一種微生物肥料的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種微生物肥料，屬于農(nóng)用肥料【技術領域】，所述微生物肥料，重量份數(shù)組成為：黑曲霉培養(yǎng)物18-26份、解磷巨大芽孢桿菌3-5份、植物乳桿菌劑10-20份，枯草芽孢桿菌菌劑25-36份。本發(fā)明的肥料由復合微生物發(fā)酵而成，能夠改善土壤的微生態(tài)環(huán)境，為農(nóng)作物的生長提供有益條件。解磷巨大芽孢桿菌能分解土壤中的有機磷成為植物可利用的速效磷；本發(fā)明使用的黑曲霉具有產(chǎn)高活力纖維素酶的特性，纖維素酶有利于土壤有機質的分解，腐殖質的形成和碳素營養(yǎng)的釋放。每畝土地使用本發(fā)明的肥料的量為50-100克，是目前國內(nèi)外使用量較少的微生物肥料之一。
【專利說明】一種微生物肥料
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生物肥，屬于農(nóng)用肥料【技術領域】，特別涉及一種微生物肥料。
【背景技術】
[0002]現(xiàn)有的生物肥料大多是單一性的生物肥料。如:固氮菌肥，主要由具有固氮作用的細菌和真菌組成；又如:磷細菌，其功能是分解土壤中的有機磷，使之變?yōu)橐子诒恢参镂盏牧姿?；再?鉀細菌，其功能是分解土壤中的鉀化合物，使之成為能被植物吸收利用的速效鉀。這些肥料在單獨使用時均能發(fā)揮各自作用，部分滿足植物對氮，磷，鉀三要素的需要。它們不會產(chǎn)生長期使用化肥所造成的土壤板結現(xiàn)象。但其不足在于:單獨使用上述三類生物肥料只能解決植物所需營養(yǎng)的一個方面，且成本較高，用量大，同時，將三者配合使用，又因難于做到比例適當而造成施肥量的不足或浪費。長期使用單一的或復合的生物肥料的實踐證明，它們只能替代化肥的30%以下。 [0003]而目前市場上的農(nóng)用微生物菌劑主要為單一的微生物菌種，難以還原微生態(tài)結構，同時普通菌種和農(nóng)作物的協(xié)同作用弱，不利如提高植物抗逆性和根系營養(yǎng)吸收，例如公布號為CN103374528A的專利申請，公開了一種采用黑曲霉制備的能夠高效解磷的微生物菌劑，利用了黑曲霉對難溶性磷酸鹽具有較強的轉化能力，并能將含磷的有機化合物(如植素等)分解成能被植物吸收利用的可溶性磷的特性。又例如公布號為CN102888356A的專利申請，公開了一種利用枯草芽孢桿菌制備微生物肥料的方法及其應用。雖然目前市場上已出現(xiàn)一些復合微生物菌劑，但其或者功能單一，或者其使用方法受到限制，使用后的作物增產(chǎn)效果還不能達到令人滿意，所以目前仍需要開發(fā)適用于多種施用途徑、具有綜合功能和良好增產(chǎn)效果的復合微生物菌劑或肥料。
[0004]由于我國長期在微生物肥料方面研究缺乏投入，使得我國的微生物肥料產(chǎn)業(yè)依然存在整體水平不高、技術創(chuàng)新不足、產(chǎn)品質量與應用效果表現(xiàn)欠穩(wěn)定的問題。在農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展已成為人類共識的今天，這些問題成了微生物肥行業(yè)函待打通的“瓶頸”。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術問題是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種微生物肥料。
[0006]本發(fā)明的技術解決方案是:一種微生物肥料，由黑曲霉培養(yǎng)物、解磷巨大芽抱桿菌、植物乳桿菌劑和枯草芽孢桿菌菌劑組成，微生物肥料的重量份數(shù)組成為:黑曲霉培養(yǎng)物18-26份、解磷巨大芽孢桿菌3-5份、植物乳桿菌劑10-20份，枯草芽孢桿菌菌劑25-36份。
[0007]—種生產(chǎn)微生物肥料的方法，將黑曲霉培養(yǎng)物、解磷巨大芽孢桿菌、植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌按比例混合為微生物肥料。
[0008]枯草芽孢桿菌劑培養(yǎng)制備:從斜面轉接培養(yǎng)枯草芽孢桿菌，逐級擴培后的種子液轉接入發(fā)酵罐中，發(fā)酵完畢發(fā)酵液經(jīng)分離干燥后獲得枯草芽孢桿菌劑。
[0009]植物乳桿菌劑的制備方法:從斜面轉接培養(yǎng)植物乳桿菌，逐級擴培后的種子液轉接入發(fā)酵罐中，發(fā)酵完畢發(fā)酵液經(jīng)低溫負壓真空濃縮到原體積的45%，得到菌濃縮液。添加載體:向濃縮液中添加混合好的載體，混合均勻；濃縮液與載體的重量比為0.5-0.7:1，載體組成為:CaC0320-40份，糊精10-20份。流化床干燥，干燥溫度50°C。
