一種蠟狀芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體公開了一種蠟狀芽孢桿菌。本發(fā)明所述蠟狀芽孢桿菌保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC?No.7979。本發(fā)明所述蠟狀芽孢桿菌可以穩(wěn)定定殖在土壤中，改善土壤微生物環(huán)境，消除連作生物障礙，并對(duì)尖孢鐮刀菌具有明顯抑制作用，而且可促進(jìn)香草蘭的生長(zhǎng)，可應(yīng)用于防治尖孢鐮刀菌和促進(jìn)香草蘭生長(zhǎng)中以及相關(guān)產(chǎn)品的制備中。
【專利說明】一種蠟狀芽孢桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，更具體的說是涉及一種蠟狀芽孢桿菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]香草蘭(Vanilla planifolia Andrews)是蘭科熱帶藤本香料植物,有“天然食品香料之王”的美譽(yù)。其鮮豆莢經(jīng)過生香加工后含有250多種芳香成分，香氣獨(dú)特，被廣泛用于調(diào)制各種高級(jí)香煙、名酒、茶葉，是各類高檔食品和飲料的配香原料，在國(guó)際市場(chǎng)上供不應(yīng)求。
[0003]香草蘭為多年生作物，隨著種植年限的增加，土壤微生物區(qū)系失調(diào)，土傳病原菌根莖腐病致病菌-尖孢鐮刀菌的數(shù)量明顯增加，土壤微生物多樣性趨于簡(jiǎn)單，香草蘭長(zhǎng)勢(shì)弱，出現(xiàn)連作生物障礙問題，嚴(yán)重制約了香草蘭種植業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。為降低病原菌數(shù)量，生產(chǎn)中大量使用農(nóng)藥，導(dǎo)致生產(chǎn)成本增加、農(nóng)民負(fù)擔(dān)加重，豆莢品質(zhì)下降，生態(tài)環(huán)境嚴(yán)重污染。目前，投產(chǎn)期香草蘭種植園土傳致病菌增加，有益細(xì)菌減少，土壤微生物區(qū)系失衡已經(jīng)成為制約香草蘭規(guī)模化種植的主要因素，也是亟待解決的關(guān)鍵問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種蠟狀芽孢桿菌，使得該菌株對(duì)尖孢鐮刀菌具有明顯抑制作用，且能夠在土壤中穩(wěn)定定殖。
[0005]此外，本發(fā)明的另一個(gè)發(fā)明目的是所述蠟狀芽孢桿菌微生物肥料能夠促進(jìn)香草蘭的生長(zhǎng)。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種從20年園齡香草蘭種植園中長(zhǎng)勢(shì)較好的根際土壤中分離得到的菌株，命名為菌株F-6，篩選分離方法如下:
[0007]選擇20年園齡香草蘭種植園中長(zhǎng)勢(shì)較好的根際土壤，樣品帶回實(shí)驗(yàn)室稀釋涂布、培養(yǎng)。挑選在血瓊脂培養(yǎng)基上有明顯溶血圈的菌株(表明其可產(chǎn)生抗真菌脂肽類活性物質(zhì))，再通過平板對(duì)峙試驗(yàn)復(fù)篩出對(duì)香草蘭根莖腐病致病菌-尖孢鐮刀菌有顯著抑制作用的菌株F-6。通過16S rDNA方法(其16S rDNA如SEQ ID NO:1所示)鑒定菌種為蠟狀芽孢桿菌。菌株F-6可產(chǎn)生抗真菌脂肽類物質(zhì)，在以麥芽糖、蛋白胨為唯一碳、氮源的條件下生長(zhǎng)良好。
[0008]本發(fā)明所述蠟狀芽孢桿菌已于2013年8月3日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCC N0.7979。
[0009]本發(fā)明所述蠟狀芽孢桿菌能夠顯著抑制尖孢鐮刀菌，同時(shí)，以107cfu/g數(shù)量施用本發(fā)明所述蠟狀芽孢桿菌4個(gè)月后，其在土壤中的數(shù)量仍保持在105cfu/g以上，充分表明本發(fā)明所述蠟狀芽孢桿菌可以穩(wěn)定定殖在土壤中，改善土壤微生物環(huán)境，消除連作生物障礙。
