產(chǎn)生纖維素酶的新真菌株以及用其進(jìn)行糖化的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及新真菌株黃傘(Pholiota adiposa)SKU714；用于從所述真菌株生產(chǎn)纖維素酶的方法；以及使用所產(chǎn)生的纖維素酶用于糖化纖維素的方法。由本發(fā)明的真菌株產(chǎn)生的纖維素酶顯示出比現(xiàn)有的糖化酶更好的糖化產(chǎn)量，因此所述纖維素酶可用在各種應(yīng)用中，包括生物能源生產(chǎn)、紡織工業(yè)、造紙工業(yè)、洗滌劑工業(yè)、動(dòng)物飼料工業(yè)和食品工業(yè)。KCCM11187P2011.04.20
【專(zhuān)利說(shuō)明】產(chǎn)生纖維素酶的新真菌株以及用其進(jìn)行糖化的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及新菌株黃傘（Pholiota adiposa)SKU714,用于從所述菌株產(chǎn)生纖維素 酶的方法，以及使用所產(chǎn)生的纖維素酶用于糖化纖維素的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 纖維素是地球上最豐富的有機(jī)物質(zhì)。它是可再生資源，因而無(wú)需擔(dān)心像石油或煤 一樣枯竭。然而，纖維素多數(shù)作為農(nóng)林廢棄物被丟棄，這被視為是環(huán)境污染的主要原因。每 年在世界范圍內(nèi)產(chǎn)生超過(guò)三十億噸的農(nóng)林廢棄物，僅在亞洲就產(chǎn)生多于8億噸。
[0003] 因?yàn)檗r(nóng)林廢棄物主要由纖維素和半纖維素組成，如果它們可以通過(guò)糖化被轉(zhuǎn)化為 包括葡萄糖在內(nèi)的單糖，這可能對(duì)于解決食品、燃料和環(huán)境問(wèn)題有極大的幫助。
[0004] 作為從農(nóng)林廢棄物中回收單糖的普通方法，已知加入硫酸并在高溫高壓下進(jìn)行糖 化的方法。然而，這種方法的問(wèn)題在于：必須使用能夠耐受強(qiáng)酸和高壓的昂貴的設(shè)備；因?yàn)?產(chǎn)生各種副產(chǎn)品而難以分離和回收單糖；因需要處理副產(chǎn)品而生產(chǎn)成本高以及相關(guān)的過(guò)程 是環(huán)境不友好的。因?yàn)槠胀ㄌ腔椒ū幌拗朴糜谏虡I(yè)應(yīng)用，所以已經(jīng)在可以取代普通糖化 方法的更加環(huán)境友好的纖維素糖化方法上進(jìn)行了研究。在這方面，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出各種糖化酶 并將其商業(yè)化用于各種工業(yè)領(lǐng)域。此外，正在積極研究其應(yīng)用。作為糖化酶，纖維素酶廣泛 用于紡織、造紙、洗滌劑和飼料工業(yè)。另外，其用于低熱量食品的生產(chǎn)、食品廢物的發(fā)酵等。
[0005] 植物的細(xì)胞壁是由諸如纖維素（不溶性β -1，4-葡聚糖纖維）、半纖維素（非纖維 素基的多糖）和木質(zhì)素（復(fù)合多酚多糖）的聚合物所組成。在這些成分中，纖維素以最高 量存在，其次是半纖維素和木聚糖作為主要組份。兩種成分占總的植物生物量的50%以上。 纖維素是由β_1，4鍵連接的葡萄糖單元的均聚物。為將其分解為單糖，三種類(lèi)型的酶是必 要的，即內(nèi)切β -1，4-葡聚糖酶（內(nèi)切β -1，4-) [EC 3. 2. 1. 4]、外切β -1，4-葡聚糖酶[EC 3. 2. 1. 91]和β -葡糖苷酶。內(nèi)切葡聚糖酶隨機(jī)地從內(nèi)側(cè)切割β -1，4葡萄糖鍵，以及外切 葡聚糖酶在非還原端進(jìn)行切割將葡聚糖分解成二糖纖維二糖。纖維二糖最終通過(guò)β-葡糖 苷酶分解為葡萄糖。
[0006] 纖維素酶大多數(shù)使用霉菌（真菌）生產(chǎn)。具體地，使用曲霉屬（Aspergillus)和木 霉屬（1'1'；[0110(161'1]^)進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)纖維素酶。雖然里氏木霉211-〇2(1'1'；[0110(161'1]^代6861 ATCC 56764)已作為代表性的產(chǎn)生纖維素酶的菌株被深入地研究，其酶濃度和活性都不足 以充分滿(mǎn)足工業(yè)需求。例如，雖然從生物質(zhì)來(lái)生產(chǎn)乙醇的過(guò)程在資源的回收利用、生產(chǎn)燃料 的環(huán)境友好等方面具有許多優(yōu)勢(shì)，從木質(zhì)纖維素物質(zhì)生產(chǎn)乙醇與汽油生產(chǎn)相比更加昂貴。 在乙醇生產(chǎn)過(guò)程中,產(chǎn)生糖化酶的成本占了總生產(chǎn)成本的大約60 %。
[0007] 因此，對(duì)纖維素的有效糖化過(guò)程存在強(qiáng)烈的需求，特別是對(duì)使用新菌株的環(huán)境友 好的纖維素糖化過(guò)程。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 技術(shù)問(wèn)題