[0010]黑曲霉培養(yǎng)物制備:菌種培養(yǎng)，固體發(fā)酵培養(yǎng):孢子液接種到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)料中，26-35 °C培養(yǎng)至菌絲長滿培養(yǎng)料，低溫流化床干燥，粉碎干燥物。
[0011]本發(fā)明采用的菌種如下:
[0012]枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis subsp) CGMCC7926
[0013]植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum) CGMCC7928
[0014]黑曲霉((Aspergillusniger) ) CGMCCN0.7927
[0015]上述三種菌種的保藏單位是中國普通微生物菌種保藏管理中心。地址:中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號；郵編:100101。
[0016]解磷巨大芽孢桿菌劑由滄州旺發(fā)生物技術研究所提供，地址:中國河北滄州市運河區(qū)解放西路頤和國際商務中心A座1區(qū)807-812。
[0017]有益效果
`[0018]本發(fā)明的肥料由復合微生物發(fā)酵而成，能夠改善土壤的微生態(tài)環(huán)境，為農(nóng)作物的生長提供有益條件。
[0019]解磷巨大芽孢桿菌是芽抱桿菌屬(Baci 1 lus )中的一個種。運動，形成莢膜，好氧。從葡萄糖產(chǎn)酸，也常從阿拉伯糖和甘露醇產(chǎn)酸。水解淀粉，不產(chǎn)生卵磷脂酶，VP陰性。能分解土壤中的有機磷成為植物可利用的速效磷。
[0020]在生物肥料工業(yè)上，黑曲霉具有裂解大分子有機物和難溶無機物，便于作物吸收利用，改善土壤結構，增強土壤肥力，提高作物產(chǎn)量的效果。黑曲霉具有解磷的特性，可以利用固定態(tài)、吸附態(tài)的磷，有效緩解土壤中缺磷的現(xiàn)狀，而且對提高磷肥利用率，減少磷肥的使用所造成的環(huán)境污染。
[0021]本發(fā)明使用的黑曲霉還具有產(chǎn)高活力纖維素酶的特性，纖維素酶有利于土壤有機質的分解，腐殖質的形成和碳素營養(yǎng)的釋放，用在果類作物上，能使果肉細嫩清脆，果汁豐富，口感良好。
[0022]實驗表明，使用本品可提聞糧食廣量8-30%,提聞蔬采廣量10-40%,還可改善蔬菜、糧食的品質和風味。每畝土地使用本發(fā)明的肥料的量為50-100克，是目前國內(nèi)外使用量較少的微生物肥料之一。在本發(fā)明微生物肥料中加入120倍的自來水和6倍的尿素，在22°C以上45°C以下的水溫中活化28小時，然后連同化肥(按照上年使用量的50%)灑入土壤中。最好作基肥，每年使用1-3次。
【具體實施方式】
[0023]除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術手段均為本領域技術人員所公知的方法。另外，實施方案應理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實質和范圍僅由權利要求書所限定。對于本領域技術人員而言，在不背離本發(fā)明實質和范圍的前提下，對這些實施方案中的反應條件、分離提取條件進行的各種改變或改動也屬于本發(fā)明的保護范圍。
`[0024]下面的實施例可以使本專業(yè)技術人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。實施例1
[0025]枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis) L1-2013-02,該菌株已于2013年7月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為:中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號)，保藏號為CGMCCN0.7926。
[0026]所述菌株特性是產(chǎn)耐高溫α -淀粉酶的酶活力高，耐熱、耐酸性強。
[0027]所述菌株制備的耐高溫α -淀粉酶酶活力為30000-35000u/ml ;適用溫度范圍為105-115°C，最適反應溫度110°C，在110°C酶活完全穩(wěn)定；適用反應pH值范圍為3.0-7.0，在pH值為3.0時酶活完全穩(wěn)定，最適反應pH值為4.2。
[0028]所述菌株特點如下:
[0029]所述菌株在固體平板上菌落顏色為乳白色，表面干燥不透明，邊緣整齊，為具有運動性的好氧菌。鏡檢為長桿狀，革蘭氏染色呈陽性。該菌可利用檸檬酸鹽，硝酸還原、ν-P實驗成陽性。
