一種高葉綠素多蘗大麥的復(fù)合選育方法
【專利摘要】本發(fā)明提供高葉綠素含量和/或多莖蘗數(shù)大麥的復(fù)合選育方法、制備麥綠素產(chǎn)品的方法和提高大麥葉綠素含量和/或莖蘗數(shù)。本發(fā)明的方法包括取大麥小孢子發(fā)育處于單核早期和/或中期的小穗，2-10℃處理10-30天；收獲小孢子，培養(yǎng)小孢子，再生獲得純合加倍單倍體；和培養(yǎng)所述純合加倍單倍體；從而篩選獲得葉綠素含量高和/或莖蘗數(shù)多的大麥，已將所述大麥制備成所需的麥綠素產(chǎn)品。本發(fā)明通過雜交技術(shù)將多個(gè)優(yōu)異性狀聚合，利用小孢子培養(yǎng)技術(shù)對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行快速純合穩(wěn)定，在人工可控環(huán)境下進(jìn)行多指標(biāo)篩選，最終獲得高葉綠素含量多莖蘗的大麥種質(zhì)材料。該材料通過田間種植或水培方式可作為麥綠素等營(yíng)養(yǎng)保健產(chǎn)品生產(chǎn)的優(yōu)良種質(zhì)材料。
【專利說明】一種高葉綠素多蘗大麥的復(fù)合選育方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種高葉綠素含量和多莖蘗大麥材料的篩選培育方法。【背景技術(shù)】
[0002]麥類作物的幼苗是一種傳統(tǒng)中草藥，我國(guó)早在《本草綱目》和《傷寒紀(jì)要》中的記載了麥苗的藥用價(jià)值。1969年，日本學(xué)者荻原義秀博士發(fā)表了《禾本科植物綠葉成分及作為穩(wěn)定的藥品、食品研究》一文，并致力于商品化開發(fā)。1991年，他利用“超低溫快速噴霧干燥法”的技術(shù)，將大麥嫩苗榨汁濃縮成粉末，稱為“麥綠素”(Barely Green)，并向國(guó)際市場(chǎng)推廣。目前市場(chǎng)上的麥綠素產(chǎn)品是以大麥或小麥等麥類作物分蘗盛期的嫩葉(麥高20-30cm)為主要原料，輔以糊精等配料加工而成的。麥綠素富含蛋白質(zhì)、葉綠素、大量的活性酶(如SOD酶、過氧化氫酶、淀粉酶、蛋白酶等)、0_胡蘿卜素、多種維生素，以及多種微量元素(郭建華，2008)。
[0003]現(xiàn)代生物試驗(yàn)和臨床研究證實(shí)，麥綠素具有以下9個(gè)方面生理功能:(1)促進(jìn)損傷DNA的恢復(fù)作用；(2)消炎鎮(zhèn)痛；(3)增強(qiáng)免疫力及防癌、抗癌、抗輻射作用；(4)抑制艾滋病病毒作用；(5)降血壓；(6)抗?jié)儯?7)清除體內(nèi)多余自由基，抗衰老及防治心腦血管疾??；(8)防治糖尿病；(9)加速傷口愈合，促進(jìn)造血，消除口臭(喬文靜，2009)。美國(guó)FDA已批準(zhǔn)大麥嫩葉汁作為食品增補(bǔ)劑。在日本，大麥嫩葉汁制品已獲得日本健康協(xié)會(huì)認(rèn)定的健康食品的標(biāo)志(牛廣財(cái)，2011)。目前國(guó)外已研制開發(fā)出麥葉系列產(chǎn)品，如小麥纖維食品、大麥葉促康食品、麥草葉飲料、麥綠素可樂、青麥酶營(yíng)養(yǎng)品等等，日本還推出了在大麥嫩葉汁粉中添加糊精、酵母、胡蘿卜粉、高麗參粉的營(yíng)養(yǎng)滋補(bǔ)品。
[0004]麥綠素產(chǎn)品具有良好的營(yíng)養(yǎng)保健功能，有著廣闊的市場(chǎng)前景，麥綠素的主要生產(chǎn)基地在美國(guó)、加拿大、澳洲等，由于它的純天然性和保健作用，迎合了人們“回歸自然”的追求，因而風(fēng)靡北美、歐洲、澳大利亞、東南亞，每年銷售額已達(dá)23~27億美元(黃相國(guó)，2003)。大麥功能產(chǎn)品的生產(chǎn)將會(huì)增加大麥種植產(chǎn)業(yè)的附加值，使農(nóng)民增收，據(jù)報(bào)道，每畝可生產(chǎn)鮮葉500kg，產(chǎn)值可達(dá)1000元以上，農(nóng)民收入比種植常規(guī)大麥和其它冬季作物高出一倍以上(武紅霞，2002)。