[0010]因此，本發(fā)明還提供所述蠟狀芽孢桿菌在防治尖孢鐮刀菌中的應(yīng)用以及在制備防治尖孢鐮刀菌的產(chǎn)品中的應(yīng)用，其中，所述產(chǎn)品優(yōu)選為生防制劑或微生物肥料。
[0011]此外，本發(fā)明還提供了一種生防制劑及其制備方法，以及一種微生物肥料及其制備方法。
[0012]當(dāng)本發(fā)明所述蠟狀芽孢桿菌應(yīng)用到生防制劑的制備中時(shí)，所述生防制劑包括保藏編號(hào)為CGMCC N0.7979的蠟狀芽孢桿菌以及生防制劑上可接受的助劑。所述生防制劑上可接受的助劑可以為本領(lǐng)域常用的物質(zhì)，如載體油、增活劑以及紫外保護(hù)劑等。
[0013]所述生防制劑的制備方法為，將保藏編號(hào)為CGMCC N0.7979的蠟狀芽孢桿菌接種于PH值為6-8的NA液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，離心菌體，用無菌水重懸，再離心，用等體積的無菌水懸浮后添加生防制劑可接受的助劑即得。其中，作為優(yōu)選，所述培養(yǎng)條件為28 V _35°C，振蕩速度為160-220轉(zhuǎn)/min，培養(yǎng)時(shí)間為24h_48h，最優(yōu)選為36h。作為優(yōu)選，所述NA液體培養(yǎng)基配方為:牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L，余量為水。所述生防制劑上可接受的助劑可以為本領(lǐng)域常用的物質(zhì)，如載體油、增活劑以及紫外保護(hù)劑等。
[0014]當(dāng)本發(fā)明所述蠟狀芽孢桿菌應(yīng)用到微生物肥料的制備中時(shí)，所述微生物肥料，由保藏編號(hào)為CGMCC N0.7979的蠟狀芽孢桿菌以及牲畜家禽糞便經(jīng)固體發(fā)酵獲得。作為優(yōu)選，所述牲畜家禽糞便為牛糞、豬糞、羊糞、雞糞、鴨糞、鵝糞或它們的任意種混合物，更優(yōu)選的，所述牲畜家禽糞便為腐熟后的牛糞、豬糞、羊糞、雞糞、鴨糞、鵝糞或它們的任意種混合物。最優(yōu)選的，所述腐熟的各牲畜家禽糞便中，有機(jī)質(zhì)質(zhì)量比含量>35%，有機(jī)氮質(zhì)量比含量為
1.0%-2.0%，含水量質(zhì)量比為25%-30%。
[0015]所述微生物肥料制備方法包括以下步驟:
[0016]步驟1、將保藏編號(hào)為CGMCC N0.7979的蠟狀芽孢桿菌接種于pH值為6_8的NA液
體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，離心菌體，用無菌水重懸，再離心，用等體積的無菌水懸浮后獲得菌懸液；
[0017]步驟2、將菌懸液接種到牲畜家禽糞便中進(jìn)行固體發(fā)酵至所述蠟狀芽孢桿菌數(shù)量達(dá)到108cfu/g以上，期間固體發(fā)酵溫度不高于50°C，獲得微生物菌肥。
[0018]其中，作為優(yōu)選，所述培養(yǎng)條件為28°C -35°C，振蕩速度為160-220轉(zhuǎn)/min，培養(yǎng)時(shí)間為24h-48h，最優(yōu)選為36h。作為優(yōu)選，所述NA液體培養(yǎng)基配方為:牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L，余量為水。
[0019]作為優(yōu)選，所述牲畜家禽糞便為牛糞、豬糞、羊糞、雞糞、鴨糞、鵝糞或它們的任意種混合物，更優(yōu)選的，所述牲畜家禽糞便為腐熟后的牛糞、豬糞、羊糞、雞糞、鴨糞、鵝糞或它們的任意種混合物。最優(yōu)選的，所述腐熟的各牲畜家禽糞便中，有機(jī)質(zhì)質(zhì)量比含量>35%，有機(jī)氮質(zhì)量比含量為1.0%-2.0%，含水量質(zhì)量比為25%-30%。
[0020]作為優(yōu)選，所述菌懸液和牲畜家禽糞便的體積質(zhì)量比為lmL-2mL:1Ogo
[0021]作為所述微生物肥料制備的優(yōu)選方案，還包括步驟3:
[0022]將所述微生物菌肥進(jìn)行后熟3-5天，最后在溫度45°C _6(TC將其含水量蒸發(fā)至30%以下。