[0030]所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)L1-2013_02由一株產(chǎn)耐高溫α -淀粉酶的枯草芽孢桿菌L1-2013經(jīng)紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復合誘變篩選獲得，具體篩選步驟如下:
[0031](1)菌懸液的制備
[0032]將在平板劃線分離后長出的L1-2013單菌落接入種子培養(yǎng)基中，100r/min，40°C培養(yǎng)12h后，取lmL培養(yǎng)液離心后用生理鹽水洗漆兩次,并重懸與9mL生理鹽水中。
[0033](2)紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復合誘變
[0034]將菌懸液置于無菌平板中，在距離為30cm，功率15w的紫外燈下攪拌照射100s。將經(jīng)過照射的菌液經(jīng)梯度稀釋后涂布于氯化鋰平板，并以未經(jīng)紫外照射的菌液稀釋涂平板做對照。將上述涂布均勻的平板，用黑色的布或報紙包好，置40°C培養(yǎng)48h，在長出菌落的平板上篩選出水解圈與菌落直徑比值最大者挑至斜面保存，純化后配制成菌懸液，經(jīng)梯度稀釋后與硫酸二乙酯原液充分混合，并于40°C震蕩處理40min，將處理過的菌液經(jīng)梯度稀釋后涂布于氯化鋰平板。
[0035](3)高產(chǎn)菌種的初篩
[0036]將上述涂布均勻的平板，置40°C培養(yǎng)48h，在長出菌落的平板上初篩出水解圈與菌落直徑比值較大者挑至斜面保存，純化后獲得三株菌L1-2013-01，L1-2013-02, L1-2013-03。
[0037](4)搖瓶發(fā)酵復篩
[0038]將獲得的三株菌L1-2013-01，L1-2013-02, L1-2013-03在含有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中進行搖瓶發(fā)酵，種子接種量10% (V/V)，40°C、100r/min培養(yǎng)72h，離心取發(fā)酵上清液制得粗酶液。
[0039](5)酶活測定
[0040]酶活單位的定義:lmL粗酶液,于105°C、pH4.2條件下，lmin液化lmg可溶性淀粉，[0041 ] 即為1個酶活力單位，以U/mL表示。
[0042]經(jīng)測定，菌株L1-2013-02，為穩(wěn)定的最高產(chǎn)菌株，且酶活達到30000U/mL。
[0043]所述氯化鋰平板:淀粉1%，蛋白胨 1%，(NH)2S040.4%,K2HP040.8%,CaCl20.2%，氯化鋰0.9%，瓊脂2%。
[0044]所述的種子培養(yǎng)基:酵母粉0.5%，蛋白胨1 %，可溶性淀粉1 %，NaCl 1 %。
[0045]所述的發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米粉5% -15%，豆餅粉4% -10%，(NH)2S040.4 %,Κ2ΗΡ040.8%, CaCl20.2%?
[0046]所述的搖瓶培養(yǎng)條件:該菌在含有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，接種量10%(V/V)，100r/min、40°C 發(fā)酵培養(yǎng) 72h。
[0047]所述耐高溫的α -淀粉酶，其酶學性質如下:
[0048](1)該酶溫度適應范圍較寬，最適作用溫度在100-110°C之間，且在110°C以下保存的，溫度穩(wěn)定性較好，而110°c以上保存長時間溫度穩(wěn)定性較差。
[0049](2)該酶最適反應pH值為4.2。在pH值3.0_7.0之間均有較高酶活力，在pH值為3.0時酶活完全穩(wěn)定。
[0050](3)酶活性:由本發(fā)明所提供的突變株L1-2013-02，制備的耐高溫α -淀粉酶酶活力為 30000-35000U/ml。
[0051]本發(fā)明所提供的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum) L1-2013-01,該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCN0.7928，保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101。保藏日期2013年7月15日。該菌株特點如下:在顯微鏡下觀察，該菌株為短桿狀，革蘭氏染色呈陽性，無邊毛，不產(chǎn)芽孢；在固體培養(yǎng)基上，該菌菌落為白色，表面光滑，致密，形態(tài)為圓形，邊緣較整齊。理化特征為:過氧化氫酶(_)，明膠液化(_)，吲哚實驗( + )，運動性(_)，發(fā)酵產(chǎn)氣(_)，亞硝酸鹽還原(_)，發(fā)酵產(chǎn)氣(_)，產(chǎn)硫化氫氣體(_)，pH4.5MRS培養(yǎng)基中生長(+ )。