[0009] 為解決上述現(xiàn)有技術(shù)的問(wèn)題進(jìn)行本發(fā)明。
[0010] 本發(fā)明針對(duì)提供顯示高活性的產(chǎn)生纖維素酶的新菌株。
[0011] 本發(fā)明還針對(duì)提供使用所述菌株來(lái)產(chǎn)生纖維素酶的方法。
[0012] 本發(fā)明還針對(duì)提供使用所述纖維素酶用于糖化纖維素的方法。
[0013] 技術(shù)方案
[0014] 在一方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生纖維素酶的黃傘SKU714(登記號(hào)KCCM 11187P)菌株。
[0015] 另一方面，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生纖維素酶的方法，包括培養(yǎng)黃傘SKU714(登記號(hào) KCCM 11187P)。
[0016] 在根據(jù)本發(fā)明的用于產(chǎn)生纖維素酶的方法中，可使用含有玉米漿粉（5?10g/L)、 酵母提取物（1?5g/L)、磷酸二氫鉀（3?7g/L)、磷酸氫鉀（3?7g/L)、七水硫酸酶（1? 5g/L)、鹽酸硫胺素（0· 01?0· 03g/L)和碳源（10?30g/L)的pH 4. 5?5. 5的介質(zhì)來(lái)進(jìn) 行培養(yǎng)。
[0017] 在根據(jù)本發(fā)明的用于產(chǎn)生纖維素酶的方法中，碳源可選自纖維素、纖維二糖、稻草 和微晶纖維素。
[0018] 在根據(jù)本發(fā)明的用于產(chǎn)生纖維素酶的方法中，可在100_200rpm的攪拌速率、 0. 8?1. 2vvm的通氣速率和25至30°C的培養(yǎng)溫度的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
[0019] 在另一方面，本發(fā)明提供使用由黃傘SKU714菌株產(chǎn)生的纖維素酶來(lái)糖化纖維素 的方法。
[0020] 在根據(jù)本發(fā)明的用于糖化纖維素的方法中，可在5?25wt %的基質(zhì)濃度、1? 45FPU/g基質(zhì)的纖維素酶濃度、pH 4?7和50?80°C的溫度的條件下進(jìn)行糖化。
[0021] 在根據(jù)本發(fā)明的用于糖化纖維素的方法中，白楊、稻草或其混合物可用作纖維素 源或基質(zhì)。
[0022] 有益效果
[0023] 根據(jù)本發(fā)明的新菌株黃傘SKU714,其從傘菌中分離出，產(chǎn)生高活性的纖維素酶。
[0024] 因?yàn)橛筛鶕?jù)本發(fā)明的新菌株所產(chǎn)生的纖維素酶顯示出比現(xiàn)有的糖化酶更好的糖 化產(chǎn)量，其可用在各種應(yīng)用中，包括生物能源生產(chǎn)、紡織工業(yè)、造紙工業(yè)、洗滌劑工業(yè)、飼料 工業(yè)、食品工業(yè)、低熱量食品的生產(chǎn)、食品廢物的發(fā)酵等。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1顯示對(duì)本發(fā)明菌株的ITS-5. 8S rDNA序列和類(lèi)似物種之間的遺傳關(guān)系進(jìn)行分 析的結(jié)果。
[0026] 圖2a顯示隨著培養(yǎng)時(shí)間推移，通過(guò)每單位酶量的黃傘SKU714菌株分解濾紙來(lái)測(cè) 量β -葡糖苷酶活性（-·-)、纖維二糖水解酶活性（-〇-)、內(nèi)切葡聚糖酶活性（_▲ _) 和葡萄糖產(chǎn)量（-△_)的結(jié)果。
[0027] 圖2b顯示隨著培養(yǎng)時(shí)間推移，測(cè)量黃傘SKU714菌株的木聚糖酶活性（-·-)、漆 酶活性（-〇_)、甘露聚糖酶活性（-▲_)和木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活性（-△_)的結(jié)果。
[0028] 圖3a顯示黃傘SKU714菌株產(chǎn)生的β -葡糖苷酶的活性依賴(lài)于pH。
[0029] 圖3b顯示由黃傘SKU714菌株產(chǎn)生的β -葡糖苷酶的活性依賴(lài)于溫度。

【具體實(shí)施方式】
[0030] 本發(fā)明通過(guò)實(shí)施例得以更詳細(xì)地描述。然而，本發(fā)明的范圍不為實(shí)施例限制。
[0031] 實(shí)施例1 :篩選產(chǎn)生纖維素酶的菌株
[0032] 為篩選產(chǎn)生纖維素酶的菌株，將10 μ L的傘菌培養(yǎng)物懸浮在10mL的生理鹽水中。 將10μ L的所得懸浮物（lX104cfu ml/1)平鋪在含2%的羧甲基纖維素的馬鈴薯葡萄糖瓊 月旨，并在27°C孵育3天。在固體瓊脂培養(yǎng)基上形成菌落后，使用0. 1 %的剛果紅將平皿染色， 然后用1M氯化鈉進(jìn)行脫色。然后，通過(guò)選擇具有由水解纖維素而在菌落周?chē)a(chǎn)生暈圈的菌 落來(lái)篩選生產(chǎn)纖維素酶的傘菌菌株。
