一種富集培養(yǎng)滑刃屬食真菌線蟲的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體為一種富集培養(yǎng)滑刃屬食真菌線蟲的方法。具體包括：（1）滑刃屬食真菌線蟲的分離；（2）滑刃屬食真菌線蟲的鑒定；（3）滑刃屬食真菌線蟲的表面消毒；（4）滑刃屬食真菌線蟲的富集培養(yǎng)。本發(fā)明的方法簡單易行，滑刃屬食真菌線蟲繁殖成活率高，線蟲個體質(zhì)量好，遺傳性變化小，管理方便，可以有效獲得大量純培養(yǎng)的滑刃屬食真菌線蟲，為研究滑刃屬食真菌線蟲在整個土壤食物鏈的關(guān)鍵作用及其與真菌的相互作用對植物生長的影響提供技術(shù)支持。
【專利說明】一種富集培養(yǎng)滑刃屬食真菌線蟲的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種土壤滑刃屬食真菌線蟲的富集培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]土壤中棲居的線蟲以自由生活線蟲占絕對優(yōu)勢，而土壤自由生活線蟲又以食細菌線蟲和食真菌線蟲為主(兩者統(tǒng)稱為食微線蟲),約占自由生活線蟲的80%。很多研究表明，食微線蟲通過捕食土壤微生物，加速微生物繁殖，并通過代謝分泌和釋放微生物所固持的養(yǎng)分，進而影響土壤生態(tài)過程和植物生長。但這種作用會因不同的線蟲、微生物和植物的種類以及土壤基質(zhì)的C/N營養(yǎng)狀況而異。目前，關(guān)于土壤食真菌線蟲與真菌的相互作用及其對植物生長的報道較少，尤其是污染土壤中的相關(guān)研究更是罕見報導(dǎo)。該類研究可以深入研究土壤食真菌線蟲的取食習(xí)性及其取食行為在土壤食物鏈和整個土壤養(yǎng)分循環(huán)中的重要地位，而純培養(yǎng)的土壤食真菌線蟲是研究的基礎(chǔ)。諸多研究表明滑刃屬食真菌線蟲(.Aphelenchoidessp.)對土壤污染具有較強的耐性,廣泛存在于各類污染土壤中,對其深入研究具有重大的意義。但是，目前鮮有關(guān)于土壤食真菌線蟲尤其是滑刃屬食真菌線蟲的富集培養(yǎng)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種富集培養(yǎng)滑刃屬食真菌線蟲iAphelenchoides%.)的方法，該方法簡單易用， 滑刃屬食真菌線蟲的繁殖率高，可為高效制備大量純培養(yǎng)的滑刃屬食真菌線蟲提供技術(shù)保障。
[0004]本發(fā)明提供的一種富集培養(yǎng)滑刃屬食真菌線蟲的方法，具體步驟如下:
1、滑刃屬食真菌線蟲)的分離:從野外采集新鮮土壤。采用改進的淺盤法從土壤中分離線蟲。
[0005]2、滑刃屬食真菌線蟲)的鑒定:將燒杯中液體轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿，然后根據(jù)滑刃屬食真菌線蟲的特征在解剖鏡下用毛細管挑出該屬線蟲，再將其在光學(xué)顯微鏡下進行活體鑒定。
[0006]3、滑刃屬食真菌線蟲)的表面消毒:將線蟲轉(zhuǎn)入滅菌的離心管中，用硫酸鏈霉素和放線菌酮混合液對線蟲進行表面消毒；
4、滑刃屬食真菌線蟲)的富集培養(yǎng):將真菌灰葡萄孢cinerea Pers.)接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，采用封口膜(Parafilm)將培養(yǎng)皿封口，以防止培養(yǎng)基水分蒸發(fā)與污染。然后將培養(yǎng)皿倒置放于恒溫培養(yǎng)箱，20-25°C黑暗培養(yǎng)，一周后，待灰葡萄孢大量繁殖時即將滑刃屬線蟲接入長滿均勻一致灰葡萄孢的培養(yǎng)皿中。采用封口膜(Parafilm)將培養(yǎng)皿封口，培養(yǎng)皿正面朝上放入大小合適的滅菌整理箱內(nèi)，20-25°C黑暗培養(yǎng)，定期觀察培養(yǎng)皿是否受到其他真菌或者螨蟲的污染，幾個星期后，灰孢基本消失，線蟲大量繁殖。重復(fù)以上步驟可獲得大量的滑刃屬食真菌線蟲。其中，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的配方為:每1000 ml馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中，土豆190-220 g，葡萄糖18-20 g，瓊脂15-20 g，其余為水，pH值自然。