[0023]本發(fā)明所述微生物肥料除了能夠明顯抑制尖孢鐮刀菌外，還能夠促進(jìn)香草蘭的生長(zhǎng)，如提高香草蘭根系干重、莖干重、葉片干重、根系直徑、根系總體積等。同時(shí)施用含有107cfu/g數(shù)量蠟狀芽孢桿菌的微生物肥料4個(gè)月后，其在土壤中的數(shù)量仍保持在107cfu/g以上，充分表明本發(fā)明所述微生物肥料可以穩(wěn)定定殖在土壤中，改善土壤微生物環(huán)境，消除連作生物障礙。
[0024]由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明所述蠟狀芽孢桿菌可以穩(wěn)定定殖在土壤中，改善土壤微生物環(huán)境，消除連作生物障礙，并對(duì)尖孢鐮刀菌具有明顯抑制作用，而且可促進(jìn)香草蘭的生長(zhǎng)，可應(yīng)用于防治尖孢鐮刀菌以及相關(guān)產(chǎn)品的制備中。
[0025]生物保藏說明
[0026]分類命名:臘狀芽孢桿菌,Bacillus cereus.于2013年8月3日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào) 為CGMCC N0.7979。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1所示為不同處理對(duì)香草蘭植株地上部及根系干重的影響的柱形圖，每個(gè)柱形圖所代表的含義參見圖1圖例，柱形圖上a、b、C、ab、be、Cd字母表示差異顯著程度；
[0028]圖2所示為不同處理對(duì)香草蘭根系直徑和根系總體積的影響的柱形圖，每個(gè)柱形圖所代表的含義參見圖2橫縱坐標(biāo)標(biāo)示，柱形圖上a、b、ab字母表示差異顯著程度；
[0029]圖3所示為不同處理對(duì)香草蘭根際土壤尖孢鐮刀菌數(shù)量的影響的柱形圖，每個(gè)柱形圖所代表的含義參見圖3橫縱坐標(biāo)標(biāo)示，柱形圖上a、b、c字母表示差異顯著程度；
[0030]圖4所示為菌株F-6在香草蘭根際土壤定殖情況的柱形圖，每個(gè)柱形圖所代表的含義參見圖4橫縱坐標(biāo)標(biāo)示，柱形圖上a、b、c字母表示差異顯著程度。
【具體實(shí)施方式】
[0031]本發(fā)明公開了一種蠟狀芽孢桿菌及其應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明所述蠟狀芽孢桿菌及其應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0032]下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0033]實(shí)施例1:本發(fā)明所述蠟狀芽孢桿菌的分離和鑒定
[0034]選擇20年園齡香草蘭種植園中長(zhǎng)勢(shì)較好的根際土壤，樣品帶回實(shí)驗(yàn)室稀釋涂布、培養(yǎng)。挑選在血瓊脂培養(yǎng)基上有明顯溶血圈的菌株(表明其可產(chǎn)生抗真菌脂肽類活性物質(zhì))，再通過平板對(duì)峙試驗(yàn)復(fù)篩出對(duì)香草蘭根莖腐病致病菌-尖孢鐮刀菌有顯著抑制作用的菌株F-6。通過16S rDNA方法鑒定菌種，該菌株F-6屬于蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus),可產(chǎn)生抗真菌脂肽類物質(zhì)，在以麥芽糖、蛋白胨為唯一碳、氮源的條件下生長(zhǎng)良好。菌種于30%甘油中-80°C保存。
[0035]所述蠟狀芽孢桿菌已于2013年8月3日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為 CGMCC N0.7979。
[0036]實(shí)施例2:本發(fā)明所述生防制劑的制備
[0037]將保藏編號(hào)為CGMCC N0.7979的蠟狀芽孢桿菌接種于pH值為6_8的NA液體培養(yǎng)基中，在28°C -35°C、160-220轉(zhuǎn)/min轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)36h，離心菌體，用無菌水重懸，再離心，用等體積的無菌水懸浮后添加載體油、增活劑和紫外保護(hù)劑即得。