[0052]本發(fā)明植物乳桿菌采用下述流程進行選育:
[0053]原始出發(fā)菌種一試管活化一硫酸二乙酯(DES)誘變一平板初篩一亞硝基胍(NTG)誘變一平板初篩一搖瓶復篩一傳代穩(wěn)定性試驗。
[0054]原始出發(fā)菌種為CICC20242，購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。
[0055]本發(fā)明所采用的原始菌株在木聚糖培養(yǎng)基中，乳酸的產(chǎn)量為12.5g/L。為了提高其乳酸產(chǎn)量，依次采用DES和NTG對該菌種進行誘變，誘變采用MRS碳酸鈣平板進行初篩，然后采用500mL搖瓶發(fā)酵，生物傳感器分析儀對高產(chǎn)菌進行復篩，選育優(yōu)良的植物乳桿菌菌株，然后做傳代實驗，評價其遺傳穩(wěn)定性。
[0056]菌株CGMCCN0.7928遺傳穩(wěn)定性結果表明:經(jīng)過連續(xù)傳代十次，各項性能指標都比較穩(wěn)定，遺傳性較好，性狀沒有回復，因此把菌株CGMCCN0.7928作為選育得到的目的菌株。
[0057]將目的菌株CGMCCN0.7928做10L發(fā)酵罐實驗，結果表明:發(fā)酵72h后，以木聚糖為碳源，植物乳桿菌CGMCCN0.7928的乳酸濃度可以達到57g/L，與出發(fā)菌株相比提高了 356%。
[0058]將目的菌株CGMCCN0.7928做10L發(fā)酵罐實驗，結果表明:發(fā)酵72h后，以葡萄糖為碳源，植物乳桿菌CGMCCN0.7928的乳酸濃度可以達到68g/L。
[0059]具體過程如下:
[0060]培養(yǎng)基:
[0061]液體MRS木聚糖培養(yǎng)基(牛肉膏2g、蛋白胨10g、酵母膏5g、木聚糖20g、乙酸鈉5g、檸檬酸銨2g、磷酸氫二鉀2g、七水硫酸鎂0.2g、七水硫酸錳0.05g，逐一溶解后，自來水定容lOOOmL，調(diào)節(jié)pH7.0-7.2) ；MRS木聚糖篩選固體培養(yǎng)基(牛肉膏2g、蛋白胨10g、酵母膏5g、木聚糖90g、乙酸鈉5g、檸檬酸銨2g、磷酸氫二鉀2g、七水硫酸鎂0.2g、七水硫酸錳0.05g,逐一溶解后，自來水定容1000mL，調(diào)節(jié)pH7.0-7.2，加入20g瓊脂)。
[0062]1.硫酸二乙酯(DES)誘變選育[0063]1)在超凈臺上取試管斜面上的植物乳桿菌一環(huán)，接入裝有50mL液體MRS木聚糖培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，200rpm，40°C培養(yǎng)12h左右，使菌體處于對數(shù)生長前期。
[0064]2)取5mL菌液，5000rpm離心lOmin收集菌體，用生理鹽水洗滌2次。
[0065]3)用pH7.0磷酸緩沖液稀釋成107個/mL菌懸液。
[0066]4)取32mLpH7.0的磷酸鉀緩沖液、8mL菌懸液、0.4mLDES在預先放入轉子的150mL三角瓶中充分混合，使DES最終濃度為1% (v/v)0
[0067]5)在30°C搖床中150rpm反應30min，取lmL混合液，加入0.5mL25%Na2S203溶液中止反應。 [0068]6)稀釋涂布于含90g/L木聚糖的MRS木聚糖篩選固體培養(yǎng)基平皿中。在40°C培養(yǎng)2~3天后挑取透明圈/菌落直徑最大的菌株，標號為DES菌。
[0069]2.亞硝基胍誘變
[0070]1)在超凈臺上取試管斜面上的植物乳桿菌DES—環(huán)，接入裝有50mL液體MRS木聚糖培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，200rpm，40°C培養(yǎng)12h左右，使菌體處于對數(shù)生長前期。
[0071]2)取5mL菌液5000rpm離心lOmin收集菌體，用生理鹽水洗滌2次。
[0072]3)用pH6.0磷酸緩沖液稀釋成107個/mL菌懸液。
[0073]4)取10mL菌懸液轉移至lOOmL三角瓶中，加入10mg的NTG，配制成終濃度為10mg/mL的NTG溶液，并加入4-5滴丙酮，以利于NTG溶解。
[0074]5)在30°C下200rpm振蕩反應30min, 5000rpm離心lOmin收集菌體，用無菌生理
鹽水洗滌數(shù)次，中止反應。
[0075]6)適當稀釋，取最后稀釋度的菌液0.2mL,稀釋涂布于含90g/L木聚糖的MRS木聚糖篩選固體培養(yǎng)基平皿中。在40°C培養(yǎng)2~3天后挑取透明圈/菌落直徑較大的菌株150支。
[0076]3.搖瓶復篩
[0077]1)在超凈臺上分別取各試管斜面上的植物乳桿菌一環(huán)，接入裝有50mL液體MRS木聚糖培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，200rpm, 40°C培養(yǎng)3_4天，每天檢測葡萄糖濃度和L-乳酸濃度變化。發(fā)酵結束后，比較150株菌種的木聚糖消耗速率和乳酸產(chǎn)生速率、乳酸的轉化率以及雜酸含量。