[0007]上述步驟(1)所述的改進的淺盤法所需設(shè)備簡單，操作易行，具體如下:將10目的不銹鋼篩盤放入配套的淺盤中，在篩盤上放置兩層面巾紙，然后把土樣均勻鋪在紙上，往淺盤中加水直至浸沒土壤。再置于25°C溫度、黑暗條件下分離。48 h后，用400目篩收集線蟲于燒杯中。靜置過夜后，用真空泵緩慢吸取上層液體，盡量避免擾動下層液體。此時，下層液體聚集了大量的線蟲。
[0008]上述步驟(2)中滑刃屬食真菌線蟲的主要鑒定特征如下:①熱殺死后，雌蟲蟲體直到腹彎，雄蟲通常尾部向腹部彎成鉤狀整個蟲體呈“ J”形(如果活體無法鑒定，可將其殺死后確定，為活體鑒定提供參考)，活體線蟲多呈“S”形；②頭部通常略縊縮，頭架骨軟化，口針較細，基部膨大，長度通常為10-12 Mm，一般不超過20 Mm ;③食道前體部圓柱形，中食道球發(fā)達、卵圓形或者方圓形，中食道球瓣發(fā)達，后食道腺葉發(fā)達、覆蓋腸的背面；④排泄孔位于中食道球后水平處；⑤雌蟲尾呈圓錐形，尾端形態(tài)多樣:鈍圓或細圓，指狀或分叉或有一腹突，有或無尾尖突，尾尖突的形態(tài)多樣；⑥雄蟲尾呈圓錐形、向腹面彎成鉤狀；交合刺呈玫瑰刺形，基頂和基喙通常發(fā)達，無交合傘。
[0009]上述步驟(3)中，所述混合液中，硫酸鏈霉素的質(zhì)量-體積濃度為0.80-1.20g.L-1 ;放線菌酮的質(zhì)量體積濃度為0.015-0.02 g.L-1 ;對線蟲進行表面消毒的時間為15-20min。
[0010]本發(fā)明中，步驟(4)中的經(jīng)滅菌的培養(yǎng)基是將培養(yǎng)基在高壓滅菌鍋中，121°C溫度下滅菌30 min得到。其富集培養(yǎng)后得到的滑刃屬食真菌線蟲的保存方法如下:采用封口膜(Parafilm)將培養(yǎng)皿封口，然后將培養(yǎng)皿保存在4°C冰箱內(nèi)備用。每隔5_6個月，對滑刃屬食真菌線蟲進行繼代培養(yǎng)，時間過長則培養(yǎng)基水分蒸發(fā)以及食物資源的匱乏，線蟲會死亡，時間過短則是財力和勞力的浪費。其具體操作過程為，將培養(yǎng)皿從4°C冰箱取出，挑出一小塊長有線蟲的培養(yǎng)基，放入長滿均勻一致灰葡萄孢的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)皿封口后放入大小合適的滅菌整理箱內(nèi)，20-25°C黑暗培養(yǎng)，并定期觀察培養(yǎng)皿是否受到其他真菌或者螨蟲的污染，三周后將培養(yǎng)皿至于4°C冰箱內(nèi)保存。
[0011]本發(fā)明的有益效果在于:其方法簡單易行，滑刃屬食真菌線蟲繁殖成活率高，線蟲個體質(zhì)量好，遺傳性變化小，管理方便，可以有效獲得大量純培養(yǎng)的滑刃屬食真菌線蟲，為研究土壤中食真菌線蟲的取食行為以及整個土壤食物鏈提供技術(shù)支持。此外，滑刃屬食真菌線蟲在污染土壤中占有優(yōu)勢，可利用其對真菌菌絲的取食行為，加速污染土壤中固執(zhí)在菌絲或孢子內(nèi)養(yǎng)分的礦化釋放，從而在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上可以促進污染土壤中植物的生長，在污染土壤的修復(fù)方面則可以提高植物修復(fù)效率。
【具體實施方式】
[0012]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。
[0013]實施例1
1、滑刃屬食真菌線蟲的分離:從江蘇省中國科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園)苗圃地采集新鮮土壤。采用改進的淺盤法從土壤中分離線蟲。具體方法描述如下。
[0014]將10目的不銹鋼篩盤放入配套的淺盤中，并在篩盤上放置兩層面巾紙，然后把土樣均勻鋪撒在紙上，往淺盤中加水直至浸沒土壤。將整個裝置放于培養(yǎng)箱中，在20~25°C溫度、黑暗條件下分離。由于線蟲的趨水性，再加上其自身重力的作用，線蟲陸續(xù)脫離土壤穿過面巾紙孔隙進入水中(適用于分離土樣中的活躍線蟲)。48-60 h后，將篩盤取出，將淺盤中的液體倒入400目篩盤，不斷用水沖洗篩盤后收集線蟲于燒杯中。燒杯靜置過夜后，用真空泵緩慢吸取上層液體，并盡量避免擾動下層液體。此時，下層液體聚集了大量的線蟲。