[0005]但目前生產(chǎn)麥綠素的專用大麥品種缺乏，嚴(yán)重限制了麥綠素產(chǎn)品的開發(fā)與利用。目前功能大麥的選育在我國(guó)還未引起足夠重視，傳統(tǒng)的育種目標(biāo)并不能滿足功能大麥選育的要求。傳統(tǒng)的育種目標(biāo)主要是考慮品種的農(nóng)藝性狀如籽粒產(chǎn)量與品質(zhì)、抗病性等，而以生產(chǎn)麥綠素專用的大麥品種原料取自營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期，因此，需要重新考慮其選育目標(biāo)。對(duì)麥綠素專用大麥品種選育，要求苗期生長(zhǎng)快，拔節(jié)時(shí)莖葉產(chǎn)量高，葉綠素等營(yíng)養(yǎng)含量高。
[0006]葉片是植物進(jìn)行光合作用的重要器官，而葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的重要色素，其作用就是進(jìn)行光能捕獲，其含量的高低不僅會(huì)影響葉色，而且會(huì)直接影響光合作用的效率，有研究表明在一定范圍內(nèi)葉綠素的含量是與光合效率成正相關(guān)的。綠色植物都是依靠光合作用進(jìn)行生物合成，完成其形態(tài)建成和生物量積累。綠色植物的葉綠素生物合成是一個(gè)由一系列酶參與合成的復(fù)雜過程，其中參與合成的酶和基因在高等植物中已比較清楚，但控制葉綠素含量的遺傳模式還不清楚。目前對(duì)葉綠素含量的篩選都是集中在大田篩選，采用葉綠素儀或葉綠素?zé)晒鈨x進(jìn)行實(shí)地測(cè)定。這種篩選方式存在一些問題，已有研究表明葉綠素的含量受到環(huán)境因素的影響明顯，不同生長(zhǎng)周期的含量也會(huì)變化，大田環(huán)境復(fù)雜，種植條件受到各種因素影響和制約，葉綠素含量表現(xiàn)并不一致，另外葉綠素很大程度上受到隱性基因控制，篩選需要在高代進(jìn)行，這將需要更長(zhǎng)的時(shí)間獲得純合后代。
[0007]除了篩選高葉綠素含量，其地上部生物產(chǎn)量也是一個(gè)重要指標(biāo)。分蘗莖葉是苗期地上部分的生物產(chǎn)量構(gòu)成部分，要提高其生物產(chǎn)量，需要選擇分蘗多、莖葉生長(zhǎng)旺盛的材料。大麥育種的篩選大多集中在生長(zhǎng)成熟期，對(duì)苗期的地上部生物產(chǎn)量和葉綠素含量的篩選還未見報(bào)道。
[0008]本發(fā)明將提供一種克服目前大田篩選的一些問題，實(shí)施有效、快速選育高葉綠素含量多莖蘗的大麥的方法，包括:通過雜交技術(shù)將多個(gè)優(yōu)異性狀聚合，利用小孢子培養(yǎng)技術(shù)對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行快速純合穩(wěn)定，在人工可控環(huán)境下進(jìn)行多指標(biāo)篩選，最終獲得高葉綠素含量多莖蘗的大麥種質(zhì)材料。該材料通過田間種植或水培方式可作為麥綠素等營(yíng)養(yǎng)保健產(chǎn)品生產(chǎn)的優(yōu)良種質(zhì)材料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的在于高效、快速提供高葉綠素含量、多莖蘗數(shù)的大麥，且所述大麥的所述性狀能穩(wěn)定遺傳。本發(fā)明通過以下方法實(shí)現(xiàn)該目的，所述方法具有具有穩(wěn)定性和可重復(fù)性。
[0010]本發(fā)明一方面提供高葉綠素含量和/或多莖蘗數(shù)的大麥的方法包括:
[0011](I)取大麥小孢子發(fā)育處于單核早期和/或中期的小穗，低溫處理2-3周；
[0012](2)收獲小孢子，培養(yǎng)小孢子，再生獲得純合加倍單倍體；
[0013](3)水培所述純合加倍單倍體；
[0014]和篩選獲得葉綠素含量高和/或莖蘗數(shù)多的大麥。
[0015]本發(fā)明另一方面提供一種制備麥綠素產(chǎn)品的方法，所述方法包括:
[0016](I)取大麥小孢子發(fā)育處于單核早期和/或中期的小穗，低溫處理2-3周；
