一株抑制真菌的解淀粉芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種解淀粉芽孢桿菌（Bacillus?amyloliquefaciens）KB，保藏號為CGMCC?No.8179。所述解淀粉芽孢桿菌KB對桃采后褐腐病菌、蘋果采后灰霉病菌、西紅柿采后灰霉病菌和蘋果采后青霉病菌具有抑制作用；對桃采后褐腐病、蘋果采后灰霉病、西紅柿采后灰霉病、蘋果采后青霉病具有抑制作用。對桃褐腐病菌和蘋果灰霉病菌的抑制作用最明顯，抑菌圈直徑分別為22mm和20mm，對桃褐腐病斑及蘋果灰霉病病斑的抑制率達到100%。
【專利說明】一株抑制真菌的解淀粉芽孢桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]一種抑制真菌的解淀粉芽孢桿菌及其應(yīng)用，屬于微生物應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]植物真菌病害給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大損失，而果實采后真菌病害是一類重要的病害，造成了果實的大量減產(chǎn)，嚴重影響果實的食用價值和市場價值，導(dǎo)致了果農(nóng)的經(jīng)濟收入降低。在發(fā)達國家，果實采摘后病害引起的損失量占果實總量的15%以上，在發(fā)展中國家由于缺少必要的防控技術(shù)和設(shè)備，果實采摘后病害引起的損失量占總量的30%以上。果實采摘后病害的發(fā)生已給現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)尤其是高端果蔬產(chǎn)品的生產(chǎn)與加工造成了嚴重影響。
[0003]由Monilinia spp.病原真菌引起的桃褐腐病目前在世界范圍內(nèi)都是桃子的第一大病害，也是影響桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的第一大問題。據(jù)統(tǒng)計，在發(fā)達國家如美國、以色列、意大利、法國等，采后褐腐病導(dǎo)致的損失量就占桃總產(chǎn)量的10%_30%;在發(fā)展中國家由于缺少必要的防治技術(shù)和相關(guān)設(shè)備，其損失量達30%-50%，甚至更高。有些地區(qū)，桃褐腐病的大面積嚴重發(fā)生，幾乎導(dǎo)致桃果絕收。因此，對桃褐腐病的防治和控制顯得更加迫切和重要。我國桃園面積超過900萬畝，是世界上桃有效種植面積第一大國；年產(chǎn)桃超過40萬噸，是世界上桃產(chǎn)量第一大國。北京桃產(chǎn)量位居國內(nèi)前8名，僅北京平谷一地，桃種植面積就達22萬畝(1.47萬公頃)之多。桃產(chǎn)業(yè)已成為平谷縣的經(jīng)濟支柱產(chǎn)業(yè)，一些桃子及相關(guān)加工產(chǎn)品已經(jīng)出口到歐盟、日本等國家。2000年以來北京桃褐腐病大面積增加，且逐年加重；其中2005年發(fā)病較重的桃園，桃果受害，大量脫落，采摘時未見顯癥的果實，在采摘后2-3天，50%以上的果實因褐腐病侵染而腐爛，這給果農(nóng)造成嚴重的經(jīng)濟損失。2012年北京市植保站桃褐腐病調(diào)查結(jié)果顯示，北京各郊區(qū)縣桃產(chǎn)區(qū)均有桃褐腐病發(fā)生，而且桃子在采后的運輸和貯藏期間發(fā)病率都在30%以上。這大大降低了果實的食用價值和市場價值，嚴重影響了北京桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此對桃采后褐腐病的有效防控與經(jīng)濟發(fā)展尤其是與果農(nóng)的經(jīng)濟收入有著緊密聯(lián)系。
[0004]目前生產(chǎn)中對桃褐腐病的防治仍然以化防為主，但由此帶來的“3R”負面影響非常嚴重?；瘜W(xué)農(nóng)藥的大量使用嚴重破壞了生態(tài)環(huán)境，導(dǎo)致桃果實中大量的農(nóng)藥殘留，影響人們身體健康。在北方桃產(chǎn)區(qū)，在桃子的采摘之前及采摘之后，對桃褐腐病的防治手段同樣也是以化學(xué)農(nóng)藥為主，這不僅影響人民的身體健康，也限制了桃產(chǎn)品的加工與出口。我國已將發(fā)展生物農(nóng)藥和綠色食品列入了《中國21世紀議程》，北京現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技城的建設(shè)要求北京市及周邊地區(qū)作物病害實現(xiàn)綠色防控、農(nóng)業(yè)產(chǎn)品實行綠色生產(chǎn)。