[0078]2)選擇木聚糖代謝速率快、乳酸濃度高、轉化率高以及雜酸含量少的菌種為最終菌種，命名為Li菌。
[0079]4.遺傳穩(wěn)定性試驗
[0080]將L1-2013-01菌株在斜面上連續(xù)十次傳代，并用搖瓶復篩的方法檢測每次傳代后的發(fā)酵情況。實驗發(fā)現(xiàn)，在斜面上連續(xù)十次傳代，該菌種性狀沒有明顯變化，各項性能指標都正常，說明該菌種的遺傳穩(wěn)定性較強。
[0081]本發(fā)明提供的黑曲霉((Aspergillus niger))L1-2013-03是由天津工業(yè)大學實驗室保藏的一株產(chǎn)纖維素酶的黑曲霉(Aspergillus niger)L1-2010經(jīng)亞硝基胍多輪誘變篩選，然后對優(yōu)良菌株經(jīng)發(fā)酵性能測試篩選得到產(chǎn)高活力纖維素酶的黑曲霉菌株(Aspergillus niger)L1-2013-03o
[0082]本發(fā)明提供的產(chǎn)高活力纖維素酶的菌株具體為黑曲霉(Aspergillus niger)L1-2013-03。該菌株已于2013年7月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為:中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，郵編100101)，保藏號為 CGMCCN0.7927。
[0083]本發(fā)明黑曲霉菌株(Aspergillusniger) L1-2013-03 (CGMCCN0.7927)具有以下微生物學特征:
[0084]1、形態(tài)學特征:
[0085]黑曲霉菌株CGMCCN0.7927，生物學形態(tài)為包括分生孢子、胞梗、頂囊、產(chǎn)胞結構等幾部分。分生孢子頭球形至輻射形，直徑150-450 μ m，分生孢子梗發(fā)生于基質。胞梗莖1000-3000 (長度)X 12-20 (直徑)μ m，黃色或黃褐色，壁平滑；頂囊球形或近似球形，直徑45-75 μ m,表面全面可育；產(chǎn)胞結構雙層，梗基10-20 (長度)X4.5-7.0 (直徑)μ m,瓶梗6-10 (長度)X 2.5-3.5 (直徑)μ m，分生孢子球形或近球形，直徑3-4.5 μ m,褐色，壁粗糙。
[0086]2、培養(yǎng)學特征:
[0087]菌株在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上生長迅速，28 V 4天孢子可鋪滿斜面；質地絲絨狀或稍帶絮狀；分生孢子結構大量，褐黑色，無滲出液；菌落反面略帶黃色。
[0088]3、生理生化特征: [0089]黑曲霉菌株CGMCCN0.7927可在玉米秸桿、稻草、木屑、馬鈴薯、玉米粉、可溶性淀粉、糖蜜等碳源上生長，最適pH范圍5-6，最適生長溫度范圍28-33°C，最適產(chǎn)酶溫度范圍28-30。。。
[0090]本發(fā)明黑曲霉菌株CGMCCN0.7927的篩選技術路線為:出發(fā)菌株一斜面培養(yǎng)一孢子懸液的制備一誘變處理一平板分離一初篩一復篩一遺傳穩(wěn)定性測定一擴大實驗(發(fā)酵性能測定)。
[0091]按誘變篩選方案，對突變株逐級篩選淘汰，最后對優(yōu)良菌株經(jīng)發(fā)酵性能測試篩選，得到一株高產(chǎn)酶性能菌株黑曲霉菌(Aspergillus niger) L1-2013-03，發(fā)酵96小時后纖維素酶的外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、葡萄糖苷酶和濾紙酶活力分別達到620U/mL、1289U/mL、456U/mL 和 732U/mL。
[0092]28°C發(fā)酵4天直徑75mm，發(fā)酵液纖維素酶的的外切β-葡聚糖酶、內(nèi)切β-葡聚糖酶、β -葡萄糖苷酶和濾紙酶活力分別達到620U/mL、1289U/mL、456U/mL和732U/mL，分別比出發(fā)菌株提高了 9.21倍、7.43倍、8.15倍和10.31倍。
[0093]產(chǎn)高活力纖維素酶菌株的篩選方法，包括以下步驟:
[0094]1)斜面培養(yǎng):將原始黑曲霉菌株(Aspergillus niger)L1-2010劃線接種斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)2~3d，直至菌絲體成熟、產(chǎn)大量黑色孢子。所述斜面培養(yǎng)基組成如下:120Brix 麥芽汁 1000mL, pH 值自然，121°C滅菌 20min ；