[0017](2)收獲小孢子，培養(yǎng)小孢子，再生獲得純合加倍單倍體；和
[0018](3)水培所述純合加倍單倍體，篩選獲得葉綠素含量高和/或莖蘗數(shù)多的大麥；和
[0019](4)將所述大麥制備成麥綠素產(chǎn)品。
[0020]本發(fā)明再一方面提供一種提高大麥葉綠素含量和/或莖蘗數(shù)的方法，所述方法包括:
[0021](I)取大麥小孢子發(fā)育處于單核早期和/或中期的小穗，2-10°C處理10-30天；
[0022](2)收獲小孢子，培養(yǎng)小孢子，再生獲得純合加倍單倍體；
[0023](3)水培所述純合加倍單倍體，獲得再生植株；
[0024]其中，所述再生植株為葉綠素含量提高和/或莖蘗數(shù)增多的植株。
[0025]應(yīng)理解，所述“葉綠素含量提高”與“莖蘗數(shù)增多”是相對(duì)于起始大麥材料而言，即相對(duì)于步驟(1)的所述大麥小孢子未經(jīng)本發(fā)明方法處理而獲得的大麥的葉綠素含量和莖蘗數(shù)而言。[0026]在一個(gè)具體實(shí)施例中，本發(fā)明上述方法在步驟(1)之前還包括:
[0027](a)選取一批葉色濃綠、苗期生長(zhǎng)旺盛、分蘗較多的大麥材料，水培后測(cè)定2葉I心期的葉綠素含量，至分蘗期后開始統(tǒng)計(jì)分蘗數(shù)、植株高度和/或莖基部周長(zhǎng)，根據(jù)這些統(tǒng)計(jì)指標(biāo)篩選出葉綠素含量高、分蘗數(shù)多、生長(zhǎng)迅速的品種；和
[0028](b)培養(yǎng)所述品種，獲得步驟(1)所述的小孢子；和
[0029](C)如果大麥材料只具有葉綠素含量高、分蘗數(shù)多、生長(zhǎng)迅速中的一個(gè)目標(biāo)性狀，則在花粉成熟后進(jìn)行相互授粉雜交，獲得雜交代種子，繁育該代種子，獲得Fl代植株，從該Fl代植株獲得步驟(1)所述的小孢子。
[0030]在一個(gè)具體實(shí)施例中，本發(fā)明上述方法中，小孢子獲自葉綠素含量高和莖蘗數(shù)多的大麥。
[0031]在一個(gè)具體實(shí)施例中，本發(fā)明上述方法中，所述步驟(2)包括:
[0032](2a)消毒所述穗子，然后清洗；
[0033](2b)從所述穗子分離小孢子；
[0034](2c)于室溫、黑暗處理小孢子36-60小時(shí)；
[0035](2d)用誘導(dǎo)培養(yǎng)基懸浮小孢子，并將懸浮液接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)愈傷；和
[0036](2e)將誘導(dǎo)所得愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，培養(yǎng)獲得再生苗，即所述純合加倍單倍體。
[0037]在一個(gè)具體實(shí)施例中，本發(fā)明上述方法中，分離小孢子時(shí)，在試管中加入穗子和含有4-8%甘露醇、1.0-1.5g/L的CaCl2和0.8-1.2g/L的2_(N_嗎啡啉)乙磺酸的提取液，用高速分散器超速旋切，過濾，離心濾液，從而獲得小孢子。
[0038]在一個(gè)具體實(shí)施例中，本發(fā)明上述方法中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基以N6培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，其中加有6-糠氨基嘌呤0.3-0.8mg/L、2，4- 二氯苯氧乙酸0.5-1.5mg/L、和麥芽糖70-120g/L ;分化培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，其中加有6-芐氨基腺嘌呤0.3-0.8mg/L、KT
1.0-2.0mg/L、萘乙酸 0.03-0.08mg/L 和麥芽糖 15_50g/L，用 3_8g/L 瓊脂粉固化。
[0039]在一個(gè)具體實(shí)施例中，本發(fā)明上述方法中，步驟(3 )之后還包括:
[0040]將小孢子培養(yǎng)獲得的再生植株放入大麥標(biāo)準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)，進(jìn)行再次篩選，選出葉綠素含量高和/或莖蘗數(shù)多的大麥，并收集其種子。
[0041]在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述再次篩選是在人工可控環(huán)境下采用水培方式進(jìn)行篩選。
[0042]在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述人工可控環(huán)境包括:在人工氣候室內(nèi)采用日光燈管照明，光照強(qiáng)度約1500-25001x，優(yōu)選約1800-20001x ;保持室溫白天約18-22°C，優(yōu)選約20°C，晚上約16-20°C，優(yōu)選18°C，白天、夜晚的溫度波動(dòng)約1_2°C。
[0043]在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述麥綠素產(chǎn)品選自:大麥纖維食品、大麥葉促康食品、麥草葉飲料、麥綠素可樂、青麥酶營(yíng)養(yǎng)品，以及在大麥嫩葉汁粉中添加糊精、酵母、胡蘿卜粉、高麗參粉的營(yíng)養(yǎng)滋補(bǔ)品。
[0044]在一個(gè)具體實(shí)施例中，本發(fā)明上述方法中，所獲得的小孢子用預(yù)處理液于室溫、黑暗預(yù)處理36-60小時(shí)，其中，所述預(yù)處理液含有4-8%甘露醇、1.0-1.5g/L的CaCl2和0.8-1.2g/L的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸。
[0045]優(yōu)選地，本發(fā)明獲得的大麥植株葉綠素含量和莖蘗數(shù)都提高。[0046]本發(fā)明提供方法具有以下特征:
[0047]1.麥綠素產(chǎn)品原料取材一般是在6-7葉期，因此6-8周的水培即可完成培養(yǎng)過程，達(dá)到預(yù)定生長(zhǎng)時(shí)期，期間可方便進(jìn)行測(cè)定與取材。根據(jù)本文所述統(tǒng)計(jì)指標(biāo)分別篩選出性狀優(yōu)異的品種。本發(fā)明采用的是人工可控的統(tǒng)一培養(yǎng)條件，在人工氣候室完成，不受季節(jié)控制，篩選具有穩(wěn)定性和可重復(fù)性。2葉1心期的是非常敏感的篩選時(shí)期，品種間的差異比較明顯，不明顯的品種在后期的連續(xù)測(cè)定中也可以進(jìn)行比較。同時(shí)選擇分蘗數(shù)目作為一個(gè)評(píng)價(jià)地上部生物量的指標(biāo)。
[0048]2.篩選目標(biāo)圍繞大麥苗期葉綠素含量和地上部分生物產(chǎn)量?jī)蓚€(gè)目標(biāo)進(jìn)行，不考察材料后生育期籽粒產(chǎn)量等性狀。
[0049]3.對(duì)初步篩選的含有較好目標(biāo)性狀大麥材料，采用小孢子培養(yǎng)技術(shù)獲得純合加倍單倍體(DH)株系，種質(zhì)所有性狀完全純合，隱性性狀可以當(dāng)代表現(xiàn)。
[0050]4.對(duì)單一優(yōu)異目標(biāo)性狀的大麥材料采用雜交技術(shù)聚合目標(biāo)性狀。
[0051]5.根據(jù)目標(biāo)性狀選用不同指標(biāo)進(jìn)行大量篩選，篩選涉及初選材料、純合DH植株、雜交聚合性狀分離后代。
[0052]6.現(xiàn)有的大田篩選技術(shù)通常耗時(shí)2-3年，甚至更長(zhǎng)時(shí)間，才有可能篩選得到具有上述目標(biāo)性狀的可用來制備麥綠素產(chǎn)品的大麥材料，但篩選缺乏穩(wěn)定性和可重復(fù)性。本發(fā)明由于對(duì)小孢子的特殊處理而可大大縮短該篩選時(shí)間，通常在一年內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)。
【具體實(shí)施方式】
[0053]本發(fā)明上述的方法包括:
[0054](I)取大麥小孢子發(fā)育處于單核早期和/或中期的小穗，低溫處理10-30天；
[0055](2)收獲小孢子，培養(yǎng)小孢子，再生獲得純合加倍單倍體；和
[0056](3)水培所述純合加倍單倍體。
[0057]所述“低溫”通常指2-10°C，例如3_5°C。低溫處理指在低溫下放置新鮮采摘的所述小穗。低溫處理的時(shí)間通常是10-30天，例如可以是14-21天不等。
[0058]小孢子通常取自葉綠素含量高、分蘗數(shù)多、生長(zhǎng)迅速的親本材料種子種植得到的大麥。
[0059]本文中，“葉綠素含量高”指就所篩選的批次而言，葉綠素含量相對(duì)較高的植株，例如，指在所篩選批次中葉綠素含量排在前20%的株系，優(yōu)選前10%，更優(yōu)選前5%。當(dāng)然可選自葉綠素含量最聞或相對(duì)最聞的幾株。
[0060]本文中，“分蘗數(shù)多”指就所篩選的批次而言，分蘗數(shù)多相對(duì)較多的植株，例如，指在所篩選批次中分蘗數(shù)排在前20 %的株系，優(yōu)選前10 %，更優(yōu)選前5 %。
[0061]本文中，“生長(zhǎng)迅速”就所篩選的批次而言，生長(zhǎng)速度相對(duì)較快的植株，例如，指在所篩選批次中生長(zhǎng)速度排在前20 %的株系，優(yōu)選前10 %，更優(yōu)選前5 %。
[0062]通常，可首先根據(jù)目標(biāo)性狀，選取一批葉色濃綠、苗期生長(zhǎng)旺盛、分蘗較多的大麥材料，水培后測(cè)定2葉I心期的葉綠素含量，至分蘗期后開始統(tǒng)計(jì)分蘗數(shù)、植株高度和/或莖基部周長(zhǎng)，根據(jù)這些統(tǒng)計(jì)指標(biāo)分別篩選出性狀優(yōu)異的品種，例如篩選出葉綠素含量高、分蘗數(shù)多、生長(zhǎng)迅速的品種。
[0063]可采用已報(bào)道的標(biāo)準(zhǔn)大麥水培營(yíng)養(yǎng)液(改良Hoagland溶液)進(jìn)行水培，該營(yíng)養(yǎng)源配方如下:
[0064]NH4NO3 (0.2mM)、KNO3 (5mM)、Ca NO3.2 (2mM)、MgSO4 (2mM)、KH2PO4 (0.1mM)、Na2Si03(0.5mM)、NaFe (III) - EDTA (0.05mM)、H3BO3 (0.01mM)、MnCl2 (0.005mM)、ZnSO4 (0.005mM)、CuSO4 (0.0005mM)、Na2MoO3 (0.000 ImM)，使用前溶液 pH 值用稀鹽酸調(diào)節(jié)至6.0左右。
[0065]水培可在人工氣候室內(nèi)進(jìn)行。采用日光燈管照明，光照強(qiáng)度約20001x，保持室溫白天20度，晚上18度，溫度波動(dòng)1-2度。
[0066]然后，種植該品種的種子(即親本材料種子)，用于小孢子培養(yǎng)取材?？稍诖筇镏蟹N植，或者，若植株篩選材料不多，也可在篩選后在人工氣候室種植。
[0067]對(duì)于只有其中一個(gè)目標(biāo)性狀優(yōu)異的材料，在花粉成熟后可進(jìn)行相互授粉雜交(正反雜交)，獲得雜交代種子。大田或人工氣候室種植代種子，獲得Fl代植株，用于小孢子培養(yǎng)取材。
[0068]可從大田或人工氣候室中種植的葉綠素含量高、分蘗數(shù)多、生長(zhǎng)迅速的品種中選取中部小花小孢子發(fā)育處于單核早期、中期的小穗進(jìn)行低溫處理10-30天，如前文所述。
[0069]低溫處理后，可采用本領(lǐng)域已知的技術(shù)獲取小孢子。包括消毒、高速離心等。
[0070]本文中，消毒通常用75%酒精浸泡20-60秒,飽和的漂白粉溶液消毒10_20分鐘。通常用75%酒精浸泡30秒，飽和的漂白粉溶液消毒15分鐘。本領(lǐng)域技術(shù)人員周知其它消毒手段。
