一種含中性蛋白酶的禽用酶及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種含中性蛋白酶的禽用酶及其制備方法，屬于酶制劑制備【技術(shù)領(lǐng)域】。所述禽用酶以枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物、酸性木聚糖酶、酸性蛋白酶、植酸酶、β-葡聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶、果膠酶、中草藥提取物、保護(hù)劑、激活劑科學(xué)復(fù)配而成，枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物可提高動(dòng)物機(jī)體免疫力、促進(jìn)免疫器官的發(fā)育、促進(jìn)動(dòng)物腸道結(jié)構(gòu)和機(jī)能的成熟、提高動(dòng)物日增重和改善飼料轉(zhuǎn)化率。本發(fā)明的禽用酶為禽類(lèi)提供了安全消化酶，有效減輕了消化負(fù)擔(dān)，提高了原料利用率和生長(zhǎng)率，保護(hù)了環(huán)境，同時(shí)適量的激活劑可在同等條件下充分發(fā)揮酶制劑的效力，節(jié)約酶制劑添加量，中草藥提取物科學(xué)復(fù)配既延長(zhǎng)復(fù)合酶制劑的保質(zhì)期，又可提高飼養(yǎng)畜禽的免疫力。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種含中性蛋白酶的禽用酶及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于酶制劑制備【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是一種含中性蛋白酶的禽用酶及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在飼料中添加酶制劑主要有以下4個(gè)理由:1.降解在動(dòng)物飼料中存在的抗?fàn)I養(yǎng)因子。這些物質(zhì)不能被動(dòng)物內(nèi)源酶降解，從而干擾動(dòng)物的正常代謝，導(dǎo)致動(dòng)物消化不良，生產(chǎn)性能下降。2.提高淀粉、蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)的利用率。這些物質(zhì)或者被富含纖維的細(xì)胞壁包圍，或者以某些不能被動(dòng)物消化的結(jié)構(gòu)形式存在(例如在植物飼料原料中，大量的磷以植酸磷的形式存在。)。3.在原料中降解某些特定的化學(xué)鍵。這些化學(xué)鍵不能被動(dòng)物自身的酶所降解，加入外源酶以后可以釋放更多的營(yíng)養(yǎng)物。4.由于幼齡動(dòng)物自身消化系統(tǒng)還不成熟，內(nèi)源酶不足添加外源酶可以提高飼料消化率，防止出現(xiàn)消化不良癥狀。除了可以提高日糧的利用率以外，加酶還可以減少飼料原料之間的差異，提高飼料配方的精確性，同時(shí)還可以提高動(dòng)物生長(zhǎng)的整齊性，減少管理成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。使用酶制劑還可以保護(hù)環(huán)境。由于飼料的利用率提高了，相應(yīng)的糞便排放量下降了。在效果比較明顯的情況下，糞便的排放量可以減少20%左右，豬糞中氮的排放下降15%左右，雞糞中氮的排放下降20%。對(duì)于植酸磷，可以大幅度減少磷對(duì)環(huán)境的污染。
[0003]目前在飼料工業(yè)中應(yīng)用的酶制劑主要有4大類(lèi):分別用來(lái)降解纖維素、蛋白質(zhì)、淀粉和植酸。
[0004]纖維降解酶:對(duì)于單胃動(dòng)物來(lái)說(shuō)，消化的最大阻力是不能產(chǎn)生降解纖維的酶，在含有小麥、大麥、燕麥等組分的日糧中，很大一部分纖維是阿拉伯木聚糖和β—葡聚糖。水溶性的纖維能提高小腸內(nèi)容物的粘度，阻礙養(yǎng)分的吸收，從而降低動(dòng)物的生長(zhǎng)性能。同時(shí)這種狀況還和一些由于消化不良引起的疾病有關(guān)。如豬的性欲減退、禽的黑趾癥和小豬拉稀。由于品種、生長(zhǎng)地點(diǎn)和氣候條件等因素的影響，大麥和小麥中纖維含量的變化很大，導(dǎo)致含有這些組分的日糧的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值差異很大。纖維降解酶、木聚糖酶和β—葡聚糖可以減少這些差異，提高動(dòng)物的生長(zhǎng)性能和整齊度。同時(shí)還可以減少某些消化不良的疾病。
[0005]蛋白降解酶:在動(dòng)物日糧中蛋白質(zhì)來(lái)自各種詞料原料，它們最終通過(guò)降解的氣基酸存積在瘦肉中。在單胃動(dòng)物日糧中，添加蛋白酶(不同飼料原料蛋白質(zhì)和品質(zhì)和可利用性)除了能充分降解大部分儲(chǔ)蛋白質(zhì)或儲(chǔ)藏蛋白質(zhì)或?yàn)閯?dòng)物可利用的小分子肽外，還能夠通過(guò)降解抗?fàn)I養(yǎng)因素而改善飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。存積的效率差異很大。在植物蛋白源，如豆餅粉中存在著一些抗?fàn)I養(yǎng)因子，如幾鞣質(zhì)和胰蛋白酶抑制因子，可能會(huì)對(duì)小腸吸收表面造成損害，影響營(yíng)養(yǎng)物的吸收。另外，幼齡動(dòng)物不完善的消化體系使得植物蛋白(如豆餅粉)中的蛋白質(zhì)不能得到很好的利用。
[0006]淀粉降解酶:許多營(yíng)養(yǎng)學(xué)家認(rèn)為玉米是飼料原料的"黃金標(biāo)準(zhǔn)"。絕大數(shù)營(yíng)養(yǎng)學(xué)家認(rèn)為玉米不存在消化不良性，消化率超過(guò)95%，但是最近Noy和Sklan研究表明(1994年)在理想狀態(tài)下，4一 12日齡的肉雞日糧中，淀粉的消化率很少超過(guò)85%，添加淀粉酶可以使淀粉在小腸得到更多更快的降解。在仔豬斷奶期，由于營(yíng)養(yǎng)、環(huán)境和免疫系統(tǒng)的變化，體重會(huì)下降。在日糧中添加淀粉酶和其他一些酶，可以增加動(dòng)物內(nèi)源消化酶分泌，進(jìn)而改進(jìn)營(yíng)養(yǎng)的消化吸收，提高飼料轉(zhuǎn)化率和動(dòng)物生長(zhǎng)率。
[0007]植酸降解酶:對(duì)于所有的動(dòng)物來(lái)說(shuō)，磷對(duì)于骨骼的礦化、免疫、繁殖、生長(zhǎng)都是至關(guān)重要的。豬和家禽單胃動(dòng)物只能里利用植物飼料中30— 40%的磷，其余60— 70%的植酸磷事故無(wú)法利用的。在許多情況下，飼料日糧中必須補(bǔ)充無(wú)機(jī)磷來(lái)滿(mǎn)足動(dòng)物生長(zhǎng)的需要。飼料中一半以上的磷隨著糞便排放到環(huán)境中，污染環(huán)境。添加植酸酶可以降解植酸，釋放植酸分子中的磷。這樣可以產(chǎn)生2個(gè)益處:1.減少了飼料中磷的添加量。2.減少了禽類(lèi)糞便對(duì)環(huán)境的磷污染。
[0008]顯而易見(jiàn):作為飼料酶種的四大主角，他們的作用機(jī)理和模式在很大程度決定或推動(dòng)了動(dòng)物飼料產(chǎn)業(yè)對(duì)于酶制劑技術(shù)的吸收運(yùn)用。目前在肉雞料中添加酶的產(chǎn)出投入比例超過(guò)2:1。相對(duì)而言，在養(yǎng)豬業(yè)領(lǐng)域，酶制劑的使用情況就比較復(fù)雜，顯得不明朗。集約化程度低，涉及環(huán)節(jié)比較多，酶制劑的使用效果很難進(jìn)行商業(yè)計(jì)算。盡管在20世紀(jì)50年代已經(jīng)有了使用酶制劑的設(shè)想，但是直到20世紀(jì)80年代才開(kāi)始懂得如何在飼料工業(yè)中發(fā)揮酶的力量。飼料谷物，如小麥和大麥都含有比較高的單胃動(dòng)物不能利用的纖維。如果纖維能夠被降解，動(dòng)物就能更好地利用營(yíng)養(yǎng)物。在歐洲，大麥比較便宜，禽類(lèi)營(yíng)養(yǎng)學(xué)家和酶學(xué)家投入了大量精力研究了在含有大麥的肉雞日糧中添加β—葡聚糖酶以減少其負(fù)面影響的可能性。其結(jié)果被證明是成功的，并得到了一個(gè)黃金定律:大麥+β—葡聚糖酶=小麥。受到上述成功的鼓舞，小麥?zhǔn)堑诙€(gè)的研究對(duì)象。理論假設(shè)是:小麥+木聚糖酶=玉米。這一步的研究也獲得了成功。在20世紀(jì)90年代中期，酶在飼料工業(yè)得到了普遍認(rèn)可?？梢院敛豢鋸埖卣f(shuō):1996年，在歐洲80%的肉雞料(粘性谷物為能量來(lái)源)中含有纖維降解酶。由此強(qiáng)化和加快飼料產(chǎn)業(yè)對(duì)新技術(shù)的應(yīng)用。從全球范圍來(lái)看，大約65%的含有能產(chǎn)生粘性谷物的家禽飼料添加了纖維降解酶。而在豬飼料中的應(yīng)用比例要低得多，接近10%。其主要原因是市場(chǎng)的結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，市場(chǎng)呈多元化，甚至無(wú)法測(cè)算。從地理分布來(lái)看，使用纖維素降解酶的地區(qū)主要集中在粘性谷物作為主要能量飼料的產(chǎn)區(qū)，例如:歐洲、加拿大、澳大利亞和新西蘭。另外，在美國(guó)、南美和亞太地區(qū)，使用情況取決于玉米和小麥之間的比價(jià)。從這個(gè)意義上講，歐洲是使用降解纖維素酶的核心細(xì)分市場(chǎng)。為了獲得全球的認(rèn)可，飼用酶廠(chǎng)家必須大舉進(jìn)軍以玉米一豆柏型日糧為主的北美和亞太地區(qū)。