[0095]2)孢子懸液制備(以下步驟均在無菌條件下操作):向試管斜面加入15mL無菌水，把孢子刮下，用濾紙過濾，將濾過液倒入已滅菌、并加有5-10粒無菌玻璃珠的150mL三角瓶中，將三角瓶放入搖床振蕩10-15min，使孢子分散。
[0096]3)亞硝基胍(NTG )誘變
[0097]①用無菌水將孢子懸浮液調(diào)節(jié)為稀釋成106-107個/mL。
[0098]②取10mL菌懸液轉移至100mL三角瓶中，加入10mg的NTG,配制成終濃度為10mg/mL的NTG溶液，并加入4-5滴丙酮，以利于NTG溶解。
[0099]③在30°C下200rpm振蕩反應30min, 5000rpm離心lOmin收集菌體,用無菌生理鹽水洗滌數(shù)次，中止反應。
[0100]④適當稀釋將孢子濃度調(diào)節(jié)為103個/mL，取最后稀釋度的菌液0.2mL，稀釋涂布于纖維素-剛果紅平板篩選培養(yǎng)基上。在30°C培養(yǎng)2~3天后挑取透明圈/菌落直徑較大的菌株200支。(所述纖維素-剛果紅平板篩選培養(yǎng)基組成如下:纖維素粉10g、剛果紅
0.2g、硫酸銨5g、硫酸鎂0.25g、磷酸二氫鉀lg、氯化鈉0.lg、明膠2g、瓊脂20g、自來水定容lOOOmL, pH 值 5-6,121°C滅菌 20min)。
[0101]⑤復篩:將獲得的200株菌分別用無菌牙簽接種于斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)至孢子鋪滿斜面。分別將孢子以無菌水洗下接種于裝有50mL復篩培養(yǎng)基的250mL三角瓶中進行發(fā)酵，接種量10%( v/v)，30°C、100r/min培養(yǎng)96h，分別測定各菌株的纖維素酶活性。(所述復篩培養(yǎng)基組成如下:纖維素粉50g、硫酸銨5g、硫酸鎂0.25g、磷酸二氫鉀lg、氯化鈉0.lg、自來水定容1000mL，pH值5-6，121°C滅菌20min)。選取纖維素酶酶活力最高的菌株進行放大實驗。
[0102]4)遺傳穩(wěn)定性試驗
[0103]將L1-2013-03菌株在斜面上連續(xù)十次傳代，并用搖瓶復篩的方法檢測每次傳代后的發(fā)酵情況。實驗發(fā)現(xiàn)，在斜面上連續(xù)十次傳代，該菌種性狀沒有明顯變化，各項性能指標都正常，說明該菌種的遺傳穩(wěn)定性較強。
[0104]5)放大試驗
[0105]①種子培養(yǎng):將纖維素酶酶活力最高的菌株(Aspergillus niger)L1-2013-03接Λ 500mL三角瓶中，種子培養(yǎng)基裝量100毫升，30°C、150rpm搖床培養(yǎng)72_96h。
[0106]②種子罐培養(yǎng):將種子液以10% (v/v)接種量接入裝有7.5L發(fā)酵液的10L發(fā)酵罐中，控制pH值恒定為6.0±0.2，培養(yǎng)溫度30±0.1°C，攪拌速度300rpm，通風量(v/v)1:0.8-1.2，培養(yǎng)時間96h，溶解氧20-30%。所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:纖維素粉100g、硫酸銨5g、硫酸鎂0.25g、磷酸二氫鉀lg、氯化鈉0.lg、自來水定容1000mL，pH值5-6，121°C滅菌20mino
[0107]發(fā)酵結束后，取發(fā)酵上清液(粗酶液)進行酶活力檢測經(jīng)測定，菌株(Aspergillusniger) L1-2013-03的外切β-葡聚糖酶、內(nèi)切β _葡聚糖酶、β _葡萄糖苷酶和濾紙酶活力分別達到 620U/mL、1289U/mL、456U/mL 和 732U/mL,分別比出發(fā)菌株(Aspergillus niger)L1-2010 提高了 9.21 倍、7.43 倍、8.15 倍和 10.31 倍。
[0108]實施例2
[0109]一種微生物肥料，重量份數(shù)組成為:黑曲霉培養(yǎng)物20份、解磷巨大芽孢桿菌4份、植物乳桿菌劑15份，枯草芽孢桿菌菌劑30份。
[0110]枯草芽孢桿菌劑的制備方法:
[0111]發(fā)酵液的獲得:采用斜面菌種逐級擴培獲得枯草芽孢桿菌發(fā)酵液；
[0112](1) 一級種子培養(yǎng):將枯草芽孢桿菌斜面菌種接入500毫升搖瓶中，培養(yǎng)基裝量100毫升，旋轉式搖床180轉/分，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)時間24小時；
[0113](2)二級種子培養(yǎng):將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中，培養(yǎng)條件與一級種子相同；
