059]將實施例2步驟(3)中的培養(yǎng)基該為B5+2，4-D0.5mg ? L_i+6BA3.0mg ? L—1，其它步驟同實施例2，培養(yǎng)30天后，愈傷組織的增殖倍數(shù)為1.96倍。
【權利要求】
1.一種以川貝母根為外植體的川貝母愈傷組織的培養(yǎng)方法，其特征在于包括如下步驟: (1)外植體的選擇和消毒處理:切取生長二年以上的川貝母植株上的根，先用濃度為0.02%~0.05%的升汞溶液沖洗干凈，然后置于15~20°C的條件下陰干3~6小時，再在超凈臺上，用配制的升汞溶液消毒處理3~6min，所述配制的升汞溶液是按每100ml濃度為0.1%升汞溶液中滴加0.5~1.0ml濃度為0.3~0.5%的聚乙二醇辛基苯基醚溶液配制的； (2)愈傷組織的誘導培養(yǎng):切取步驟(1)中已消毒的川貝母根尖0.5~2cm的長度，接入改良的 MS+2iP0.5 ~1.5mg ? I^+NAA0.3 ~1.0mg ? I71+ 頭孢曲松鈉 200 ~500mg ? I71+香蕉汁100~300mg -r1的愈傷組織誘導培養(yǎng)基中，在溫度為10~18°C、每天光照4~10小時和光照強度為1500~20001x的條件下進行培養(yǎng)，所述改良的MS基本培養(yǎng)基為硝酸氨含量減半的MS基本培養(yǎng)基； (3)愈傷組織的增殖培養(yǎng):選取步驟(2)中培養(yǎng)的質(zhì)地較緊密和顏色為白色的愈傷組織，切成 0.3 ~1.0cm3 的大小后轉接入 B5+2, 4-D1.0 ~4.0mg.!^+KT0.1 ~1.0mg.L-1+ 多效唑0.5~2.0mg ? L—1+活性炭1.0~2.0mg ? L—1的增殖培養(yǎng)基中，在溫度為15~22°C、每天光照2~5小時和光照強度為300~6001x的條件下進行愈傷組織的增殖培養(yǎng)； 上述所有培養(yǎng)基的pH值為5.6~6.5、蔗糖35~45g ? L-1、瓊脂5.0~6.0g ? L-1。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種以川貝母根為外植體的川貝母愈傷組織的培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(1)中所選擇的根的直徑為2~4mm。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種以川貝母根為外植體的川貝母愈傷組織的培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(2)中所述川貝母根尖以平放方式接入愈傷組織誘導培養(yǎng)基中。
【文檔編號】A01H4/00GK103621406SQ201310632796
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年11月27日 優(yōu)先權日:2013年11月27日
【發(fā)明者】王躍華, 劉濤, 范文萍, 楊敏, 江明殊, 郭翠平, 何詩虹, 王曉蓉, 李睿玉, 許志強, 王磊 申請人:成都大學