[0015]2、滑刃屬食真菌線蟲的鑒定
目前鮮有食真菌線蟲，尤其是滑刃屬食真菌線蟲純培養(yǎng)的報道，難點之一也在于線蟲的鑒定，特別是富集培養(yǎng)過程中，需要將線蟲活體鑒定；鑒定方法具體如下:將燒杯中液體轉(zhuǎn)入直徑5 cm的培養(yǎng)皿。靜置5 min后，根據(jù)滑刃屬線蟲的形態(tài)學(xué)特征在解剖鏡下用毛細管挑出該屬線蟲，然后將其在奧林巴斯光學(xué)顯微鏡下活體鑒定。
[0016]鑒定滑刃屬食真菌線蟲時依據(jù)的主要鑒定特征如下:①熱殺死后,雌蟲蟲體直到腹彎，雄蟲通常尾部向腹部彎成鉤狀整個蟲體呈“J”形，活體線蟲多呈“S”形；(如果活體無法鑒定，可將其殺死后確定，為活體鑒定提供參考)，②頭部通常略縊縮，頭架骨軟化，口針較細，基部膨大，長度通常為10-12 Mm，一般不超過20 Mm ;③食道前體部圓柱形，中食道球發(fā)達、卵圓形或者方圓形，中食道球瓣發(fā)達，后食道腺葉發(fā)達、覆蓋腸的背面；④排泄孔位于中食道球后水平處；⑤雌蟲尾呈圓錐形，尾端形態(tài)多樣:鈍圓或細圓，指狀或分叉或有一腹突，有或無尾尖突，尾尖突的形態(tài)多樣；⑥雄蟲尾呈圓錐形、向腹面彎成鉤狀；交合刺呈玫瑰刺形，基頂和基喙通常發(fā)達，無交合傘。
[0017]3、滑刃屬食真菌線蟲的表面消毒:將線蟲轉(zhuǎn)入滅菌的50 ml離心管中，用質(zhì)量-體積濃度為1.0 g L—1的硫酸鏈霉素和質(zhì)量-體積濃度為0.02 g L—1的放線菌酮混合液對線蟲進行表面消毒20 min, 5000 r mirT1離心5 min,除去上清液,再用無菌水反復(fù)清洗6次。每次清洗時充分震蕩，5000 r mirT1離心5 min,棄去上清液。
[0018]4、滑刃屬食真菌線蟲的富集培養(yǎng):食真菌線蟲在土壤中主要以取食真菌為生，因而在純培養(yǎng)過程中需要給其提 供合適的食物來源。真菌種類不正確，則滑刃屬食真菌線蟲不愿取食，線蟲大量死亡；培養(yǎng)基類型和配方不正確，則真菌繁殖欠佳導(dǎo)致滑刃屬食真菌線蟲不能正常生長繁殖；培養(yǎng)溫度、光照等條件不正確，則真菌顏色發(fā)黃、生長緩慢、易衰老，線蟲不易取食；線蟲接種到培養(yǎng)基上的時機不正確，則影響線蟲食物來源的數(shù)量與質(zhì)量；發(fā)明人對真菌的種類，培養(yǎng)基的類型和配方以及培養(yǎng)條件等進行了一系列的摸索。確定方法如下。
[0019]采用常規(guī)方法制備馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，其培養(yǎng)基配方為:每1000 ml馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中，土豆220 g,葡萄糖18 g,瓊脂18 g,其余為水，pH值自然。培養(yǎng)基配好后，在高壓滅菌鍋中121°C滅菌30 min。待培養(yǎng)基冷卻后，將其倒入直徑為9 cm的培養(yǎng)皿,厚度為0.7- 1.0 cm ο將真菌灰葡萄孢cinerea Pers.)接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，采用封口膜(Parafilm)將培養(yǎng)皿封口，以防止培養(yǎng)基水分蒸發(fā)與污染，然后將培養(yǎng)皿倒置放于恒溫培養(yǎng)箱，20-25°C黑暗培養(yǎng)，一周后，真菌大量繁殖。此時，將滑刃屬線蟲接入長滿均勻一致灰葡萄孢的培養(yǎng)皿中，接種方法為，用吸管接種50-100 μ?無菌水于培養(yǎng)基表面，無菌水中包含有200條左右經(jīng)表面消毒的食真菌線蟲。將培養(yǎng)皿采用封口膜(Parafilm)封口，以防止培養(yǎng)基水分蒸發(fā)與污染。以上過程均在無菌操作臺上進行。最后，將培養(yǎng)皿正面朝上放入合適大小的滅菌整理箱，然后置于培養(yǎng)箱，20-25°C黑暗培養(yǎng)，三個星期后，灰葡萄孢基本消失，線蟲大量繁殖。每個培養(yǎng)皿滑刃屬食真菌線蟲數(shù)量約為12000條，繁殖率約為60倍，個體長約0.75 mm，體長/最大體寬約為35.6，口針長約為11.2 μιη0