[0114](3)三級種子培養(yǎng):將二級種子以10%接種量接入5000毫升三級種子搖瓶中，培養(yǎng)基裝量1000毫升，旋轉式搖床100轉/分，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)時間24小時；[0115](4) 一級種子罐培養(yǎng):將三級種子以10%接種量接入總容積為150L的一級種子罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L，培養(yǎng)溫度28°C，攪拌速度100轉/分，通風量(V/V) 1:0.5,罐壓
0.05MPa,培養(yǎng)時間24小時；
[0116](5)發(fā)酵培養(yǎng):將一級種子罐菌種以10%接種量接入總容積為1.5噸二級種子罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量1噸，培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度28°C，攪拌速度100轉/分，通風量(V/V) 1:0.5，罐壓0.05MPa,培養(yǎng)時間24小時。發(fā)酵液采用常規(guī)離心冷凍干燥方法獲得枯草芽孢桿菌劑。
[0117]培養(yǎng)基組成:葡萄糖6%，酵母提取物1%，蛋白胨0.2%，CaC03l%, pH6.8。
[0118]植物乳桿菌劑的制備方法:
[0119](1)一級種子培養(yǎng):將植物乳桿菌菌種接入500毫升搖瓶中，培養(yǎng)基裝量100毫升，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)時間24小時；
[0120](2)二級種子培養(yǎng):將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中，培養(yǎng)條件與一級種子相同；
[0121](3)三級種子培養(yǎng):將二級種子以10%接種量接入5000毫升三級種子搖瓶中，培養(yǎng)基裝量1000毫升，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)時間24小時；
[0122](4)一級種子罐培養(yǎng):將三級種子以5%接種量接入總容積為150L的一級種子罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L，培養(yǎng)溫度30°C，罐壓0.05MPa,培養(yǎng)時間18小時；
[0123](5)發(fā)酵罐培養(yǎng):將一級種子罐菌種以5%接種量接入總容積為3噸二級種子罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量2噸，培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度30°C，罐壓0.05MPa,培養(yǎng)時間22小時。發(fā)酵完畢發(fā)酵液經(jīng)低溫負壓真空濃縮到原體積的45%，得到菌濃縮液。添加載體:向濃縮液中添加混合好的載體，混合均勻；濃縮液`與載體的重量比為0.5:1，載體組成為:CaC0325份，糊精12份，流化床干燥，干燥溫度50°C。
[0124]培養(yǎng)基組成為:酪蛋白胨1%，牛肉提取物1%，酵母提取物0.5%,葡萄糖0.5%,乙酸鈉 0.5%,檸檬酸二胺 0.2%, Tween800.1%, Κ2ΗΡ040.2%, MgS04.7Η200.02%, MnS04.Η200.005%, CaC032%,瓊脂 1.5%, ρΗ6.8。
[0125]黑曲霉培養(yǎng)物的制備方法:
[0126]斜面菌種活化培養(yǎng):將黑曲霉斜面菌種轉接到斜面培養(yǎng)基上，27°C培養(yǎng)3天。
[0127]固體一級種子培養(yǎng):挑取黑曲霉斜面菌種接入裝有100克培養(yǎng)基的500毫升三角瓶中進行種子培養(yǎng)，30°C培養(yǎng)3天即可。
[0128]固體二級種子培養(yǎng):將上述培養(yǎng)好的固體一級種子攪拌為碎塊后加入裝有1000克培養(yǎng)基的5000毫升三角瓶中進行種子培養(yǎng)，培養(yǎng)條件:30°C培養(yǎng)3天即可。
[0129]固體發(fā)酵培養(yǎng):將二級搖瓶種子粉碎，加入裝有滅菌培養(yǎng)基的發(fā)酵池或托盤中混合均勻后培養(yǎng)，曲料培養(yǎng)溫度控制在26-35°C，濕度80-90%，每隔10小時翻料一次，培養(yǎng)時間5-7天；固體曲料的培養(yǎng)采用常用曲料培養(yǎng)技術；待培養(yǎng)料長滿菌絲即可結束培養(yǎng)，培養(yǎng)基預先經(jīng)高溫蒸煮滅菌處理，滅菌條件控制溫度121°C，時間1小時。
[0130]干燥粉碎:發(fā)酵結束培養(yǎng)料在流化床或其他干燥設備上進行干燥，干燥溫度控制在60°C，干燥到水分含量在10%以下，然后將固體培養(yǎng)料進行粉碎，物料粉碎孔徑在60目以上。
