一種昆蟲病原線蟲復(fù)壯的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種昆蟲病原線蟲復(fù)壯的方法，步驟如下：（1）應(yīng)用大蠟螟活體擴(kuò)繁昆蟲病原線蟲，并收集其侵染期幼蟲，得到線蟲懸浮液；（2）確定一塊有昆蟲病原線蟲寄主昆蟲分布，但無(wú)昆蟲病原線蟲分布的地塊，將擴(kuò)繁收集得到的線蟲懸浮液噴施到田間；（3）在上述地塊采集土樣，利用大蠟螟誘集線蟲，獲得復(fù)壯后的昆蟲病原線蟲。本發(fā)明可以有效的將昆蟲病原線蟲復(fù)壯，使其致病力恢復(fù)到自然系統(tǒng)中的真實(shí)狀態(tài)：復(fù)壯后的昆蟲病原線蟲對(duì)大蠟螟的致病力是侵染4d后，死亡率為100%，與當(dāng)初剛剛誘集分離得到時(shí)對(duì)大蠟螟的致病力一致；而未復(fù)壯的線蟲對(duì)大蠟螟的致病力是侵染4d后，死亡率為80.0%。
【專利說(shuō)明】一種昆蟲病原線蟲復(fù)壯的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種昆蟲病原線蟲復(fù)壯的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]昆蟲病原線蟲是指體內(nèi)攜帶有具有病原性的共生細(xì)菌，因而能引起昆蟲致病的一類線蟲。作為控制害蟲的手段，昆蟲病原線蟲較化學(xué)防治有明顯的優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)的研究表明:昆蟲病原線蟲無(wú)污染，對(duì)環(huán)境和人類安全，可以大量使用，而且它們既可以主動(dòng)發(fā)現(xiàn)寄主，也可以被動(dòng)接觸寄主，已被證實(shí)，對(duì)靶標(biāo)昆蟲進(jìn)行控制時(shí)，昆蟲病原線蟲的防效要優(yōu)于化學(xué)農(nóng)藥。昆蟲病原線蟲的另一優(yōu)點(diǎn)是可以在寄主體內(nèi)大量繁殖，因此，新繁殖的侵染線蟲可以侵染更多的寄主昆蟲。因此，昆蟲病原線蟲將成為生物防治中的主要手段，可以預(yù)計(jì)昆蟲病原線蟲在未來(lái)的農(nóng)業(yè)害蟲生物生態(tài)控制系統(tǒng)中將會(huì)發(fā)揮重要的作用。
[0003]昆蟲病原線蟲推廣應(yīng)用的前提是篩選出致病力較高的種類或品系，所以昆蟲病原線蟲對(duì)靶標(biāo)昆蟲的致病力測(cè)定是開展昆蟲病原線蟲應(yīng)用研究的基礎(chǔ)。昆蟲病原線蟲致病力的高低主要是通過其侵染期線蟲對(duì)靶標(biāo)昆蟲的防治效果來(lái)反映，供試線蟲一般情況下都是經(jīng)過利用大蠟螟活體擴(kuò)繁復(fù)壯的侵染期幼蟲，但是由于室內(nèi)擴(kuò)繁代數(shù)和保存時(shí)間的遞增，侵染期線蟲的致病力會(huì)下降，不能很好的應(yīng)用其開展昆蟲病原線蟲應(yīng)用研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供了一種昆蟲病原線蟲復(fù)壯的方法，應(yīng)用本發(fā)明的方法可以 有效的將昆蟲病原線蟲復(fù)壯，使其致病力恢復(fù)到自然系統(tǒng)中的真實(shí)狀態(tài)，為致病力測(cè)定的準(zhǔn)確性提供了保障。
[0005]本發(fā)明提供一種昆蟲病原線蟲復(fù)壯的方法，步驟如下:
1)應(yīng)用大蠟螟活體擴(kuò)繁昆蟲病原線蟲，并收集其侵染期幼蟲，得到線蟲懸浮液；
2)確定一塊有昆蟲病原線蟲寄主昆蟲分布，但無(wú)昆蟲病原線蟲分布的地塊，將擴(kuò)繁收集得到的線蟲懸浮液噴施到田間；
3)在上述地塊采集土樣，利用大蠟螟誘集線蟲，獲得復(fù)壯后的昆蟲病原線蟲。
[0006]優(yōu)選地，步驟(2)中，所述線蟲懸浮液以10000-15000頭/m2的濃度噴施。
[0007]此濃度范圍便于線蟲寄生寄主昆蟲，并易于收集。
[0008]更優(yōu)選地，步驟(2)中，所述線蟲懸浮液以10000頭/m2的濃度噴施。
[0009]優(yōu)選地，步驟(3)中，經(jīng)過三個(gè)月后，在上述地塊采集土樣。
[0010]優(yōu)選地，所述采集土樣采取多點(diǎn)采樣法。
[0011]優(yōu)選地，步驟(3)中，所述利用大蠟螟誘集線蟲是將大蠟螟老熟幼蟲放入瓶中，加入采集的土樣,使大蠟螟充分接觸昆蟲病原線蟲,將表現(xiàn)為受線蟲侵染癥狀的死亡大蠟螟老熟幼蟲單頭放入線蟲收集盤上收集昆蟲病原線蟲。