[0020]挑出一小塊長有線蟲的培養(yǎng)基，放入長滿均勻一致灰葡萄孢的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，將滑刃屬食真菌線蟲進行擴繁，如此重復(fù)獲得大量純培養(yǎng)的滑刃屬食真菌線蟲。
[0021]實施例中，滑刃屬食真菌線蟲的富集培養(yǎng)時，還采用的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基配方包括:每1000 ml馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中，土豆190 g，葡萄糖19 g，瓊脂19 g，其余為水，pH值自然。通過上述配方也獲得滑刃屬食真菌線蟲；此配方下，每個培養(yǎng)皿線蟲數(shù)量約為11000條，繁殖率約為55倍，個體長約0.68 mm，體長/最大體寬約為36.2，口針長約為 11.0 Mm。
[0022]另外還采用如下配方:每1000 ml馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中，土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，其余為水，pH值自然。通過上述配方也獲得滑刃屬食真菌線蟲，此配方下，每個培養(yǎng)皿線蟲數(shù)量約為12500條，繁殖率約為62.5倍，個體長約0.70 mm,體長/最大體寬約35.2，口針長約10.8 Mm。
[0023]上述配方條件下均獲得了大量純培養(yǎng)的滑刃屬食真菌線蟲。
[0024]5、滑刃屬食真菌線蟲的繼代保存:線蟲的繁殖速度較快，每2周產(chǎn)生一代，在此過程中消耗大量的真菌菌絲與孢子，此外培養(yǎng)基的養(yǎng)分與水分也有一定的期限，因而線蟲的保存時間也是一個難點。本發(fā)明所涉及的保存方法如下。采用封口膜(Parafilm)將培養(yǎng)皿封口，然后將培養(yǎng)皿正面朝上保存在4°C冰箱內(nèi)備用。每隔5-6個月，對滑刃屬食真菌線蟲進行繼代培養(yǎng)，具體操作過程為，將培養(yǎng)皿從4°C冰箱取出，挑出一小塊長有線蟲的培養(yǎng)基，放入長滿均勻一致灰葡萄孢 的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)皿封口后正面朝上放入大小合適的滅菌整理箱內(nèi)，25°C黑暗培養(yǎng)，并定期觀察培養(yǎng)皿是否受到其他真菌或者螨蟲的污染，三周后將培養(yǎng)皿至于4°C冰箱內(nèi)保存。
[0025]6、滑刃屬食真菌線蟲的應(yīng)用:將培養(yǎng)皿從4°C冰箱取出，用消毒的牛角勺將培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)基刮出，放入篩盤內(nèi)，依次進行線蟲的分離和表面消毒步驟獲得大量純培養(yǎng)的滑刃屬食真菌線蟲。
[0026]將滑刃屬食真菌線蟲與叢枝菌根真菌同時接種入砷污染土壤，研究滑刃屬食真菌線蟲與叢枝菌根真菌的相互作用以及對煙草生長的影響。
[0027]結(jié)果表明，雙接種后，滑刃屬食真菌線蟲數(shù)量增加了 1110%，叢枝菌根真菌的菌絲量提高了 25%，菌根侵染率也有一定數(shù)量的提高；與不接種滑刃屬食真菌線蟲與叢枝菌根真菌的處理對照相比，滑刃屬食真菌線蟲與叢枝菌根真菌的相互作用顯著提高砷污染土壤中煙草的生物量(地下部分干重提高了 40%，地上部分干重提高了 66%)以及體內(nèi)的砷累積量(地上部分砷累積量提高了 16%)。說明滑刃屬食真菌線蟲在As污染土壤中有優(yōu)勢，促進污染土壤中植物的生長，將其應(yīng)用于在污染土壤的修復(fù)方面時，則可以提高植物修復(fù)效率。
【權(quán)利要求】