[0131]培養(yǎng)基組成:固體原料:麩皮70%，粉碎的作物秸桿15%，豆餅粉5%，玉米淀粉10%，添加等量自來水；初始pH自然。[0132]實施例3
[0133]一種微生物肥料，重量份數(shù)組成為:黑曲霉培養(yǎng)物22份、解磷巨大芽孢桿菌3份、植物乳桿菌劑18份，枯草芽孢桿菌菌劑32份。
[0134]一種生產(chǎn)微生物肥料的方法，將黑曲霉培養(yǎng)物、解磷巨大芽抱桿菌、植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌按比例組合為微生物肥料。
[0135]枯草芽孢桿菌劑培養(yǎng)制備:從斜面轉接培養(yǎng)枯草芽孢桿菌，逐級擴培后的種子液轉接入發(fā)酵罐中，發(fā)酵完畢發(fā)酵液經(jīng)過板框過濾、干燥后獲得枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物。
[0136]植物乳桿菌劑的制備:從斜面轉接培養(yǎng)植物乳桿菌，逐級擴培后的種子液轉接入發(fā)酵罐中，發(fā)酵完畢發(fā)酵液經(jīng)低溫負壓真空濃縮到原體積的45%，得到菌濃縮液。添加載體:向濃縮液中添加混合好的載體，混合均勻；濃縮液與載體的重量比為0.6:1，載體組成為:CaC0330份，糊精16份。流化床干燥，干燥溫度50°C。
[0137]黑曲霉培養(yǎng)物制備:菌種培養(yǎng)，固體發(fā)酵培養(yǎng):孢子液接種到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)料中，30°C培養(yǎng)至菌絲長滿培養(yǎng)料，低溫流化床35°C干燥，粉碎干燥物。
[0138]實施例4
[0139]產(chǎn)品效果實驗
[0140]試驗地的選擇與 試驗設計:試驗于2012年3月27日一 10月30日在寧夏鹽池縣花馬池鎮(zhèn)八堡村進行。
[0141]試驗田達到田種植玉米10畝,分別在種植時使用本發(fā)明產(chǎn)品每畝0.1公斤，出苗1個月左右通過鋤地松土方式使用發(fā)明產(chǎn)品0.6公斤，對照組使用常規(guī)肥料。
[0142]發(fā)明產(chǎn)品使用玉米地玉米產(chǎn)量達到680公斤，對照組達到490公斤；該地塊在第2年種植春小麥，春小麥產(chǎn)量達到了 410公斤，比對照組單產(chǎn)提高了 21%。且試驗田土壤結構良好，無大塊和板結。
【權利要求】
1.一種微生物肥料，其特征在于，重量份數(shù)組成為:黑曲霉培養(yǎng)物18-26份、解磷巨大芽孢桿菌3-5份、植物乳桿菌劑10-20份，枯草芽孢桿菌菌劑25-36份；所述枯草芽孢桿菌保藏號為CGMCCN0.7926，所述黑曲霉保藏編號為CGMCCN0.7927，所述植物乳桿菌保藏編號為 CGMCCN0.7928。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種微生物肥料，其特征在于，所述枯草芽孢桿菌劑的制備方法如下:采用斜面菌種逐級擴培獲得枯草芽孢桿菌發(fā)酵液，發(fā)酵液分離干燥獲得。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種微生物肥料，其特征在于，所述植物乳桿菌劑的制備方法如下:植物乳桿菌發(fā)酵液經(jīng)低溫負壓真空濃縮到原體積的45%，得到菌濃縮液；添加載體:向濃縮液中添加混合好的載體，混合均勻；濃縮液與載體的重量比為0.5:1，載體組成為:CaC0325份，糊精12份，流化床干燥，干燥溫度50°C。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種微生物肥料，其特征在于，所述黑曲霉培養(yǎng)物的制備方法如下:固體發(fā)酵培養(yǎng)結束培養(yǎng)料在流化床或其他干燥設備上進行干燥，干燥溫度控制在60°C，干燥到水分含量在10%以下，然后將固體培養(yǎng)料進行粉碎，物料粉碎孔徑在60目以上。
5.根據(jù)權利要求1所述的一種微生物肥料，其特征在于，重量份數(shù)組成為:黑曲霉培養(yǎng)物20份、解磷巨大芽孢桿菌4份、植物乳桿菌劑15份，枯草芽孢桿菌菌劑30份。
6.根據(jù)權利要求1所述的一種微生物肥料，其特征在于，重量份數(shù)組成為:黑曲霉培養(yǎng)物22份、解磷巨大芽孢桿菌3份、植物乳桿菌劑18份，枯草芽孢桿菌菌劑32份。
【文檔編號】C05F11/08GK103739319SQ201310743500
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月30日 優(yōu)先權日:2013年12月30日
【發(fā)明者】邵素英, 孔日祥 申請人:邵素英