[0005]芽孢桿菌(Bacillus spp.)在土壤中普遍存在，是存在于土壤和植物微生態(tài)系統(tǒng)中的優(yōu)勢微生物種群之一，由于產(chǎn)生內(nèi)生芽孢，具有較強的抵抗外界環(huán)境壓力的能力，能夠抵抗所生存的環(huán)境中因干燥、熱和紫外輻射所造成的傷害，維持自身生存能力不受影響。這個生物學(xué)特征使芽孢桿菌具有非常良好的應(yīng)用前景，特別是在使用活菌制劑的生物制品中表現(xiàn)出強大的生命力。芽孢桿 菌種類繁多，數(shù)量巨大，能夠產(chǎn)生多種多樣的生理活性物質(zhì)和代謝產(chǎn)物，具有廣泛的工業(yè)應(yīng)用前景。[0006]解淀粉芽孢桿菌在自然界中分布十分廣闊，目前尚未有防治桃褐腐病的解淀粉芽孢桿菌的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens),菌株 KB，保藏號為 CGMCC N0.8179。
[0008]本發(fā)明的目的也在于提供一種病原菌抑制劑，其活性成分為上述解淀粉芽孢桿菌和/或其代謝物。
[0009]本發(fā)明的目的也在于提供一種病害抑制劑，其活性成分為上述解淀粉芽孢桿菌和/或其代謝物。
[0010]本發(fā)明所提供的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)的菌株號為KB,其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC N0.8179。
[0011]所述述解淀粉芽抱桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)KB 的 16S rDNA 序列 SEQID N0.1 所示。
[0012]所述解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) KB的形態(tài)學(xué)特征為:菌體細胞呈短桿狀，直或近直，芽孢中生，柱狀或橢圓形，具有運動性；在LB培養(yǎng)基上不產(chǎn)色素，菌落為白色不透明，扁平或圓形，無光澤，隨著培養(yǎng)時間增長，菌落變厚變干，邊緣不整齊，菌落上有裙皺，變?yōu)槿橹?。所述解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) KB的生理生化特征為革蘭氏染色陽性，形成菌膜，甲基紅、硝酸鹽還原、乙酰甲基甲醇、吲哚反應(yīng)、接觸酶陽性，可水解明膠、尿素、纖維素、淀粉和七葉苷，氧化酶反應(yīng)、分解酪氨酸陰性，產(chǎn)生硫化氫，利用檸檬酸鹽，不利用丙二酸鹽，精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸脫羧酶反應(yīng)陽性，苯丙氨酸脫氨酶反應(yīng)陰性，葡萄糖、蔗糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，可利用葡萄糖、麥芽糖、山梨醇、鼠李糖、菊糖、半乳糖、肌醇、木糖、甘露糖、甘露醇、核糖、蔗糖等，不利用阿拉伯糖和山梨糖。所述解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) KB于含有1%_7% (質(zhì)量含量)氯化鈉的培養(yǎng)基中均可正常生長，于含有10% (質(zhì)量含量)氯化鈉的培養(yǎng)基中不可生長，于pH4.5-9.0的培養(yǎng)基中均可正常生長，在PH4.0下生長勢弱，pH9.5下不可生長，在環(huán)境溫度為4°C下生長勢弱，在55°C -80°C下處理15min，仍可正常生長。所述解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens) KB產(chǎn)嗜鐵素、纖維素酶、蛋白酶和幾丁質(zhì)酶，這些都是生防菌的關(guān)鍵性生防指標。
[0013]本發(fā)明的目的還在于提供上述解淀粉芽孢桿菌和/或其代謝物在抑制病原菌、制備病原菌抑制劑、抑制病害、制備病害抑制劑中的應(yīng)用。
[0014]所述病原菌為下述至少一種:
[0015]A、桃采后褐腐病菌；
[0016]B、蘋果采后灰霉病菌；
[0017]C、西紅柿米后灰霉病囷；
[0018]D、平果米后青霉病囷；
[0019]所述病害為下述至少一種:
[0020]A、桃采后褐腐?。?br> [0021 ] B、平果米后灰霉??；[0022]C、西紅柿采后灰霉?。?br> [0023]D、蘋果米后青霉病。