[0012]優(yōu)選地，所述使大蠟螟充分接觸昆蟲病原線蟲的方法是每天翻動(dòng)瓶，使大蠟螟在土中上下爬動(dòng)。[0013]優(yōu)選地，所述線蟲收集盤里為質(zhì)量百分濃度為0.1%的甲醛溶液。
[0014]昆蟲病原線蟲復(fù)壯是其致病力研究的前提和關(guān)鍵步驟，有效的復(fù)壯是其致病力測(cè)定準(zhǔn)確性的保障，本發(fā)明可以有效的將昆蟲病原線蟲復(fù)壯，使其致病力恢復(fù)到自然系統(tǒng)中的真實(shí)狀態(tài):復(fù)壯后的昆蟲病原線蟲對(duì)大蠟螟的致病力是侵染4d后，死亡率為100%，與當(dāng)初剛剛誘集分離得到時(shí)對(duì)大蠟螟的致病力一致；而未復(fù)壯的線蟲對(duì)大蠟螟的致病力是侵染4d后，死亡率為80.0%。
【具體實(shí)施方式】
[0015]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0016]實(shí)施例1
本發(fā)明的昆蟲病原線蟲復(fù)壯的方法步驟如下:
1.1試驗(yàn)材料
供試線蟲:甘肅省土著昆蟲病原線蟲的優(yōu)勢(shì)種:Steinernema feltiae。
[0017]試驗(yàn)所需器材:人工氣候箱、顯微鏡、解剖鏡、冷光源解剖鏡、智能冰箱、恒溫箱、微量移液槍、直徑60_培養(yǎng)皿、直徑90_培養(yǎng)皿、黑光燈、濾紙、小噴壺等。[0018]1.2試驗(yàn)方法
1.應(yīng)用大臘螟活體擴(kuò)繁Steinernema feltiae線蟲,并收集其侵染期幼蟲；具體方法如下:在24孔板中，每孔裝2克細(xì)沙,然后每孔將200ii I Steinernema feltiae線蟲液(含約200頭抗逆性幼蟲)滴入孔中，每孔放入一頭末齡大蠟螟幼蟲，用封口膜密封24孔板，在25°C條件下培養(yǎng)24小時(shí)，然后將因昆蟲病原線蟲侵染死亡的大蠟螟幼蟲取出，放到鋪有一層干燥濾紙的培養(yǎng)皿中，在25°C條件下再培養(yǎng)72小時(shí)，然后將尸體放到線蟲收集盤中，待線蟲游出，每隔24小時(shí)收集一次線蟲，將收集的線蟲用無(wú)菌水沖洗三遍后，得到線蟲懸浮液，置于5~8°C冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> [0019]2.確定一塊有Steinernema feltiae線蟲寄主昆蟲(如常見地下害蟲類:擠贈(zèng))分布，但無(wú)Steinernema feltiae線蟲分布的地塊，并將擴(kuò)繁收集得到的線蟲懸浮液以10000頭/m2的濃度噴施到田間；此濃度便于線蟲寄生寄主昆蟲，并易于收集。
[0020]3.經(jīng)過三個(gè)月(線蟲可在自然環(huán)境中擴(kuò)繁多代)后再在此地塊采集土樣并誘集Steinernema feltiae線蟲；具體方法如下:
①采集土樣:采取5點(diǎn)采樣法。即在某一地點(diǎn)，除去表層土，在10~20cm的土深處取土，樣品量至少200cm3,以便采取到足夠量的Steinernema feltiae線蟲。在每個(gè)地面2~4m2的范圍內(nèi)取5個(gè)點(diǎn)，將5點(diǎn)采的樣混合，裝入雙層塑料袋中。
[0021]②大臘螟誘集法誘集Steinernema feltiae線蟲:將室內(nèi)人工飼料飼養(yǎng)的10頭大蠟螟老熟幼蟲放入塑料瓶?jī)?nèi)，然后分別裝入500g采集的土樣，在25°C的恒溫箱內(nèi)保持5~7天，期間每天翻倒塑料瓶，使大蠟螟在土中上下爬動(dòng)，以充分接觸線蟲。放置2天后每天檢查大蠟螟幼蟲的死亡情況。將表現(xiàn)受線蟲侵染癥狀的死亡幼蟲單頭放入線蟲收集盤(培養(yǎng)皿)上收集Steinernema feltiae線蟲(培養(yǎng)皿里加入少量質(zhì)量百分濃度為0.1%的甲醒溶液，溶劑為無(wú)菌水，起保濕和消毒的作用)。7~10天后線蟲開始從大蠟螟尸體內(nèi)爬出，爬到大培養(yǎng)皿的無(wú)菌水甲醛溶液中，就可獲得侵染期線蟲的水懸液。每天將線蟲水懸液換入新的容器中，貼上品系名稱和日期標(biāo)簽，放在5~8°C冰箱中保存?zhèn)溆?，再在大培養(yǎng)皿中重新加入適量的無(wú)菌水甲醛溶液。