[0038]其中，NA液體培養(yǎng)基配方為:牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L，余量為水。
[0039]實(shí)施例3:本發(fā)明所述微生物肥料的制備
[0040]將保藏編號(hào)為CGMCC N0.7979的蠟狀芽孢桿菌接種于pH值為6_8的NA液體培養(yǎng)基中，在28°C -35°C、160-220轉(zhuǎn)/min轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)36h，離心菌體，用無菌水重懸，再離心，用等體積的無菌水懸浮后獲得菌懸液；其中，NA液體培養(yǎng)基配方為:牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L，余量為水。
[0041]將菌懸液接種到腐熟后的牛糞中(菌懸液和腐熟牛糞的體積質(zhì)量比為2mL:1Og)進(jìn)行固體發(fā)酵至所述蠟狀芽孢桿菌數(shù)量達(dá)到108cfu/g以上，期間固體發(fā)酵溫度不高于50°C，每天翻動(dòng)I次，獲得微生物菌肥。其中，腐熟的牛糞中有機(jī)質(zhì)質(zhì)量比含量> 35%，有機(jī)氮質(zhì)量比含量為1.0%-2.0%，含水量質(zhì)量比為25%-30%。
[0042]將所得到的微生物菌肥進(jìn)行后熟4天，最后在溫度45°C -60°C將其含水量蒸發(fā)至30%以下。
[0043]經(jīng)過后熟的微生物肥料含有108cfu/g以上的蠟狀芽孢桿菌，總氮磷鉀養(yǎng)分質(zhì)量比含量為5%-11%，有機(jī)質(zhì)質(zhì)量比含量為30%-40%。
[0044]實(shí)施例4:盆栽試驗(yàn)
[0045]采集20年園齡、有明顯連作生物障礙的香草蘭種植園土壤做為供試土壤，試驗(yàn)盆缽采用周轉(zhuǎn)箱(內(nèi)尺寸600 X 420 X 165_)，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的健康香草蘭做為供試苗。
[0046]將綠色熒光蛋白分子標(biāo)記后的菌株F-6接種至2000ml含0.3mg/ml卡那霉素的NA液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)36h,離心菌體,用無菌水重懸,再離心，用等體積的無菌水懸浮后獲的菌懸液；其中，NA液體培養(yǎng)基配方為:牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L，余量為水。
[0047]將菌懸液接種到腐熟后的牛糞中(菌懸液和腐熟牛糞的體積質(zhì)量比為2mL:1Og)進(jìn)行固體發(fā)酵至所述蠟狀芽孢桿菌數(shù)量達(dá)到108cfu/g，期間固體發(fā)酵溫度不高于50°C，每天翻動(dòng)I次，獲得微生物菌肥。其中，腐熟的牛糞中有機(jī)質(zhì)質(zhì)量比含量> 35%，有機(jī)氮質(zhì)量比含量為1.0%-2.0%，含水量質(zhì)量比為25%-30%。
[0048]試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理:1)對(duì)照(CK，施用等量化肥)；2)施用牛糞堆肥(0M，施肥量3%)；3)施用標(biāo)記菌株F-6菌懸液(F-6，接種濃度為107cfu/g 土);4)施用微生物肥料(B10，施肥量3%，F(xiàn)-6接種濃度為107cfu/g 土)。該盆栽試驗(yàn)每盆栽種I株香草蘭,每處理重復(fù)4次，三次獨(dú)立試驗(yàn)，共48盆。
[0049]測(cè)定指標(biāo):在香草蘭移栽4個(gè)月后毀滅性采樣，采用根系掃描儀測(cè)定根系形態(tài)；植株地上部及根系干重；根際土壤標(biāo)記菌株F-6及尖孢鐮刀菌數(shù)量。結(jié)果分別見圖1-圖4。
[0050]由圖1可知，施用微生物肥料的處理香草蘭根系干重、葉片干重和莖干重除莖干重和施用牛糞堆肥處理不顯著外，其余均顯著高于其他處理。