玉米一豆柏型日糧歷來(lái)被看作是"黃金標(biāo)準(zhǔn)"，盡管許多營(yíng)養(yǎng)學(xué)家認(rèn)為這些原料的變動(dòng)性要比原來(lái)設(shè)想的變動(dòng)性要大得多?，F(xiàn)在，越來(lái)越多的證據(jù)表明這種黃金日糧也可以通過(guò)酶而改善其生產(chǎn)性能，盡管這類(lèi)日糧與粗纖維或粘度相關(guān)的問(wèn)題不嚴(yán)重。過(guò)去10年在研發(fā)玉米-豆柏第一代飼料酶上耗費(fèi)很多，并于1996年開(kāi)始成功應(yīng)用，初期應(yīng)用結(jié)果五花八門(mén)，但業(yè)界正開(kāi)始變得越來(lái)越明白如何才能得心應(yīng)手，加酶技術(shù)獲得最大經(jīng)濟(jì)回報(bào)。據(jù)估算，該部分飼料酶市場(chǎng)份額為2千萬(wàn)美元，實(shí)際在使用玉米-豆柏日糧的肉雞飼料只有5%為加酶飼料。1999/2000年一降低粘度和粗纖維為日糧的飼料酶市場(chǎng)價(jià)值超過(guò)I億美元。目前，植酸酶已經(jīng)得到了全球的承認(rèn)和應(yīng)用。植酸酶的市場(chǎng)份額大約是每年5000萬(wàn)美元，在全球約有8.0%左右的豬禽飼料添加植酸酶。除了經(jīng)濟(jì)利益的原因外，還有一個(gè)因素是減少了糞中植酸磷的含量有利于保護(hù)環(huán)境。
[0009]綜上所述，禽用酶的應(yīng)用有著其廣闊的市場(chǎng)空間和巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，但禽用酶的熱穩(wěn)定性、安全性、復(fù)配全面性及作用效果的充分發(fā)揮仍是酶制劑生產(chǎn)廠(chǎng)家和廣大養(yǎng)殖戶(hù)共同關(guān)注的一個(gè)重要問(wèn)題，制備更安全，更全面，酶作用效果更好的禽用酶是本行業(yè)技術(shù)人員的共同責(zé)任和追求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題是以含高酶活力、作用條件寬泛、穩(wěn)定性強(qiáng)的中性蛋白酶的枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物為基礎(chǔ)，并科學(xué)復(fù)配中草藥提取物、保護(hù)劑、激活劑和其它食品級(jí)飼料酶，制得的含中性蛋白酶的禽用酶，不但為飼養(yǎng)禽類(lèi)提供了安全、全面的消化酶，減輕消化負(fù)擔(dān)，提高原料利用率和生長(zhǎng)率，有效保護(hù)環(huán)境，同時(shí)適量的激活劑可在同等條件下充分發(fā)揮酶制劑的效力，物盡其用，節(jié)約酶制劑添加量，中草藥提取物的科學(xué)復(fù)配既可延長(zhǎng)復(fù)合酶制劑的保質(zhì)期，又可提高飼養(yǎng)禽類(lèi)的免疫力，從而達(dá)到一酶多用的效果。
[0011]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0012]一種含中性蛋白酶的禽用酶，由以下重量份數(shù)的酶制劑組成:
[0013]枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物30-40份，酸性木聚糖酶40-60份，酸性蛋白酶20_30份，植酸酶20-30份，β -葡聚糖酶15-20份，纖維素酶10-15份，淀粉酶10-15份，果膠酶5_10份，中草藥提取物10-15份，保護(hù)劑10-15份，激活劑10-15份。
[0014]所述酸性木聚糖酶、酸性蛋白酶、植酸酶、β -葡聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶、果膠酶均為食品級(jí)酶制劑；
[0015]所述枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物由產(chǎn)強(qiáng)熱穩(wěn)定性中性蛋白酶的菌株枯草芽孢桿菌1398-2-12經(jīng)液體深層發(fā)酵制備，其成分主要包括中性蛋白酶和枯草芽孢桿菌菌體；
[0016]所述枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物的制備方法如下:
[0017]枯草芽孢桿菌1398-2-12經(jīng)斜面菌種活化和逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)(包括一、二、三級(jí)種子培養(yǎng)以及一級(jí)種子罐培養(yǎng))獲得液體種子；將液體種子以6%接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度30-36°C，攪拌速度200-700rpm，通風(fēng)量(V/V) 1:1-3,培養(yǎng)時(shí)間10_15h ;然后以1-2°C /h降溫速率緩慢降溫至10-15°C，恒溫培養(yǎng)15-20h ;繼續(xù)以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至
2-5°C，此時(shí)，將液體種子以4%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)20-30h ;最后以1_2°C /h升溫速率緩慢升溫至10_15°C，恒溫培養(yǎng)15-20h ;繼續(xù)以1-2°C /h升溫速率緩慢升溫至30-36°C，恒溫培養(yǎng)15-20h ;發(fā)酵液經(jīng)孔徑10-1000 μ m過(guò)濾紙板粗濾，然后于10_20°C循環(huán)超濾濃縮去除水分得固形物含量20-40%濃縮液；濃縮液經(jīng)真空冷凍干燥、超微粉碎得枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物。
[0018]所述斜面培養(yǎng)基組成為:牛肉膏3-10g，氯化鈉5_12g，蛋白胨10_20g，葡萄糖 2-5g, (NH)2S043-5g，K2HP046_8g，CaCl2l_3g，瓊脂 15_20g，中草藥粉劑 5-10g,蒸餾水IOOOmL, pH 值 7.0-7.2，121°C滅菌 20min ；
[0019]所述中草藥粉劑的制備方法如下:
[0020]以重量份數(shù)計(jì)，稱(chēng)取黃芪20-30份；黨參10-18份；柴胡10-15份；黃芩10-15份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3-6倍重量的水，控制溫度70°C?90°C保持2?4h，然后降溫至45-60°C，加入混合酶制劑進(jìn)行酶解，用乳酸調(diào)節(jié)PH值為5.5-6.8，酶解2-4h，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至60°C?78°C保持3?4h，過(guò)濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑。
[0021]所述混合酶添加量為混合物料總重量的5_10%。[0022]所述混合酶的重量份數(shù)組成為:內(nèi)β -葡聚糖酶10-20份，外β -葡聚糖酶10-20份，β -葡萄糖苷酶10-15份，木聚糖酶15-20份，戊聚糖酶15-20份，普魯蘭酶20-30份，β -淀粉酶10-15份，中性蛋白酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，超氧化物歧化酶5_10份，葡萄糖氧化酶5-10份，酸性磷酸酶5-10份。
[0023]所述乙醇和丙醇的質(zhì)量比例為1:1-1.5。
[0024]所述一、二、三級(jí)種子培養(yǎng)基重量組成為:
[0025]酵母粉0.3-0.5%，葡萄糖1-1.5%，蛋白胨0.3-0.5%，牛肉膏0.5-0.8%，磷酸氫二鉀0.8-1.5%，中草藥粉劑1.5-2%，海藻糖1-3%，硫酸鈣0.1%,氯化鎂0.2%,檸檬酸鈉
0.1-0.3%，不足部分純凈水補(bǔ)足，pH 值 7.0-7.2，121_123°C滅菌 30_40min。
[0026]所述一級(jí)種子罐培養(yǎng)基重量組成為:
[0027]麥芽糊精5-15%，酵母粉0.4-0.8%，中草藥粉劑1.5-2%,海藻糖1-3%,蛋白胨
0.1-0.5%，玉米漿 0.1-0.5%，磷酸氫二鉀 0.8-1.5%，硫酸鎂 0.05-0.1%，檸檬酸鈉 0.1-0.5%，不足部分純凈水補(bǔ)足，pH值7.0-7.2，121-123°C滅菌30_40min。
[0028]所述種子罐發(fā)酵液菌體濃度為7.0x108-8.0xlO8個(gè)/ml ；
[0029]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麥芽糊精50_150g，玉米粉50_60g，豆餅粉15_25g，中草藥粉劑30-50g，海藻糖30-40g，酵母粉4-8g，玉米漿l_5g，硫酸銨l_3g，磷酸氫二鉀l_2g，磷酸二氫鉀l_2g，檸檬酸鈉l_5g，消泡劑0.Ι-lg,純凈水lOOOmL，pH值7.0-7.2，121°C滅菌 20min ；
[0030]所述補(bǔ)料培養(yǎng)基重量組成為:麥芽糊精20-30%，玉米粉10-20%，豆粉15_25%，中草藥粉劑5-10%，不足部分純凈水補(bǔ)足，pH值7.0-7.2，121_123°C滅菌30_40min。
[0031]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的調(diào)配方法為:
[0032]按比例準(zhǔn)確稱(chēng)取原料，將原料中的純凈水、玉米粉、豆餅粉投入配料罐中，調(diào)節(jié)PH值7.0-7.2，加入中溫淀粉酶(3u/g玉米粉)與高溫淀粉酶(30u/g玉米粉)，同時(shí)邊攪拌邊升溫至70°C保溫15-30min，然后緩慢升溫至90°C保溫15_30min進(jìn)行液化，最后加入其它原料，攪拌均勻，調(diào)初始PH7.0-7.2，121-123°C滅菌30_40min備用。
[0033]所述中草藥提取物的制備方法為:分別將中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3-6倍重量的水，控制溫度70°C?90°C保持2?4h，然后降溫至45-600C，加入混合酶制劑進(jìn)行酶解，用乳酸調(diào)節(jié)pH值為5.5-6.8，酶解2_4h，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至60°C?78°C保持3?4h，過(guò)濾；濾液減壓濃縮至固形物含量為20%以上，然后冷凍干燥獲得中草藥提取物。
[0034]所述中草藥的重量份數(shù)組成為:沙棘20-30份，決明子20-30份，枸杞10_15份，山藥10-15份，北沙參5-10份，黃荊子5-10份，玉竹3-5份，薏米3_5份，大麥芽3_5份，桂花
3-5份，黃芪3-5份；
[0035]所述混合酶添加量為混合物料總重量的5-10% ；
[0036]所述混合酶的重量份數(shù)組成為:內(nèi)β -葡聚糖酶10-20份，外β -葡聚糖酶10-20份，β -葡萄糖苷酶10-15份，木聚糖酶15-20份，戊聚糖酶15-20份，普魯蘭酶20-30份，β -淀粉酶10-15份，中性蛋白酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，超氧化物歧化酶5_10份，葡萄糖氧化酶5-10份，酸性磷酸酶5-10份；
[0037]所述保護(hù)劑由以下重量份數(shù)的原料組成:海藻糖20-30份，NaC120_30份，(NH4)2S0410-15 份，半胱氨酸 10-15 份。
[0038]所述激活劑是由如下質(zhì)量組份的無(wú)機(jī)鹽均勻混合而成:氯化鋅30-40份，氯化鈣10-20份，硫酸鈉10-20份，氯化鎂5-10份。
[0039]本發(fā)明含中性蛋白酶的禽用酶的制備方法:
[0040]將所述保護(hù)劑、中草藥提取物分別超微粉碎，確保粒度小于其它酶制劑，然后與枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物、酸性木聚糖酶、酸性蛋白酶、植酸酶、葡聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶、果膠酶均勻混合，最后加入激活劑，混合均勻后密封包裝即得成品含中性蛋白酶的禽用酶。
[0041]所述禽用酶適用于飼料加工廠(chǎng)和養(yǎng)殖場(chǎng)自配飼料，使用時(shí)應(yīng)與飼料中的其它原料混合均勻，可事先將本發(fā)明與少量飼料混合均勻，再混合到大批飼料中，直接飼喂。建議每噸全價(jià)料添加量為:100-120g ；
[0042]本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌1398-2-12是由實(shí)驗(yàn)室保藏的一株產(chǎn)中性蛋白酶的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)1398_2經(jīng)紫外線(xiàn)-氯化鋰-硫酸二乙酯復(fù)合誘變篩選獲得。
[0043]本發(fā)明提供的產(chǎn)強(qiáng)熱穩(wěn)定性中性蛋白酶的菌株具體為枯草芽孢桿菌1398-2-12。該菌株已于2013年11月3日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CCTCC，地址為:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院郵編:430072)，保藏號(hào)為CCTCC NO: M2013539，分類(lèi)命名為:枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) 1398-2-12。
[0044]所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) 1398-2-12菌株特點(diǎn)如下:
[0045]所述菌株在固體平板上菌落顏色為乳白色，表面干燥不透明，邊緣整齊，為具有運(yùn)動(dòng)性的好氧菌。鏡檢為長(zhǎng)桿狀，革蘭氏染色呈陽(yáng)性。該菌可利用檸檬酸鹽，硝酸還原、V-P實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性。
[0046]本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌1398-2-12具有所產(chǎn)中性蛋白酶耐受溫度高、適用pH值范圍寬泛的特點(diǎn)，發(fā)酵液粗酶液75°C酶活完全穩(wěn)定，最適反應(yīng)溫度70°C，pH值4.5-8.5酶活穩(wěn)定，最適反應(yīng)pH值7.2。該菌株最適生長(zhǎng)PH值7.0-7.2，最適生長(zhǎng)溫度30-36°C，最適產(chǎn)酶溫度32-35 °C。
[0047]按誘變篩選方案，對(duì)突變株逐級(jí)篩選淘汰，最后對(duì)優(yōu)良菌株經(jīng)發(fā)酵性能測(cè)試篩選，得到一株產(chǎn)強(qiáng)熱穩(wěn)定性中性蛋白酶的菌株枯草芽孢桿菌菌1398-2-12，發(fā)酵液中性蛋白酶酶活可達(dá)5500-7000U/mL，對(duì)酶的熱穩(wěn)定性進(jìn)行了分析，將粗酶液分別置于40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C下，每隔 10 分鐘取樣測(cè)定酶活。40°C、45°C、50°C、55°C下，60分鐘酶活沒(méi)有下降。60°C與65°C下，30分鐘降到原有酶活的95%，60分鐘降到85%。70°C下，30分鐘降到原有酶活的85%，60分鐘降到80%。75°C下，30分鐘降到原有酶活的80%,60分鐘降到70%。
[0048]有益效果:
[0049]1.本發(fā)明枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物發(fā)酵液中含有的中性蛋白酶酶活可達(dá)5500-7000U/mL，在40-70°C之間具有較高的酶活，最適反應(yīng)溫度為70°C;在pH值為4.5-8.5時(shí)酶活完全穩(wěn)定，最適反應(yīng)pH值為7.2 ;該酶在70°C條件下保存Ih后仍能保持80%以上酶活，75°C條件下保存Ih后保持70%以上酶活。比現(xiàn)有的中性蛋白酶熱穩(wěn)定性強(qiáng)，酶活力較高，酶作用最適PH值范圍寬泛，儲(chǔ)存穩(wěn)定性高，更加適合飼養(yǎng)禽類(lèi)飼料的添加。
[0050]2.本發(fā)明枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物中的枯草芽孢桿菌菌體可提高動(dòng)物機(jī)體免疫力、促進(jìn)免疫器官的發(fā)育、促進(jìn)動(dòng)物腸道結(jié)構(gòu)和機(jī)能的成熟、提高動(dòng)物日增重和改善飼料轉(zhuǎn)化率，更加適合飼養(yǎng)禽類(lèi)飼料的添加。
[0051]3.本發(fā)明含中性蛋白酶的禽用酶中的保護(hù)劑采用多糖、無(wú)機(jī)鹽和氨基酸科學(xué)復(fù)配，有效減緩了復(fù)合酶制劑的回潮；同時(shí)可增強(qiáng)復(fù)合酶的耐凍、耐熱性能，保持相同的酶活力，其耐熱溫度可提高20-30°C，耐冷凍溫度可降低10-15°C，有效防止了復(fù)合酶在運(yùn)輸、保存和使用過(guò)程中酶活力的損失，延長(zhǎng)了復(fù)合酶的保質(zhì)期，達(dá)到同樣的酶活力，比同類(lèi)產(chǎn)品保質(zhì)期可延長(zhǎng)2-3年。
[0052]4.本發(fā)明含中性蛋白酶的禽用酶添加無(wú)機(jī)鹽作為激活劑，創(chuàng)造了酶催化作用的最佳條件，充分發(fā)揮了復(fù)合酶各酶組份的活力，徹底有效的分解了飼料中淀粉、蛋白質(zhì)、纖維素、植酸等大分子物質(zhì)，大大減輕了禽類(lèi)動(dòng)物的消化負(fù)擔(dān)，提高了原料利用率和禽類(lèi)的生長(zhǎng)率，同時(shí)有效防止了禽類(lèi)糞便造成的環(huán)境污染，保護(hù)了飼養(yǎng)環(huán)境。
[0053]5.本發(fā)明含中性蛋白酶的禽用酶添加的中草藥提取物既可延長(zhǎng)復(fù)合酶制劑的保質(zhì)期，又可提高飼養(yǎng)禽類(lèi)的免疫力，有效防止禽類(lèi)流行性疾病的發(fā)生。
[0054]6.本發(fā)明含中性蛋白酶的禽用酶中枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物、保護(hù)劑、激活劑、中草藥提取物與酶制劑的協(xié)同作用，使得復(fù)合酶的酶活力和效力最大限度的發(fā)揮，并相應(yīng)的提高了飼料的利用率和動(dòng)物的生長(zhǎng)率，增強(qiáng)了動(dòng)物的食欲和抗病能力，延長(zhǎng)了復(fù)合酶的保質(zhì)期和保護(hù)了環(huán)境。
【具體實(shí)施方式】
[0055]下面通過(guò)具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí)施方案應(yīng)理解為說(shuō)明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書(shū)所限定。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對(duì)這些實(shí)施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動(dòng)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0056]實(shí)施例1