1.一種富集培養(yǎng)滑刃屬食真菌線蟲的方法，其特征在于，具體步驟如下:(1)滑刃屬食真菌線蟲的分離:從野外采集新鮮土壤，采用改進的淺盤法從土壤中分離線蟲；(2)滑刃屬食真菌線蟲的鑒定:根據(jù)滑刃屬食真菌線蟲的特征，在解剖鏡下用毛細管挑出該屬線蟲，再將其在光學(xué)顯微鏡下進行活體鑒定；(3)滑刃屬食真菌線蟲的表面消毒:將線蟲轉(zhuǎn)入滅菌的離心管中，用硫酸鏈霉素和放線菌酮混合液對線蟲進行表面消毒；(4)滑刃屬食真菌線蟲的富集培養(yǎng):將真菌灰葡萄孢cinereaPers.)接種到經(jīng)滅菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，采用封口膜將培養(yǎng)皿封口，然后將培養(yǎng)皿倒置放于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，20-25°C黑暗培養(yǎng)；一周后，待真菌大量繁殖時即將滑刃屬線蟲接入長滿均勻一致灰葡萄孢的培養(yǎng)皿中；培養(yǎng)皿用封口膜封口后，置于滅菌整理箱內(nèi)，20-25 V黑暗培養(yǎng)，定期觀察，直至灰孢基本消失，線蟲大量繁殖；重復(fù)以上步驟獲得大量的滑刃屬食真菌線蟲；其中，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的配方為:每1000 ml馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中，土豆190-220 g，葡萄糖18-20 g，瓊脂15-20 g，其余為水，pH值自然。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(1)中所述改進的淺盤法具體如下:將10目的不銹鋼篩盤放入配套的淺盤中，在篩盤上放置兩層面巾紙，然后把土樣均勻鋪在紙上，往淺盤中加水直至浸沒土壤；再置于20-25°C溫度、黑暗條件下分離；48-60 h后，用400目篩收集線蟲于燒杯中；靜置過夜后，用真空泵緩慢吸取上層液體，并盡量避免擾動下層液體，此時，下層液體收集到線蟲。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(3)中，所述混合液中，硫酸鏈霉素的質(zhì)量-體積濃度為0.80-1.20 g.L—1 ;放線菌酮的質(zhì)量-體積濃度為0.015-0.02 g.L—1 ;對線蟲進行表面消毒的時間為15-20 min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(2)中鑒定滑刃屬食真菌線蟲，其依據(jù)的鑒定特征如下:①熱殺死后，雌蟲蟲體直到腹彎，雄蟲通常尾部向腹部彎成鉤狀整個蟲體呈“J”形，活體線蟲多呈“S”形；②頭部通常略縊縮，頭架骨軟化，口針較細，基部膨大，長度通常為10-12 Mm，一般不超過20 Mm ;③食道前體部圓柱形，中食道球發(fā)達、卵圓形或者方圓形，中食道球瓣發(fā)達，后食道腺葉發(fā)達、覆蓋腸的背面；④排泄孔位于中食道球后水平處；⑤雌蟲尾呈圓錐形，尾端形態(tài)多樣:鈍圓或細圓，指狀或分叉或有一腹突，有或無尾尖突，尾尖突的形態(tài)多樣；⑥雄蟲尾呈圓錐形、向腹面彎成鉤狀；交合刺呈玫瑰刺形，基頂和基喙通常發(fā)達，無交合傘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(4)中所述的經(jīng)滅菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基是將培養(yǎng)基在高壓滅菌鍋中，121 °C溫度下，滅菌30 min得到的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(4)富集培養(yǎng)后得到的滑刃屬食真菌線蟲的保存方法如下:將其置于培養(yǎng)皿中，封口后正面朝上置于4°C冰箱內(nèi)保存；每隔5-6個月，將滑刃屬食真菌線蟲繼代培養(yǎng)；具體操作過程為，將培養(yǎng)皿從4°C冰箱取出，挑出一小塊長有線蟲的培養(yǎng)基，放入長滿均勻一致灰葡萄孢的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)皿封口后放入滅菌整理箱內(nèi)，20-25°C黑暗培養(yǎng)，并定期觀察，三周后將培養(yǎng)皿至于4°C冰箱內(nèi)保存。
【文檔編號】A01K67/033GK103688908SQ201310696738
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月18日
【發(fā)明者】華建峰, 殷云龍 申請人:江蘇省中國科學(xué)院植物研究所