[0071]消毒后，可用無菌水沖洗數(shù)次，例如3-4次。然后，每個(gè)試管接5-15個(gè)穗子，例如每管10個(gè)穗子。倒入10-20ml、優(yōu)選15ml提取液，用高速分散器超速旋切，過濾(例如，用150目篩網(wǎng)過濾)，離心濾液(例如，以100父8離心5111111，重復(fù)3次)，收集小孢子。提取液優(yōu)選含有4-8%甘露醇、1.0-1.5g/L的CaCl2和0.8-1.2g/L的MES (2_(N_嗎啡啉)乙磺酸)。在一個(gè)具體實(shí)施例中，提取液優(yōu)選6%甘露醇、1.lg/L的CaCl2和0.976g/L的MES。
[0072]可任選地用預(yù)處理液于室溫(例如25°C)、黑暗預(yù)處理36-60小時(shí)，通常處理2天。預(yù)處理液的組成同提取液。
[0073]然后，可任選地用21% (質(zhì)量體積百分比)麥芽糖純化小孢子，再用誘導(dǎo)培養(yǎng)基洗滌I次，然后用誘導(dǎo)培養(yǎng)基將小孢子密度調(diào)節(jié)至0.5-2.0X 105/ml，優(yōu)選1.0X 105/ml，取大約Iml小孢子懸浮液接種于培養(yǎng)皿(例如，35X 15mm的培養(yǎng)皿中)，封口后室溫(25°C )暗培養(yǎng)，誘導(dǎo)愈傷；然后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基獲得再生苗。此處獲得植株為單細(xì)胞培養(yǎng)獲得的純合加倍單倍體(DH)。檢測(cè)出的單倍體可以用秋水仙堿處理直接加倍變成加倍單倍體。
[0074]誘導(dǎo)培養(yǎng)基以N6培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，其中加有6-糠氨基嘌呤(KT) 0.3-0.8mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)0.5-1.5mg/L、和麥芽糖70_120g/L。在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基添加有KT 0.4-0.6mg/L和2，4-D0.8-1.2mg/L,和麥芽糖80_100g/L。在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基添加有KT 0.5mg/L和2，4-D 1.0mg/L，和麥芽糖90g/L。
[0075]常規(guī)的N6培養(yǎng)基的成分基本如下表1所示，不同廠商或文獻(xiàn)所記載的不同成分的濃度或許有些許差別，但其功能都大致相同:
[0076]表1:N6培養(yǎng)基的配方(單位:mg/L):
[0077]
【權(quán)利要求】
1.一種生產(chǎn)高葉綠素含量和/或多莖蘗數(shù)的大麥的方法，所述方法包括: (1)取大麥小孢子發(fā)育處于單核早期和/或中期的小穗，2-10°C處理10-30天； (2)收獲小孢子，培養(yǎng)小孢子，再生獲得純合加倍單倍體； (3)水培所述純合加倍單倍體；和 (4)篩選獲得葉綠素含量高和/或莖蘗數(shù)多的大麥。
2.一種制備麥綠素產(chǎn)品的方法，所述方法包括: (1)取大麥小孢子發(fā)育處于單核早期和/或中期的小穗，低溫處理2-3周； (2)收獲小孢子，培養(yǎng)小孢子，再生獲得純合加倍單倍體；和 (3)水培所述純合加倍單倍體，篩選獲得葉綠素含量高和/或莖蘗數(shù)多的大麥；和 (4)將所述大麥制備成麥綠素產(chǎn)品。
3.一種提高大麥葉綠素含量和/或莖蘗數(shù)的方法，所述方法包括: (1)取大麥小孢子發(fā)育處于單核早期和/或中期的小穗，2-10°C處理10-30天； (2)收獲小孢子，培養(yǎng)小 孢子，再生獲得純合加倍單倍體； (3)水培所述純合加倍單倍體，獲得再生植株； 其中，所述再生植株為葉綠素含量提高和/或莖蘗數(shù)增多的植株。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法在步驟(1)之前還包括: (a)選取一批葉色濃綠、苗期生長(zhǎng)旺盛、分蘗較多的大麥材料，水培后測(cè)定2葉I心期的葉綠素含量，至分蘗期后開始統(tǒng)計(jì)分蘗數(shù)、植株高度和/或莖基部周長(zhǎng)，根據(jù)這些統(tǒng)計(jì)指標(biāo)篩選出葉綠素含量高、分蘗數(shù)多、生長(zhǎng)迅速的品種；和 (b)培養(yǎng)所述品種，獲得步驟(1)所述的小孢子；和 (c)如果大麥材料只具有葉綠素含量高、分蘗數(shù)多、生長(zhǎng)迅速中的一個(gè)目標(biāo)性狀，則在花粉成熟后進(jìn)行相互授粉雜交，獲得雜交代種子，繁育該代種子，獲得Fl代植株，從該Fl代植株獲得步驟(1)所述的小孢子。