[0057]一種含中性蛋白酶的禽用酶，由以下重量份數(shù)的酶制劑組成:
[0058]枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物35份，酸性木聚糖酶50份，酸性蛋白酶25份，植酸酶25份，β -葡聚糖酶17份，纖維素酶12份，淀粉酶12份，果膠酶8份，中草藥提取物12份，保護(hù)劑12份，激活劑12份。
[0059]所述酸性木聚糖酶、酸性蛋白酶、植酸酶、β -葡聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶、果膠酶均為食品級(jí)酶制劑；
[0060]所述枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物的制備方法包括如下步驟:
[0061](I)將保存完好的枯草芽孢桿菌1398-2-12的斜面菌種接種于斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)24h進(jìn)行菌種活化，如此活化2次；
[0062]所述斜面培養(yǎng)基組成為:牛肉膏3g，氯化鈉5g，蛋白胨10g，葡萄糖2g，(NH)2S043g,K2HP046g, CaCl2Ig,瓊脂 15g，中草藥粉劑 5g，蒸餾水 IOOOmL, pH 值 7.0,121°C滅菌 20min ；
[0063]所述中草藥粉劑的制備方法如下:
[0064]以重量份數(shù)計(jì)，稱(chēng)取黃芪20份；黨參10份；柴胡10份；黃芩10份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3倍重量的水，控制溫度70°C保持2h，然后降溫至45°C，加入混合物料總重量5%的混合酶制劑進(jìn)行酶解，用乳酸調(diào)節(jié)pH值為5.5，酶解2h，最后添加混合物料0.5倍重量乙醇和丙醇的混合物，所述乙醇和丙醇的質(zhì)量比例為1:1，控制溫度至60°C保持3h，過(guò)濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑。
[0065]所述混合酶的重量份數(shù)組成為:內(nèi)葡聚糖酶10份，外葡聚糖酶10份，β -葡萄糖苷酶10份，木聚糖酶15份，戊聚糖酶15份，普魯蘭酶20份，β -淀粉酶10份，中性蛋白酶10份,酸性蛋白酶10份,超氧化物歧化酶5份,葡萄糖氧化酶5份,酸性磷酸酶5份。
[0066](2)液體種子擴(kuò)大培養(yǎng)
[0067]①一級(jí)種子培養(yǎng):將步驟(I)活化后的斜面菌種I環(huán)接入500毫升搖瓶中，培養(yǎng)基裝量100毫升，旋轉(zhuǎn)式搖床180轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)時(shí)間IOh ；
[0068]②二級(jí)種子培養(yǎng):將一級(jí)種子按照10%的接種量接入500毫升二級(jí)種子搖瓶中，培養(yǎng)條件與一級(jí)種子相同；
[0069]③三級(jí)種子培養(yǎng):將二級(jí)種子以10%接種量接入5000暈升三級(jí)種子搖瓶中，培養(yǎng)基裝量1000毫升，旋轉(zhuǎn)式搖床100轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)時(shí)間IOh ；
[0070]④一級(jí)種子罐培養(yǎng):將三級(jí)種子以10%接種量接入總?cè)莘e為150L的一級(jí)種子罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L，培養(yǎng)溫度30°C，攪拌速度200rpm，通風(fēng)量(V/V) 1:1,罐壓0.05Mpa,培養(yǎng)時(shí)間IOh ；
[0071]所述一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)種子培養(yǎng)基重量組成為:
[0072]酵母粉0.3%，葡萄糖1%，蛋白胨0.3%，牛肉膏0.5%，磷酸氫二鉀0.8%，中草藥粉劑
1.5%，海藻糖1%，硫酸鈣0.1%,氯化鎂0.2%,檸檬酸鈉0.1%，不足部分純凈水補(bǔ)足，pH值7.0,121°C滅菌 30min。
[0073]所述一級(jí)種子罐培養(yǎng)基重量組成為:
[0074]麥芽糊精5%，酵母粉0.4%，中草藥粉劑1.5%，海藻糖1%，蛋白胨0.1%，玉米漿
0.1%，磷酸氫二鉀0.8%，硫酸鎂0.05%,檸檬酸鈉0.1%，不足部分純凈水補(bǔ)足，pH值7.0，121°C 滅菌 30min。
[0075]所述種子罐發(fā)酵液菌體濃度為7.0xlO8個(gè)/ml ；
[0076](3)發(fā)酵罐發(fā)酵
[0077]將步驟(2)中一級(jí)種子罐發(fā)酵液以6%接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度30°C，攪拌速度200r/m，通風(fēng)量(V/V)l:l，培養(yǎng)時(shí)間IOh ;然后以1°C /h降溫速率緩慢降溫至10°C，恒溫培養(yǎng)15h ;繼續(xù)以1°C /h降溫速率緩慢降溫至2°C，此時(shí)，將步驟(2)中一級(jí)種子罐發(fā)酵液以4%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)20h ;最后以1°C /h升溫速率緩慢升溫至10°C，恒溫培養(yǎng)15h ;繼續(xù)以1°C /h升溫速率緩慢升溫至30°C，恒溫培養(yǎng)15h ；
[0078]溶解氧控制:通過(guò)調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速及通風(fēng)量，控制溶解氧15% ；
[0079]pH控制:通過(guò)補(bǔ)氨水或稀磷酸，控制發(fā)酵過(guò)程中pH值保持在7.0 ；
[0080]補(bǔ)料控制:添加補(bǔ)料培養(yǎng)基，以維持發(fā)酵液還原糖含量為2_5mg/ml ；
[0081 ] 放罐標(biāo)準(zhǔn):60-80%菌體衰老自溶，酶活力增長(zhǎng)緩慢。
[0082]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麥芽糊精50g，玉米粉50g，豆餅粉15g，中草藥粉劑30g，海藻糖30g，酵母粉4g，玉米漿lg，硫酸銨lg，磷酸氫二鉀lg，磷酸二氫鉀lg，檸檬酸鈉lg，消泡劑 0.1g,純凈水 IOOOmL, pH 值 7.0,121°C滅菌 20min ；
[0083]所述補(bǔ)料培養(yǎng)基重量組成為:麥芽糊精20%，玉米粉10%，豆粉15%，中草藥粉劑5%，不足部分純凈水補(bǔ)足，pH值7.0，121°C滅菌30min。
[0084]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的調(diào)配方法為:
[0085]按比例準(zhǔn)確稱(chēng)取原料，將原料中的純凈水、玉米粉、豆餅粉投入配料罐中，調(diào)節(jié)PH值7.0，加入中溫淀粉酶(3u/g玉米粉)與高溫淀粉酶(30u/g玉米粉)，同時(shí)邊攪拌邊升溫至70°C保溫15min，然后緩慢升溫至90°C保溫15min進(jìn)行液化，最后加入其它原料，攪拌均勻，調(diào)初始ρΗ7.0,121°C滅菌30min備用。
[0086](4)發(fā)酵液經(jīng)孔徑10 μ m過(guò)濾紙板粗濾，然后于10°C循環(huán)超濾濃縮去除水分得固形物含量為20%濃縮液；濃縮液經(jīng)真空冷凍干燥、超微粉碎得枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物。
[0087]所述中草藥提取物的制備方法為:分別將中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加5倍重量的水，控制溫度80°C保持3h，然后降溫至53°C，加入混合酶制劑進(jìn)行酶解，用乳酸調(diào)節(jié)PH值為6.2，酶解3h，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至69°C保持4h，過(guò)濾；濾液減壓濃縮至固形物含量為20%以上，然后冷凍干燥獲得中草藥提取物。
[0088]所述中草藥的重量份數(shù)組成為:沙棘25份，決明子25份，枸杞17份，山藥13份，北沙參8份，黃荊子7份，玉竹4份，薏米4份，大麥芽4份，桂花4份，黃芪4份；
[0089]混合酶添加量為混合物料總重量的5-10% ；
[0090]所述混合酶的重量份數(shù)組成為:內(nèi)β -葡聚糖酶15份，外β -葡聚糖酶15份，β -葡萄糖苷酶13份，木聚糖酶13份，戊聚糖酶13份，普魯蘭酶25份，β -淀粉酶12份，中性蛋白酶13份，酸性蛋白酶13份，超氧化物歧化酶7份，葡萄糖氧化酶7份，酸性磷酸酶7份;
[0091]所述保護(hù)劑由以下重量份數(shù)的原料組成:海藻糖25份，NaC125份，(NH4) 2S0413份，半胱氨酸12份。
[0092]所述激活劑是由如下質(zhì)量組份的無(wú)機(jī)鹽均勻混合而成:氯化鋅35份，氯化鈣15份，硫酸鈉15份，氯化鎂7份。
[0093]含中性蛋白酶的禽用酶的制備方法:
[0094]將所述保護(hù)劑、中草藥提取物分別超微粉碎，確保粒度小于其它酶制劑，然后與枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物、酸性木聚糖酶、酸性蛋白酶、植酸酶、葡聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶、果膠酶均勻混合，最后加入激活劑，混合均勻后密封包裝即得成品含中性蛋白酶的禽用酶。