[0022]4.將收集得到的線蟲懸浮液進(jìn)行形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)鑒定，分離鑒定得到的昆蟲病原線蟲為 Steinernema feltiae。
[0023]5.保存于4°C的冰箱中，備用。
[0024]應(yīng)用本發(fā)明的方法得到的昆蟲病原線蟲具有很好的致病力，具體試驗(yàn)過程如下: 試驗(yàn)在溫度為25°C，相對(duì)濕度為80%條件下的恒溫箱內(nèi)進(jìn)行。在直徑為60mm的培養(yǎng)
皿中墊一層濾紙，加入適量的水，使濾紙保持濕潤(rùn)。每個(gè)培養(yǎng)皿中加入50條應(yīng)用本發(fā)明的方法獲得的線蟲，同時(shí)每培養(yǎng)皿放入大蠟螟老熟幼蟲一頭。每處理10頭供試幼蟲，3次重復(fù)。并將未復(fù)壯的線蟲作為對(duì)照試驗(yàn)。每隔8小時(shí)檢查大蠟螟幼蟲的死亡情況并作記錄，比較復(fù)壯前后Steinernema feltiae線蟲對(duì)大臘螟的致病力，結(jié)果為:復(fù)壯后的Steinernemafeltiae線蟲對(duì)大蠟螟的致病力是侵染4d后，死亡率為100%，與當(dāng)初剛剛誘集分離得到時(shí)對(duì)大蠟螟的致病力一致；而未復(fù)壯的線蟲對(duì)大蠟螟的致病力是侵染4d后，死亡率為80.0%。
[0025]實(shí)施例2
本實(shí)施例與實(shí)施例1的不同之處在于:步驟2中，將擴(kuò)繁收集得到的線蟲懸浮液以12000頭/m2的濃度噴施到田間；其余步驟均與實(shí)施例1中相同。
[0026]實(shí)施例3
本實(shí)施例與實(shí)施例1的不同之處在于:步驟2中，將擴(kuò)繁收集得到的線蟲懸浮液以15000頭/m2的濃度噴施到田間`；其余步驟均與實(shí)施例1中相同。
[0027]最后應(yīng)說(shuō)明的是:以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種昆蟲病原線蟲復(fù)壯的方法，其特征在于:步驟如下: (1)應(yīng)用大蠟螟活體擴(kuò)繁昆蟲病原線蟲，并收集其侵染期幼蟲，得到線蟲懸浮液； (2)確定一塊有昆蟲病原線蟲寄主昆蟲分布，但無(wú)昆蟲病原線蟲分布的地塊，將擴(kuò)繁收集得到的線蟲懸浮液噴施到田間； (3)在上述地塊采集土樣，利用大蠟螟誘集線蟲，獲得復(fù)壯后的昆蟲病原線蟲。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(2)中，所述線蟲懸浮液以10000-15000頭/m2的濃度噴施。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(2)中，所述線蟲懸浮液以10000頭/m2的濃度噴施。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(3)中，經(jīng)過三個(gè)月后，在上述地塊采集土樣。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:所述采集土樣采取多點(diǎn)采樣法。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(3)中，所述利用大蠟螟誘集線蟲是將大蠟螟老熟幼蟲放入瓶中，加入采集的土樣，使大蠟螟充分接觸昆蟲病原線蟲，將表現(xiàn)為受線蟲侵染癥狀的死亡大蠟螟老熟幼蟲單頭放入線蟲收集盤上收集昆蟲病原線蟲。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:所述使大蠟螟充分接觸昆蟲病原線蟲的方法是每天翻動(dòng)瓶，使大蠟螟在土中上下爬動(dòng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述 的 方法，其特征在于:所述線蟲收集盤里為質(zhì)量百分濃度為0.1%的甲醛溶液。
【文檔編號(hào)】A01M1/10GK103688907SQ201310663719
【公開日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2013年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月10日
【發(fā)明者】錢秀娟, 劉長(zhǎng)仲, 孫小玲 申請(qǐng)人:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)