[0024]其中，所述桃米后褐腐病菌可為Monilinia fructicola或Monilinia Iaxa或Monilinia fructigena ;所述蘋果采后灰霉病菌為Botrytis cinerea ;所述西紅柿采后灰霉病菌為Botrytis cinerea ;所述蘋果采后青霉病菌為Penicillium expansum。
[0025]所述解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) KB的代謝物可從所述解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) KB的發(fā)酵液中獲得。
[0026]所述解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) KB的代謝物具體可按照如下方法制備:在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)KB,除去液體培養(yǎng)物(發(fā)酵液)中的所述解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)KB即得到所述解淀粉芽孢桿菌的代謝物。
[0027]本發(fā)明中的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) KB對桃采后褐腐病囷、平果米后灰霉病囷、西紅柿米后灰霉病囷和平果米后青霉病囷具有抑制作用；對桃米后揭腐病、平果米后灰霉病、西紅柿米后灰霉病、平果米后青霉病具有抑制作用。對所選擇的植物病原真菌中，對桃褐腐病菌和蘋果灰霉病菌的抑制作用最明顯，抑菌圈直徑分別為22mm和20mm，對桃褐腐病斑及蘋果灰霉病病斑的抑制率達到100%。說明解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) KB具有穩(wěn)定、高效、廣譜的抗菌性能。
[0028]生物材料保藏說明
[0029]分類命名:解淀粉芽抱桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)
[0030]菌株編號:KB
[0031]保藏機構(gòu):中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心
[0032]保藏機構(gòu)簡稱:CGMCC
[0033]地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號
[0034]保藏日期:2013年9月12日
[0035]保藏中心登記入冊編號:CGMCC N0.8179.【專利附圖】

【附圖說明】
[0036]圖1.a)所述解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) KB在PDA培養(yǎng)基上對桃褐腐病菌Monilinia fructicola的抑制效果；b)所述解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)KB對蘋果灰霉病Botrytis cinerea的抑制效果；c)所述解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) KB 對番爺灰霉病 Botrytis cinerea 的抑制效果；
[0037]圖2.a)所述解淀粉酶芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) KB對桃褐腐病病斑大小的抑制效果；b)所述解淀粉酶芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) KB對蘋果灰霉病病斑大小抑制效果；c)所述解淀粉酶芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)KB對蘋果青霉病病斑大小抑制效果；d)所述解淀粉酶芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens) KB對番爺灰霉病病斑大小抑制效果。
【具體實施方式】
[0038]以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0039]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0040]下述實施例中用到的病原菌，公眾可從野外采集，也可從北京市農(nóng)林科學(xué)院獲得，以重復(fù)本申請實驗:
[0041]番爺灰霉病菌-灰葡萄孢(Botrytis cinerea Per.ex Fr.)(李興紅等.北京