[0095]實(shí)施例2:
[0096]一種含中性蛋白酶的禽用酶，由以下重量份數(shù)的酶制劑組成:
[0097]枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物30份，酸性木聚糖酶40份，酸性蛋白酶20份，植酸酶20份，β -葡聚糖酶15份，纖維素酶10份，淀粉酶10份，果膠酶5份，中草藥提取物10份，保護(hù)劑10份，激活劑10份。
[0098]所述酸性木聚糖酶、酸性蛋白酶、植酸酶、β -葡聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶、果膠酶均為食品級(jí)酶制劑；
[0099]所述枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物的制備方法包括如下步驟:
[0100](I)菌種活化[0101]將保存完好的枯草芽孢桿菌1398-2-12的斜面菌種接種于斜面培養(yǎng)基，33°C培養(yǎng)30h進(jìn)行菌種活化，如此活化2次；
[0102]所述斜面培養(yǎng)基組成為:牛肉膏6g，氯化鈉8g，蛋白胨15g，葡萄糖4g，(NH)2S044g,K2HP047g, CaCl22g，瓊脂 18g，中草藥粉劑 8g，蒸餾水 IOOOmL, pH 值 7.2，121°C滅菌 20min ；
[0103]所述中草藥粉劑的制備方法如下:
[0104]以重量份數(shù)計(jì)，稱(chēng)取黃芪25份；黨參16份；柴胡12份；黃芩12份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加5倍重量的水，控制溫度80°C保持3h，然后降溫至50°C，加入混合物料總重量8%的混合酶制劑進(jìn)行酶解，用乳酸調(diào)節(jié)pH值為6.0，酶解3h，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，所述乙醇和丙醇的質(zhì)量比例為1:1.2，控制溫度至70°C保持4h，過(guò)濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑。
[0105]所述混合酶的重量份數(shù)組成為:內(nèi)葡聚糖酶15份，外葡聚糖酶15份，β -葡萄糖苷酶12份，木聚糖酶18份，戊聚糖酶18份，普魯蘭酶25份，β -淀粉酶12份，中性蛋白酶12份，酸性蛋白酶12份，超氧化物歧化酶8份，葡萄糖氧化酶8份，酸性磷酸酶8份。
[0106](2)液體種子擴(kuò)大培養(yǎng)
[0107]①一級(jí)種子培養(yǎng):將步驟(I)活化后的斜面菌種2環(huán)接入500毫升搖瓶中，培養(yǎng)基裝量100毫升，旋轉(zhuǎn)式搖床180轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度33°C，培養(yǎng)時(shí)間12h ；
[0108]②二級(jí)種子培養(yǎng):將一級(jí)種子按照10%的接種量接入500毫升二級(jí)種子搖瓶中，培養(yǎng)條件與一級(jí)種子相同；
[0109]③三級(jí)種子培養(yǎng):將二級(jí)種子以10%接種量接入5000暈升三級(jí)種子搖瓶中，培養(yǎng)基裝量1000毫升，旋轉(zhuǎn)式搖床100轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度33°C，培養(yǎng)時(shí)間12h ；
[0110]④一級(jí)種子罐培養(yǎng):將三級(jí)種子以10%接種量接入總?cè)莘e為150L的一級(jí)種子罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L，培養(yǎng)溫度33 °C，攪拌速度300rpm，通風(fēng)量(V/V) 1: 1.5，罐壓
0.05Mpa,培養(yǎng)時(shí)間15h ；
[0111]所述一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)種子培養(yǎng)基重量組成為:
[0112]酵母粉0.4%，葡萄糖1.2%，蛋白胨0.4%，牛肉膏0.6%，磷酸氫二鉀1.0%，中草藥粉劑1.8%，海藻糖2%，硫酸鈣0.1%,氯化鎂0.2%,檸檬酸鈉0.2%，不足部分純凈水補(bǔ)足，pH值7.2，121°C 滅菌 30min。
[0113]所述一級(jí)種子罐培養(yǎng)基重量組成為:
[0114]麥芽糊精10%，酵母粉0.5%，中草藥粉劑1.8%，海藻糖2%，蛋白胨0.2%，玉米漿
0.3%，磷酸氫二鉀1.0%，硫酸鎂0.08%,檸檬酸鈉0.3%，不足部分純凈水補(bǔ)足，pH值7.2，121°C 滅菌 30min。
[0115]所述種子罐發(fā)酵液菌體濃度為7.5xl08個(gè)/ml ；
[0116](3)發(fā)酵罐發(fā)酵
[0117]將步驟(2)中一級(jí)種子罐發(fā)酵液以6%接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度35°C，攪拌速度400r/m，通風(fēng)量(V/V)l:2，培養(yǎng)時(shí)間12h ;然后以2V /h降溫速率緩慢降溫至12°C，恒溫培養(yǎng)18h ;繼續(xù)以2V /h降溫速率緩慢降溫至4°C，此時(shí)，將步驟(2)中一級(jí)種子罐發(fā)酵液以4%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)25h ;最后以2°C /h升溫速率緩慢升溫至12°C，恒溫培養(yǎng)18h ;繼續(xù)以2°C /h升溫速率緩慢升溫至33 °C，恒溫培養(yǎng)18h ；
[0118]溶解氧控制:通過(guò)調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速及通風(fēng)量，控制溶解氧20% ；
[0119]pH控制:通過(guò)補(bǔ)氨水或稀磷酸，控制發(fā)酵過(guò)程中pH值保持在7.2 ；
[0120]補(bǔ)料控制:添加補(bǔ)料培養(yǎng)基，以維持發(fā)酵液還原糖含量為2_5mg/ml ；
[0121]放罐標(biāo)準(zhǔn):60-80%菌體衰老自溶，酶活力增長(zhǎng)緩慢。
[0122]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麥芽糊精100g，玉米粉55g，豆餅粉20g，中草藥粉劑40g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米漿3g，硫酸銨2g，磷酸氫二鉀2g，磷酸二氫鉀2g，檸檬酸鈉3g，消泡劑 0.5g,純凈水 1000mL, pH 值 7.2，121°C 滅菌 20min ；
[0123]所述補(bǔ)料培養(yǎng)基重量組成為:麥芽糊精25%，玉米粉15%，豆粉20%，中草藥粉劑8%，不足部分純凈水補(bǔ)足，pH值7.2，121°C滅菌30min。
[0124]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的調(diào)配方法為:
[0125]按比例準(zhǔn)確稱(chēng)取原料，將原料中的純凈水、玉米粉、豆餅粉投入配料罐中，調(diào)節(jié)PH值7.2，加入中溫淀粉酶(311/^玉米粉)與高溫淀粉酶(3011/^玉米粉)，同時(shí)邊攪拌邊升溫至70°C保溫20min，然后緩慢升溫至90°C保溫20min進(jìn)行液化，最后加入其它原料，攪拌均勻，調(diào)初始ρΗ7.2，121°C滅菌30min備用。[0126](4)發(fā)酵液經(jīng)孔徑500 μ m過(guò)濾紙板粗濾，然后于15°C循環(huán)超濾濃縮去除水分得固形物含量為30%濃縮液；濃縮液經(jīng)真空冷凍干燥、超微粉碎得枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物。
[0127]所述中草藥提取物的制備方法為:分別將中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3倍重量的水，控制溫度70°C保持2h，然后降溫至45°C，加入混合酶制劑進(jìn)行酶解，用乳酸調(diào)節(jié)pH值為5.5，酶解2h，最后添加混合物料0.5倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至60°C保持3h，過(guò)濾；濾液減壓濃縮至固形物含量為20%以上，然后冷凍干燥獲得中草藥提取物。
[0128]所述中草藥的重量份數(shù)組成為:沙棘20份，決明子20份，枸杞10份，山藥10份，北沙參5份，黃荊子5份，玉竹3份，薏米3份，大麥芽3份，桂花3份，黃芪3份；
[0129]混合酶添加量為混合物料總重量的5% ；
[0130]所述混合酶的重量份數(shù)組成為:內(nèi)葡聚糖酶10份，外β-葡聚糖酶10份，β -葡萄糖苷酶10份，木聚糖酶15份，戊聚糖酶15份，普魯蘭酶20份，β -淀粉酶10份，中性蛋白酶10份,酸性蛋白酶10份,超氧化物歧化酶5份,葡萄糖氧化酶5份,酸性磷酸酶5份；
[0131]所述保護(hù)劑由以下重量份數(shù)的原料組成:海藻糖20份，NaC120份，(NH4) 2S0410份，半胱氨酸10份。
[0132]所述激活劑是由如下質(zhì)量組份的無(wú)機(jī)鹽均勻混合而成:氯化鋅30份，氯化鈣10份，硫酸鈉10份，氯化鎂5份。
[0133]含中性蛋白酶的禽用酶的制備方法如實(shí)施例1。
[0134]實(shí)施例3:
[0135]一種含中性蛋白酶的禽用酶，由以下重量份數(shù)的酶制劑組成:
[0136]枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物40份，酸性木聚糖酶60份，酸性蛋白酶30份，植酸酶30份，β -葡聚糖酶20份，纖維素酶15份，淀粉酶15份，果膠酶10份，中草藥提取物15份，保護(hù)劑15份，激活劑15份。[0137]所述酸性木聚糖酶、酸性蛋白酶、植酸酶、β -葡聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶、果膠酶均為食品級(jí)酶制劑；
[0138]所述枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物的制備方法包括如下步驟:
[0139](I)菌種活化
[0140]將保存完好的枯草芽孢桿菌1398-2-12的斜面菌種接種于斜面培養(yǎng)基，36°C培養(yǎng)36h進(jìn)行菌種活化，如此活化3次；
[0141]所述斜面培養(yǎng)基組成為:牛肉膏10g，氯化鈉12g，蛋白胨20g，葡萄糖5g, (NH)2S045g, K2HP048g, CaCl23g，瓊脂 20g,中草藥粉劑 IOg,蒸餾水 IOOOmL, pH 值 7.2，121°C 滅菌 20min ；
[0142]所述中草藥粉劑的制備方法如下:
[0143]以重量份數(shù)計(jì)，稱(chēng)取黃芪30份；黨參18份；柴胡15份；黃芩15份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加6倍重量的水，控制溫度90°C保持4h，然后降溫至60°C，加入混合物料總重量10%的混合酶制劑進(jìn)行酶解，用乳酸調(diào)節(jié)pH值為6.8，酶解4h，最后添加混合物料3倍重量乙醇和丙醇的混合物，所述乙醇和丙醇的質(zhì)量比例為1:1.5，控制溫度至78°C保持4h，過(guò)濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑。
[0144]所述混合酶的重量份數(shù)組成為:內(nèi)葡聚糖酶20份，外β-葡聚糖酶20份，β -葡萄糖苷酶15份，木聚糖酶20份，戊聚糖酶20份，普魯蘭酶30份，β -淀粉酶15份，中性蛋白酶15份，酸性蛋白酶15份，超氧化物歧化酶10份，葡萄糖氧化酶10份，酸性磷酸酶10份。
[0145](2)液體種子擴(kuò)大培養(yǎng)
[0146]①一級(jí)種子培養(yǎng):將步驟(I)活化后的斜面菌種2環(huán)接入500毫升搖瓶中，培養(yǎng)基裝量100毫升，旋轉(zhuǎn)式搖床180轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度36°C，培養(yǎng)時(shí)間15h ；
[0147]②二級(jí)種子培養(yǎng):將一級(jí)種子按照10%的接種量接入500毫升二級(jí)種子搖瓶中，培養(yǎng)條件與一級(jí)種子相同；
[0148]③三級(jí)種子培養(yǎng):將二級(jí)種子以10%接種量接入5000暈升三級(jí)種子搖瓶中，培養(yǎng)基裝量1000毫升，旋轉(zhuǎn)式搖床100轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度36°C，培養(yǎng)時(shí)間15h ；
[0149]④一級(jí)種子罐培養(yǎng):將三級(jí)種子以10%接種量接入總?cè)莘e為150L的一級(jí)種子罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L，培養(yǎng)溫度36°C，攪拌速度400rpm，通風(fēng)量(V/V) 1:2,罐壓0.05Mpa,培養(yǎng)時(shí)間20h ；
[0150]所述一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)種子培養(yǎng)基重量組成為:
[0151]酵母粉0.5%，葡萄糖1.5%，蛋白胨0.5%，牛肉膏0.8%，磷酸氫二鉀1.5%，中草藥粉劑2%，海藻糖3%，硫酸鈣0.1%,氯化鎂0.2%,檸檬酸鈉0.3%，不足部分純凈水補(bǔ)足，pH值7.2，123°C滅菌 40min。
[0152]所述一級(jí)種子罐培養(yǎng)基重量組成為:
[0153]麥芽糊精15%，酵母0.8%，中草藥粉劑2%，海藻糖3%，蛋白胨0.5%，玉米漿0.5%，磷酸氫二鉀1.5%，硫酸鎂0.1%，檸檬酸鈉0.5%，不足部分純凈水補(bǔ)足，pH值7.2，123°C滅菌40mino
[0154]所述種子罐發(fā)酵液菌體濃度為8.0xlO8個(gè)/ml ；[0155](3)發(fā)酵罐發(fā)酵
[0156]將步驟(2)中一級(jí)種子罐發(fā)酵液以6%接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度36°C，攪拌速度700r/m，通風(fēng)量(V/V)l:3，培養(yǎng)時(shí)間15h ;然后以2V /h降溫速率緩慢降溫至15°C，恒溫培養(yǎng)20h ;繼續(xù)以2V /h降溫速率緩慢降溫至5°C，此時(shí)，將步驟(2)中一級(jí)種子罐發(fā)酵液以4%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)30h ;最后以2°C /h升溫速率緩慢升溫至15°C，恒溫培養(yǎng)20h ;繼續(xù)以2V /h升溫速率緩慢升溫至36°C，恒溫培養(yǎng)20h ；
[0157]溶解氧控制:通過(guò)調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速及通風(fēng)量，控制溶解氧30% ；
[0158]pH控制:通過(guò)補(bǔ)氨水或稀磷酸，控制發(fā)酵過(guò)程中pH值保持在7.2 ；
[0159]補(bǔ)料控制:添加補(bǔ)料培養(yǎng)基，以維持發(fā)酵液還原糖含量為2_5mg/ml ；
[0160]放罐標(biāo)準(zhǔn):60-80%菌體衰老自溶，酶活力增長(zhǎng)緩慢。
[0161 ] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麥芽糊精150g，玉米粉60g，豆餅粉25g，中草藥粉劑50g，海藻糖40g，酵母粉Sg，玉米漿5g，硫酸銨3g，磷酸氫二鉀2g，磷酸二氫鉀2g，檸檬酸鈉5g，消泡劑Ig,純凈水1000mL, pH值7.2，121°C滅菌20min ；
[0162]所述補(bǔ)料培養(yǎng)基重量組成為:麥芽糊精30%，玉米粉20%，豆粉25%，中草藥粉劑10%,不足部分純凈水補(bǔ)足，pH值7.2，123°C滅菌40min。
[0163]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的調(diào)配方法為:
[0164]按比例準(zhǔn)確稱(chēng)取原料，將原料中的純凈水、玉米粉、豆餅粉投入配料罐中，調(diào)節(jié)PH值7.2，加入中溫淀粉酶(311/^ 玉米粉)與高溫淀粉酶(3011/^玉米粉)，同時(shí)邊攪拌邊升溫至70°C保溫30min，然后緩慢升溫至90°C保溫30min進(jìn)行液化，最后加入其它原料，攪拌均勻，調(diào)初始ρΗ7.2，123°C滅菌40min備用。
[0165](4)發(fā)酵液經(jīng)孔徑1000 μ m過(guò)濾紙板粗濾，然后于20°C循環(huán)超濾濃縮去除水分得固形物含量為40%濃縮液；濃縮液經(jīng)真空冷凍干燥、超微粉碎得枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物。
[0166]所述中草藥提取物的制備方法為:分別將中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加6倍重量的水，控制溫度90°C保持4h，然后降溫至60°C，加入混合酶制劑進(jìn)行酶解，用乳酸調(diào)節(jié)pH值為6.8，酶解4h，最后添加混合物料3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至78°C保持4h，過(guò)濾；濾液減壓濃縮至固形物含量為20%以上，然后冷凍干燥獲得中草藥提取物。
[0167]所述中草藥的重量份數(shù)組成為:沙棘30份，決明子30份，枸杞15份，山藥15份，北沙參10份，黃荊子10份，玉竹5份，薏米5份，大麥芽5份，桂花5份，黃芪5份；
[0168]混合酶添加量為混合物料總重量的10%;
[0169]所述混合酶的重量份數(shù)組成為:內(nèi)葡聚糖酶20份，外β-葡聚糖酶20份，β -葡萄糖苷酶15份，木聚糖酶20份，戊聚糖酶20份，普魯蘭酶30份，β -淀粉酶15份，中性蛋白酶15份，酸性蛋白酶15份，超氧化物歧化酶10份，葡萄糖氧化酶10份，酸性磷酸酶10份；
[0170]所述保護(hù)劑由以下重量份數(shù)的原料組成:海藻糖30份，NaC130份，(NH4) 2S0415份，半胱氨酸15份。
[0171]所述激活劑是由如下質(zhì)量組份的無(wú)機(jī)鹽均勻混合而成:氯化鋅40份，氯化鈣20份，硫酸鈉20份，氯化鎂10份。
[0172]含中性蛋白酶的禽用酶的制備方法如實(shí)施例1。[0173]實(shí)施例4本發(fā)明實(shí)施例1禽用酶的使用效果試驗(yàn)
[0174]1.飼料種類(lèi):全價(jià)國(guó)標(biāo)蛋雞料；
[0175]2.禽用酶添加量:每噸飼料添加120g ；
[0176]3.禽用酶試驗(yàn)組設(shè)計(jì):禽用酶重量份數(shù)組成分為試驗(yàn)組、對(duì)照組1、對(duì)照組2 ;其中試驗(yàn)組為本發(fā)明實(shí)施例1制備的禽用酶；對(duì)照組I為試驗(yàn)組組份中除了枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物的其余組份；對(duì)照組2是市售的小麥日糧酶并且其包含的各酶種類(lèi)、酶活力和酶重量份數(shù)與試驗(yàn)組和對(duì)照組I相同；各試驗(yàn)組的具體重量份數(shù)組成如表1