[0051]由圖2可知，施用微生物肥料的處理根系直徑和根系總體積均高于其他處理，這說明施用微生物肥料可促進(jìn)香草蘭根系生長(zhǎng)。另外，施用牛糞的處理根系直徑和總體積與對(duì)照相比無明顯差異，表明施用牛糞有機(jī)肥對(duì)改善香草蘭根系生長(zhǎng)狀況無顯著效果。
[0052]由圖3可知，施用微生物肥料及菌液F-6的處理香草蘭根際土壤尖孢鐮刀菌數(shù)量顯著低于對(duì)照及施用牛糞的處理，施用微生物肥料的處理尖孢鐮刀菌數(shù)量顯著低于施用F-6的處理，另外，對(duì)照與施用牛糞的處理之間差異不顯著。表明施用微生物肥料或F-6菌液均可顯著抑制香草蘭根際土壤有害真菌尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)，降低其在根際土壤數(shù)量。
[0053]由圖4可知，施用F-6菌液或其微生物肥料4個(gè)月后，F(xiàn)_6在土壤中的濃度分別在105cfu/g及107cfu/g以上，而在對(duì)照及施用牛糞堆肥的處理中并未檢測(cè)到該菌株，這說明F-6可在土壤中穩(wěn)定定殖，利于香草蘭生長(zhǎng)，改善土壤微生物環(huán)境，消除連作生物障礙。并且，施用微生物肥料的處理F-6在根際土壤的數(shù)量顯著高于單獨(dú)施用菌液的處理，這表明微生物有機(jī)肥可為F-6提供豐富的碳、氮源，更利于其在土壤中存活。
[0054] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種蠟狀芽孢桿菌，保藏編號(hào)為CGMCC N0.7979。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述蠟狀芽孢桿菌，其特征在于，16SrDNA如SEQ ID NO:1所示。
3.權(quán)利要求1所述蠟狀芽孢桿菌在防治尖孢鐮刀菌中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述蠟狀芽孢桿菌在制備防治尖孢鐮刀菌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述應(yīng)用，其特征在于，所述產(chǎn)品為生防制劑或微生物肥料。
6.一種生防制劑，其特征在于，包括保藏編號(hào)為CGMCC N0.7979的蠟狀芽孢桿菌以及生防制劑上可接受的助劑。
7.一種生防制劑的制備方法，其特征在于，將保藏編號(hào)為CGMCC N0.7979的蠟狀芽孢桿菌接種于PH值為6-8的NA液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，離心菌體，用無菌水重懸，再離心，用等體積的無菌水懸浮后添加生防制劑可接受的助劑即得。
8.—種微生物肥料，其特征在于，由保藏編號(hào)為CGMCC N0.7979的蠟狀芽孢桿菌以及牲畜家禽糞便經(jīng)固體發(fā)酵獲得。
9.一種微生物肥料的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟1、將保藏編號(hào)為CGMCC N0.7979的蠟狀芽孢桿菌接種于pH值為6_8的NA液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，離心菌體，用無菌水重懸，再離心，用等體積的無菌水懸浮后獲得菌懸液； 步驟2、將菌懸液接種到牲畜家禽糞便中進(jìn)行固體發(fā)酵至所述蠟狀芽孢桿菌數(shù)量達(dá)到108cfu/g以上，期間固體發(fā)酵溫度不高于50°C，獲得微生物菌肥。`
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述制備方法，其特征在于，還包括步驟3: 將所述微生物菌肥進(jìn)行后熟3-5天，最后在溫度45°C -60°C將其含水量蒸發(fā)至30%以下。
【文檔編號(hào)】A01P3/00GK103667158SQ201310737546
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月27日
【發(fā)明者】王輝, 趙青云, 趙秋芳, 王 華, 莊輝發(fā), 宋應(yīng)輝, 朱自慧 申請(qǐng)人:中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所