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)包括: (2a)消毒所述穗子，然后清洗； (2b)從所述穗子分離小孢子； (2c)于室溫、黑暗處理小孢子36-60小時(shí)； (2d)用誘導(dǎo)培養(yǎng)基懸浮小孢子，并將懸浮液接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)愈傷；和 (2e)將誘導(dǎo)所得愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，培養(yǎng)獲得再生苗，即所述純合加倍單倍體。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(2b)中，分離小孢子時(shí)，在試管中加入穗子和提取液，用高速分散器超速旋切，過濾，離心濾液，從而獲得小孢子，其中，所述提取液含有含有4-8%甘露醇、1.0-1.5g/L的CaCl2和0.8-1.2g/L的2_(N_嗎啡啉)乙磺酸。
7.如權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于， 誘導(dǎo)培養(yǎng)基以N6培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，其中加有6-糠氨基嘌呤0.3-0.8mg/L、2，4- 二氯苯氧乙酸0.5-1.5mg/L、和麥芽糖70-120g/L ； 分化培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，其中加有6-芐氨基腺嘌呤0.3-0.8mg/L、KTl.0-2.0mg/L、萘乙酸 0.03-0.08mg/L 和麥芽糖 15_50g/L，用 3_8g/L 瓊脂粉固化。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟(3)之后還包括:將小孢子培養(yǎng)獲得的再生植株放入大麥標(biāo)準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)，進(jìn)行再次篩選，選出葉綠素含量高和/或莖蘗數(shù)多的大麥，并收集其種子。
9.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述麥綠素產(chǎn)品選自:大麥纖維食品、大麥葉促康食品、麥草葉飲料、麥綠素可樂、青麥酶營(yíng)養(yǎng)品，以及在大麥嫩葉汁粉中添加糊精、酵母、胡蘿卜粉、高麗參粉的營(yíng)養(yǎng)滋補(bǔ)品。
10.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所獲得的小孢子用預(yù)處理液于室溫、黑暗預(yù)處理36-60小時(shí)，其中，所述預(yù)處理液含有4-8%甘露醇、1.0-1.5g/L的CaCl2和.0.8-1.2g/L的2 -(N-嗎啡啉)乙磺酸。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK103636505SQ201310713460
【公開日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2013年12月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月20日
【發(fā)明者】劉成洪, 黃劍華, 王亦菲, 陳志偉, 陸瑞菊, 杜志釗, 何婷, 高潤(rùn)紅, 徐紅衛(wèi), 郭桂梅 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院