[0177]表1
[0178]
【權(quán)利要求】
1.一種含中性蛋白酶的禽用酶，由以下重量份數(shù)的酶制劑組成:枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物30-40份，酸性木聚糖酶40-60份，酸性蛋白酶20-30份，植酸酶20-30份，β -葡聚糖酶15-20份，纖維素酶10-15份，淀粉酶10-15份，果膠酶5_10份，中草藥提取物10-15份，保護(hù)劑10-15份，激活劑10-15份； 所述枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物的制備方法如下:枯草芽孢桿菌CCTCC NO: M 2013539經(jīng)斜面菌種活化和一、二、三級(jí)種子培養(yǎng)及一級(jí)種子罐培養(yǎng)逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)得到種子液；將液體種子以6%接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度30-36°C，攪拌速度200-700rpm，通風(fēng)量(V/V)l:l-3，培養(yǎng)時(shí)間10_15h ;然后以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至10-15°C，恒溫培養(yǎng)15_20h ;繼續(xù)以1-2°C /h降溫速率緩慢降溫至2-5°C，此時(shí)，將液體種子以4%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)20-30h ;最后以1_2°C /h升溫速率緩慢升溫至10-15°C，恒溫培養(yǎng)15_20h ;繼續(xù)以1-2°C /h升溫速率緩慢升溫至30-36°C，恒溫培養(yǎng)15-20h ;發(fā)酵液經(jīng)孔徑10-1000 μ m過(guò)濾紙板粗濾，然后于10-20°C循環(huán)超濾濃縮去除水分得固形物含量為20-40%濃縮液；濃縮液經(jīng)真空冷凍干燥、超微粉碎得枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物； 所述保護(hù)劑由以下重量份數(shù)的原料組成:海藻糖20-30份，NaC120-30份，(NH4) 2S0410-15 份，半胱氨酸 10-15 份； 所述激活劑是由如下質(zhì)量組份的無(wú)機(jī)鹽均勻混合而成:氯化鋅30-40份，氯化鈣10-20份，硫酸鈉10-20份，氯化鎂5-10份。
2.如權(quán)利要求1所述的一種含中性蛋白酶的禽用酶，其特征在于，制備枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物的斜面培養(yǎng)基組成為:牛肉膏3-10g，氯化鈉5-12g，蛋白胨10-20g，葡萄糖 2-5g, (NH)2S043-5g，K2HP046_8g，CaCl2l_3g，瓊脂 15_20g，中草藥粉劑 5-10g,蒸餾水1000mL, pH 值 7.0-7.2，121°C滅菌 20min。
3.如權(quán)利要求1所述的一種含中性蛋白酶的禽用酶，其特征在于，制備枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物的種子培養(yǎng)基組成為:酵母粉0.3-0.5%，葡萄糖1-1.5%，蛋白胨0.3-0.5%，牛肉膏0.5-0.8%，磷酸氫二鉀0.8-1.5%，中草藥粉劑1.5-2%，海藻糖1-3%,硫酸鈣0.1%,氯化鎂0.2%,檸檬酸鈉0.1-0.3%，不足部分純凈水補(bǔ)足，pH值7.0-7.2，121_123°C滅菌30_40min。
4.如權(quán)利要求1所述的一種含中性蛋白酶的禽用酶，其特征在于，制備枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物的種子罐培養(yǎng)基組成為:麥芽糊精5-15%，酵母粉0.4-0.8%，中草藥粉劑1.5-2%，海藻糖1_3%，蛋白胨0.1-0.5%，玉米漿0.1-0.5%，磷酸氫二鉀0.8-1.5%，硫酸鎂0.05-0.1%，檸檬酸鈉0.1-0.5%，不足部分純凈水補(bǔ)足，pH值7.0-7.2，121_123°C滅菌30_40min。
5.如權(quán)利要求1所述的一種含中性蛋白酶的禽用酶，其特征在于，制備枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物時(shí)種子罐發(fā)酵液菌體濃度為7.0x108-8.0xlO8個(gè)/ml。
6.如權(quán)利要求1所述的一種含中性蛋白酶的禽用酶，其特征在于，制備枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麥芽糊精50-150g，玉米粉50-60g，豆餅粉15-25g，中草藥粉劑30-50g，海藻糖30-40g，酵母粉4-8g，玉米漿l_5g，硫酸銨l_3g，磷酸氫二鉀l_2g，磷酸二氫鉀l_2g，檸檬酸鈉l_5g，消泡劑0.Ι-lg,純凈水lOOOmL，pH值7.0-7.2，121°C滅菌20mino
7.一種含中性蛋白酶的禽用酶的制備方法，其特征在于，將保護(hù)劑、中草藥提取物分別超微粉碎，確保粒度小于其它酶制劑，然后與枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物、酸性木聚糖酶、酸性蛋白酶、植酸酶、β_葡聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶、果膠酶均勻混合，最后加入激活劑，混合均勻后密封包裝即得成品含中性蛋白酶的禽用酶。
8.如權(quán)利要求7所述的一種含中性蛋白酶的禽用酶的制備方法，其特征在于，所述含中性蛋白酶的禽用酶由以下重量份數(shù)的酶制劑組成:枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物30-40份，酸性木聚糖酶40-60份，酸性蛋白酶20-30份，植酸酶20-30份，β -葡聚糖酶15-20份，纖維素酶10-15份，淀粉酶10-15份，果膠酶5-10份，中草藥提取物10-15份，保護(hù)劑10-15份，激活劑10-15份； 所述枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物的制備方法如下:枯草芽孢桿菌1398-2-12經(jīng)斜面菌種活化和一、二、三級(jí)種子培養(yǎng)及一級(jí)種子罐培養(yǎng)逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)得到種子液；將液體種子以6%接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度30-36°C，攪拌速度200-700rpm，通風(fēng)量(V/V) 1:1-3，培養(yǎng)時(shí)間10-15h ;然后以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至10-15°C，恒溫培養(yǎng)15_20h ;繼續(xù)以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至2-5°C，此時(shí)，將液體種子以4%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)20-30h ;最后以1_2°C /h升溫速率緩慢升溫至10-15°C，恒溫培養(yǎng)15_20h ;繼續(xù)以1_2°C /h升溫速率緩慢升溫至30-36°C，恒溫培養(yǎng)15-20h ;發(fā)酵液經(jīng)孔徑10-1000 μ m過(guò)濾紙板粗濾，然后于10-20°C循環(huán)超濾濃縮去除水分得固形物含量為20-40%濃縮液；濃縮液經(jīng)真空冷凍干燥、超微粉碎得枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物； 所述保護(hù)劑由以下重量份數(shù)的原料組成:海藻糖20-30份，NaC120-30份，(NH4) 2S0410-15 份，半胱氨酸 10-15 份； 所述激活劑是由如下質(zhì)量組份的無(wú)機(jī)鹽均勻混合而成:氯化鋅30-40份，氯化鈣10-20份，硫酸鈉10-20份，氯化鎂5-10份。
9.如權(quán)利要求8所述的一種含中性蛋白酶的禽用酶的制備方法，其特征在于，所述中草藥提取物的制備方法為:分別將中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3-6倍重量的水，控制溫度70°C~90°C保持2~4h，然后降溫至45_60°C，加入混合酶制劑進(jìn)行酶解，用乳酸調(diào)節(jié)·PH值為5.5-6.8，酶解2-4h，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至60°C~78°C保持3~4h，過(guò)濾；濾液減壓濃縮至固形物含量為20%以上，然后冷凍干燥獲得中草藥提取物； 所述中草藥的重量份數(shù)組成為:沙棘20-30份，決明子20-30份，枸杞10-15份，山藥10-15份，北沙參5-10份，黃荊子5-10份，玉竹3-5份，薏米3_5份，大麥芽3_5份，桂花3_5份，黃芪3-5份； 所述混合酶添加量為混合物料總重量的5-10% ； 所述混合酶的重量份數(shù)組成為:內(nèi)β -葡聚糖酶10-20份，外β -葡聚糖酶10-20份，β -葡萄糖苷酶10-15份，木聚糖酶15-20份，戊聚糖酶15-20份，普魯蘭酶20-30份，β -淀粉酶10-15份，中性蛋白酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，超氧化物歧化酶5_10份，葡萄糖氧化酶5-10份，酸性磷酸酶5-10份。