地區(qū)番茄灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性檢測.植物保護.2012.38(4):141-143)
[0042]桃褐腐病菌-鏈核盤菌(Monilinia fructicola(wint.)Rehm)(王菲等.桃褐
腐病的發(fā)生與防治.果樹花卉.2012年第5期p58)。
[0043]蘋果采后灰霉病菌一灰葡萄孢(Botrytis cinerea Per.ex Fr)；
[0044]蘋果米后青霉病菌一展青霉酶菌(Penicillium expansum Link, 1809)
[0045]實施例1
[0046]本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) KB的分離與菌株鑒定
[0047]1、樣品采集
[0048]從有中國北方有機果園中，采集桃子和獼猴桃。
[0049]2、菌株的分離篩選及拮抗篩選
[0050]從有機水果上分離菌株，采用常規(guī)梯度稀釋涂布分離，用LB，NA，KB和CM0002共4種培養(yǎng)基分別在28°C條件下培養(yǎng)，挑取菌落形態(tài)差異較大并可純培養(yǎng)的細菌，在LB培養(yǎng)基上純化保存，并以桃褐腐病菌為靶標病原菌進行拮抗菌的初篩和多次復(fù)篩，最終得到一株抑菌活性強的細菌菌株，命名其為KB。
[0051]3、菌株的鑒定
[0052]對菌株KB進行形態(tài)學(xué)、生理生化特性和部分保守序列的分析。參考《土壤微生物研究原理與方法》(林先貴.土壤微生物研究原理與方法[M]，高等教育出版社，2010)中描述方法進行生理生化和環(huán)境耐受性特性的測定。
[0053]結(jié)果表明，菌株KB的菌體細胞在400倍光學(xué)顯微鏡下菌體細胞呈短桿狀，直或近直，芽孢中生，柱狀或橢圓形，具有運動性；在LB培養(yǎng)基上不產(chǎn)色素，菌落為白色不透明，扁平或圓形，無光澤，隨著培養(yǎng)時間增長，菌落變厚變干，邊緣不整齊，菌落上有褶皺，變?yōu)槿橹?。菌株KB的生理生化特征為革蘭氏染色陽性，形成菌膜，甲基紅、乙酰甲基甲醇、硝酸鹽還原、吲哚反應(yīng)、接觸酶、尿酶陽性，可水解明膠、纖維素、淀粉和七葉苷，氧化酶反應(yīng)、分解酪氨酸陰性，產(chǎn)生硫化氫，利用檸檬酸鹽，不利用丙二酸鹽，精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸脫羧酶反應(yīng)陽性，苯丙氨酸脫氨酶反應(yīng)陰性，葡萄糖、蔗糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，可利用葡萄糖、麥芽糖、山梨醇、鼠李糖、菊糖、半乳糖、肌醇、木糖、甘露糖、甘露醇、核糖、蔗糖等，不利用阿拉伯糖和山梨糖。解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens) KB的環(huán)境耐受性表現(xiàn)為于含有1%-7% (質(zhì)量含量)氯化鈉的培養(yǎng)基中均可正常生長，于含有10% (質(zhì)量含量)氯化鈉的培養(yǎng)基中不可生長，于pH4.5-9.0的培養(yǎng)基中均可正常生長，在pH4.0下生長勢弱，pH9.5下不可生長，在環(huán)境溫度為4°C下生長勢弱，在55°C _80°C下處理15min，仍可正常生長。菌株KB的16S rDNA序列如SEQ ID N0.1所示。
[0054] 實施例2
[0055]本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) KB抑菌譜的測定
[0056]供試病原菌:[0057]桃褐腐病菌-鏈核盤菌(Monilinia fructicola(wint.)Rehm)；
[0058]番爺灰霉病菌-灰葡萄抱(Botrytis cinerea Per.ex Fr)；
[0059]蘋果米后灰霉病菌一灰葡萄抱(Botrytis cinerea Per.ex Fr)；
[0060]蘋果米后青霉病菌--展青霉酶菌(Penicillium expansum Link, 1809)
[0061]選擇桃米后揭腐病病囷、平果米后灰霉病囷、平果米后青霉病囷等為指不真囷，米用平板對峙培養(yǎng)法。