[0033] 通過(guò)這種方法來(lái)篩選初步菌株（S1-S6)。使用現(xiàn)有的生產(chǎn)菌株里氏木霉ZU-02作 為對(duì)照（C)，在含有羧甲基纖維素的固體瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行測(cè)試之后，從篩選出菌株中選擇 出顯示最好纖維素降解能力的S4菌株。
[0034] 實(shí)施例2 :鑒定菌株
[0035] 為鑒定在實(shí)施例1中篩選出的S4菌株，由韓國(guó)微生物培養(yǎng)中心對(duì)ITS-5. 8S rDNA 序列進(jìn)行分析。S4菌株的ITS-5. 8S rDNA序列命名為SEQ ID NO :1。
[0036] 作為分析S4菌株的ITS-5. 8S rDNA序列與類(lèi)似物種之間遺傳關(guān)系的結(jié)果，所述S4 菌株鑒定為黃傘（圖1)。
[0037] 所述S4菌株命名為"黃傘SKU714(Pholiota adiposa SKU714) "并在布達(dá)佩斯條 約下于2011年4月20日以登記號(hào)KCCM 11187P保藏在韓國(guó)微生物培養(yǎng)中心。
[0038] 實(shí)施例3 :介質(zhì)的最優(yōu)化以生產(chǎn)纖維素酶
[0039] (1)纖維素酶的活性依賴(lài)于碳源
[0040] 在7-L發(fā)酵罐中測(cè)試黃傘SKU714菌株產(chǎn)生纖維素酶的活性依賴(lài)于碳源。纖維素、 葡萄糖、乳糖、麥芽糖、纖維二糖、羧甲基纖維素、蔗糖、木聚糖、稻桿和微晶纖維素用作碳 源。
[0041] 將黃傘SKU714菌株接種在含有50mL全培養(yǎng)介質(zhì)（馬鈴薯淀粉4g/L、右旋糖20g/ L)的50mL燒瓶中后，將菌株在搖床中以150rpm在25°C培養(yǎng)5天。將50mL培養(yǎng)物接種在 含有生長(zhǎng)介質(zhì)（玉米漿粉為8g/L、酵母提取物2g/L、磷酸二氫鉀5g/L、磷酸氫鉀5g/L、七水 硫酸鎂3g/L、鹽酸硫胺素0. 02g/L和碳源為20g/L、pH5)的50ml的燒瓶中，在150rpm、25°C 和pH5中培養(yǎng)7天。
[0042] 對(duì)每種碳源測(cè)量黃傘SKU714菌株的β -葡糖苷酶活性和葡萄糖生產(chǎn)的結(jié)果示于 表1中。
[0043] 表 1
[0044]

【權(quán)利要求】
1. 一種產(chǎn)生纖維素酶的黃傘（Pholiota adiposa)SKU714,其以登記號(hào)KCCM 11187P保 藏。
2. -種用于產(chǎn)生纖維素酶的方法，其包括通過(guò)培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃傘 (Pholiota adiposa) SKU714 來(lái)產(chǎn)生纖維素酶。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于產(chǎn)生纖維素酶的方法，其中在含有玉米漿粉（5?10g/ L)、酵母提取物（1?5g/L)、磷酸二氫鉀（3?7g/L)、磷酸氫鉀（3?7g/L)、七水硫酸鎂 (1?5g/L)、鹽酸硫胺素（0· 01?0· 03g/L)和碳源（10?30g/L)的pH 4. 5?5. 5的介質(zhì) 中進(jìn)行培養(yǎng)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于產(chǎn)生纖維素酶的方法，其中碳源選自纖維素、纖維二糖、 稻草和微晶纖維素。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的用于產(chǎn)生纖維素酶的方法，其中在100至200rpm的攪拌 速率、0. 8?1. 2vvm的通氣速率和25?30°C的培養(yǎng)溫度的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
6. -種用于糖化纖維素的方法，其包括使用通過(guò)培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃傘 (Pholiota adiposa) SKU714所產(chǎn)生的纖維素酶來(lái)糖化纖維素基質(zhì)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于糖化纖維素的方法，其中纖維素基質(zhì)是白楊、稻草或其 混合物。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于糖化纖維素的方法，其中在5?25wt %的基質(zhì)濃度、1? 45 FPU/g基質(zhì)的纖維素酶濃度、pH 4?7和50?80°C的溫度的條件下進(jìn)行糖化。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK104254243SQ201380021450
【公開(kāi)日】2014年12月31日 申請(qǐng)日期:2013年2月21日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月24日
【發(fā)明者】李正杰, 金泰壽, S·S·賈格塔普, 車(chē)玟鎬, 李鐘寅, 盧恒德 申請(qǐng)人:Sk化學(xué)株式會(huì)社