10.如權(quán)利要求8所述的一種含中性蛋白酶的禽用酶的制備方法，其特征在于，所述含中性蛋白酶的禽用酶，由以下重量份數(shù)的酶制劑組成:枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物35份，酸性木聚糖酶50份，酸性蛋白酶25份，植酸酶25份，β -葡聚糖酶17份，纖維素酶12份，淀粉酶12份，果膠酶8份，中草藥提取物12份，保護(hù)劑12份，激活劑12份； 所述枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物的制備方法包括如下步驟: (I)將保存完好的枯草芽孢桿菌1398-2-12的斜面菌種接種于斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)24h進(jìn)行菌種活化，如此活化2次； 所述斜面培養(yǎng)基組成為:牛肉膏3g，氯化鈉5g，蛋白胨10g，葡萄糖2g，(NH)2S043g,K2HP046g, CaCl2Ig,瓊脂 15g，中草藥粉劑 5g，蒸餾水 1000mL, pH 值 7.0,121°C滅菌 20min ；所述中草藥粉劑的制備方法如下: 以重量份數(shù)計(jì)，稱(chēng)取黃芪20份；黨參10份；柴胡10份；黃芩10份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3倍重量的水，控制溫度70°C保持2h，然后降溫至45°C，加入混合物料總重量5%的混合酶制劑進(jìn)行酶解，用乳酸調(diào)節(jié)pH值為5.5，酶解2h，最后添加混合物料0.5倍重量乙醇和丙醇的混合物，所述乙醇和丙醇的質(zhì)量比例為1:1，控制溫度至60°C保持3h，過(guò)濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑；所述混合酶的重量份數(shù)組成為:內(nèi)β -葡聚糖酶10份，外β -葡聚糖酶10份，β -葡萄糖苷酶10份，木聚糖酶15份，戊聚糖酶15份，普魯蘭酶20份，β -淀粉酶10份，中性蛋白酶10份，酸性蛋白酶10份，超氧化物歧化酶5份，葡萄糖氧化酶5份，酸性磷酸酶5份； (2)液體種子擴(kuò)大培養(yǎng) ①一級(jí)種子培養(yǎng):將步驟(1)活化后的斜面菌種I環(huán)接入500毫升搖瓶中，培養(yǎng)基裝量100毫升，旋轉(zhuǎn)式搖床180轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)時(shí)間IOh ； ②二級(jí)種子培養(yǎng):將一級(jí)種子按照10%的接種量接入500毫升二級(jí)種子搖瓶中，培養(yǎng)條件與一級(jí)種子相同； ③三級(jí)種子培養(yǎng):將二級(jí)種子以10%接種量接入5000毫升三級(jí)種子搖瓶中，培養(yǎng)基裝量1000毫升，旋轉(zhuǎn)式搖床100轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)時(shí)間IOh ； ④一級(jí)種子罐培養(yǎng):將三級(jí)種子以10%接種量接入總?cè)莘e為150L的一級(jí)種子罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L，培養(yǎng)溫度30°C，攪拌速度200rpm，通風(fēng)量(V/V)l:l，罐壓0.05Mpa，培養(yǎng)時(shí)間IOh ； 所述一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)種子培養(yǎng)基重量組成為: 酵母粉0.3%，葡萄糖1%，蛋白胨0.3%，牛肉膏0.5%，磷酸氫二鉀0.8%，中草藥粉劑.1.5%，海藻糖1%，硫酸鈣0.1%,氯化鎂0.2%,檸檬酸鈉0.1%，不足部分純凈水補(bǔ)足，pH值.7.0,121°C滅菌 30min ； 所述一級(jí)種子罐培養(yǎng)基重量組成為: 麥芽糊精5%，酵母粉0.4%，中草藥粉劑1.5%，海藻糖1%，蛋白胨0.1%，玉米漿0.1%，磷酸氫二鉀0.8%，硫酸鎂0.05%，檸檬酸鈉0.1%，不足部分純凈水補(bǔ)足，pH值7.0,121°C滅菌30min ； 所述種子罐發(fā)酵液菌體濃度為7.0xlO8個(gè)/ml ； (3)發(fā)酵罐發(fā)酵 將步驟(2)中一級(jí)種子罐發(fā)酵液以6%接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度30°C，攪拌速度200r/m，通風(fēng)量(V/V)l:l，培養(yǎng)時(shí)間IOh ;然后以1°C /h降溫速率緩慢降溫至10°C，恒溫培養(yǎng)15h ;繼續(xù)以1°C /h降溫速率緩慢降溫至2°C，此時(shí)，將步驟(2)中一級(jí)種子罐發(fā)酵液以4%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)20h ;最后以1°C /h升溫速率緩慢升溫至10°C，恒溫培養(yǎng)15h ;繼續(xù)以1°C /h升溫速率緩慢升溫至30°C，恒溫培養(yǎng)15h ； 溶解氧控制:通過(guò)調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速及通風(fēng)量，控制溶解氧15% ； pH控制:通過(guò)補(bǔ)氨水或稀磷酸，控制發(fā)酵過(guò)程中pH值保持在7.0 ；補(bǔ)料控制:添加補(bǔ)料培養(yǎng)基，以維持發(fā)酵液還原糖含量為2-5mg/ml ； 放罐標(biāo)準(zhǔn):60-80%菌體衰老自溶，酶活力增長(zhǎng)緩慢； 所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麥芽糊精50g，玉米粉50g，豆餅粉15g，中草藥粉劑30g，海藻糖30g，酵母粉4g，玉米漿lg，硫酸銨lg，磷酸氫二鉀lg，磷酸二氫鉀lg，檸檬酸鈉lg，消泡劑 0.1g,純凈水 1000mL, pH 值 7.0,121°C滅菌 20min ； 所述補(bǔ)料培養(yǎng)基重量組成為:麥芽糊精20%，玉米粉10%，豆粉15%，中草藥粉劑5%，不足部分純凈水補(bǔ)足，pH值7.0，121。。滅菌30min ； 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的調(diào)配方法為: 按比例準(zhǔn)確稱(chēng)取原料，將原料中的純凈水、玉米粉、豆餅粉投入配料罐中，調(diào)節(jié)PH值.7.0，加入中溫淀粉酶(3u/g玉米粉)與高溫淀粉酶(30u/g玉米粉)，同時(shí)邊攪拌邊升溫至.70°C保溫15min，然后緩慢升溫至90°C保溫15min進(jìn)行液化，最后加入其它原料，攪拌均勻，調(diào)初始ρΗ7.0,121°C滅菌30min備用； (4)發(fā)酵液經(jīng)孔徑IOym過(guò)濾紙板粗濾，然后于10°C循環(huán)超濾濃縮去除水分得固形物含量為20%濃縮液；濃縮液經(jīng)真空冷凍干燥、超微粉碎得枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物； 所述中草藥提取物的制備方法為:分別將中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加5倍重量的水，控制溫度80°C保持3h，然后降溫至53°C，加入混合酶制劑進(jìn)行酶解，用乳酸調(diào)節(jié)PH值為6.2，酶解3h，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至69°C保持4h，過(guò)濾；濾液減壓濃縮至固形物含量為20%以上，然后冷凍干燥獲得中草藥提取物； 所述中草藥的重量份數(shù)組成為:沙棘25份，決明子25份，枸杞17份，山藥13份，北沙參8份，黃荊子7份，玉竹4份，薏米4份，大麥芽4份，桂花4份，黃芪4份； 混合酶添加量為混合物料總重量的5-10% ；所述混合酶的重量份數(shù)組成為:內(nèi)葡聚糖酶15份，外β-葡聚糖酶15份，β-葡萄糖苷酶13份，木聚糖酶13份，戊聚糖酶13份，普魯蘭酶25份，β -淀粉酶12份，中性蛋白酶13份，酸性蛋白酶13份，超氧化物歧化酶7份，葡萄糖氧化酶7份，酸性磷酸酶7份；所述保護(hù)劑由以下重量份數(shù)的原料組成:海藻糖25份，NaC125份，(NH4) 2S0413份，半胱氨酸12份； 所述激活劑是由如下質(zhì)量組份的無(wú)機(jī)鹽均勻混合而成:氯化鋅35份，氯化鈣15份，硫酸鈉15份，氯化鎂7份； 含中性蛋白酶的禽用酶的制備方法: 將所述保護(hù)劑、中草藥提取物分別超微粉碎，確保粒度小于其它酶制劑，然后與枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物、酸性木聚糖酶、酸性蛋白酶、植酸酶、葡聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶、果膠酶均勻混合，最后加入激活劑，混合均勻后密封包裝即得成品含中性蛋白酶的禽用酶。
【文檔編號(hào)】A23K1/16GK103704486SQ201310733063
【公開(kāi)日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2013年12月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月27日
【發(fā)明者】李洪兵, 朱永明, 易繼云, 劉波, 樊淳紅 申請(qǐng)人:湖南鴻鷹生物科技有限公司