[0062]具體操作如下:解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) KB菌株在LB培養(yǎng)基上28°C恒溫培養(yǎng)48h。植物病原真菌在PDA平板上25°C恒溫培養(yǎng)3_4天，自菌落邊緣用直徑0.7cm無菌不銹鋼打孔器打制帶菌瓊脂片；用無菌接種針挑取病原菌菌片，菌絲面朝下接種于PDA平板中心處，同時在距病原真菌菌片兩側(cè)均約3.00 cm處用無菌接種環(huán)劃線解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) KB,以僅接病原菌的平板為對照，每個處理三次重復(fù)，25°C恒溫培養(yǎng)5-7天，測量病原真菌邊緣與解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens) KB的菌落帶寬中心之間的抑菌帶寬度。
[0063]將果實體內(nèi)人為打孔接種法具體操作(以防治蘋果采后灰霉病為例進行說明)如下:
[0064]解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)KB菌株在LB液體培養(yǎng)基上28°C恒溫培養(yǎng)48h，用蒸餾水調(diào)至菌液濃度為5X107cfu/ml。蘋果灰霉病菌B.cinerea在PDA平板上25°C恒溫培養(yǎng)5-7天，收集灰霉菌孢子，用蒸餾水制成5 X 104CfU/ml的孢子懸浮液；成熟的蘋果，先用0.5%次氯酸鈉消毒之后，用滅過菌的移液器槍頭，沿著蘋果腰部插孔，每個果子扎孔3個,每個孔為30mmX 30mm。每孔接種30ul KB菌液,室溫晾干，然后再接種30ul的病原菌孢子懸浮液。最后，處理的果子放置于25°C下，5-7天后，測定果實腐爛斑大小。腐爛斑小于IOmm被視為不發(fā)病。根據(jù)腐爛病斑的占總接種孔數(shù)的多少，計算發(fā)病率，未發(fā)病的病斑數(shù)占總接種孔數(shù)的多少，計算病斑抑制率。
[0065]實驗結(jié)果見表1,解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) KB對所選擇的植物病原真菌中，對桃褐腐病菌和蘋果灰霉病菌的抑制作用最明顯，抑菌圈直徑分別為22mm和20mm，對桃褐腐病斑及蘋果灰霉病病斑的抑制率達到100%。說明解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) KB具有穩(wěn)定、高效、廣譜的抗菌性能。
[0066]表1B.amyloliquefaciens KB 對病原菌的抑制效果(PDA, 28°C , 72h)[0067]
【權(quán)利要求】
1.一種解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens),菌株KB,保藏號為CGMCCN0.8179。
2.一種病原菌抑制劑，其活性成分為權(quán)利要求1所述解淀粉芽孢桿菌和/或權(quán)利要求1所述解淀粉芽孢桿菌的代謝物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的病原菌抑制劑，其特征在于，所述病原菌抑制劑對下述至少一種病原菌具有抑制作用: A、桃米后揭腐病囷； B、蘋果采后灰霉病菌； C、西紅柿米后灰霉病囷； D、蘋果采后青霉病菌。
4.一種病害抑制劑，其活性成分為權(quán)利要求1所述解淀粉芽孢桿菌和/或權(quán)利要求1所述解淀粉芽孢桿菌的代謝物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的病害抑制劑，其特征在于，所述病害為下述至少一種: A、桃米后褐腐?。? B、平果米后灰霉??； C、西紅柿米后灰霉??； D、蘋果米后青霉病。
6.權(quán)利要求1所述解淀粉芽孢桿`菌和/或權(quán)利要求1所述解淀粉芽孢桿菌的代謝物的下述任一應(yīng)用: 1)在抑制病原菌中的應(yīng)用； 2)在制備病原菌抑制劑中的應(yīng)用； 3)在抑制病害中的應(yīng)用； 4)在制備病害抑制劑中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述病原菌為下述至少一種: A、桃米后揭腐病囷； B、蘋果采后灰霉病菌； C、西紅柿米后灰霉病囷； D、蘋果采后青霉病菌； 所述病害為下述至少一種: A、桃米后褐腐??； B、平果米后灰霉??； C、西紅柿米后灰霉?。? D、蘋果米后青霉病。
【文檔編號】A01N63/02GK103642727SQ201310636894
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月2日
【發(fā)明者】張殿朋, 劉偉成, 盧彩鴿, 張濤濤, 董丹, 劉霆, 吳慧玲, 劉德文, 盧向陽 申請人:北京市農(nóng)林科學(xué)院