一種誘導(dǎo)水稻防衛(wèi)反應(yīng)的蛋白、其編碼基因、制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明提供一種能夠誘導(dǎo)水稻防衛(wèi)反應(yīng)的植物免疫活性物質(zhì)的編碼基因，所述編碼基因具有如SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提供一種用于誘導(dǎo)水稻防衛(wèi)反應(yīng)的蛋白，所述蛋白具有如SEQ?ID?NO.7所示的氨基酸序列。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)SEQ?ID?NO.1基因序列表達(dá)產(chǎn)生的蛋白能夠明顯引起水稻免疫反應(yīng)，是一種新型的水稻免疫活性物質(zhì)，其在水稻病害防治上將會(huì)有巨大的應(yīng)用潛力，進(jìn)而產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
【專利說明】一種誘導(dǎo)水稻防衛(wèi)反應(yīng)的蛋白、其編碼基因、制備方法和用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種能夠誘導(dǎo)水稻防衛(wèi)反應(yīng)的蛋白及其編碼基因。具體而言，本發(fā)明涉及細(xì)菌源免疫活性物質(zhì)，其能夠引起水稻免疫反應(yīng)。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻是我國主要糧食作物之一，種植面積約占全國耕地面積的1/4，年產(chǎn)量將近占全國糧食總產(chǎn)的1/2。水稻病害的危害一直嚴(yán)重影響水稻的生產(chǎn)，如不進(jìn)行有效地防治，年均損失產(chǎn)量300億公斤，即使在現(xiàn)行防治條件下，年均損失可能達(dá)200億公斤。因此，研究和防治水稻病害具有十分重要的意義。
[0003]水稻病害的種類很多，全世界有近百種，其中白葉枯病發(fā)生面積大、流行性強(qiáng)、危害嚴(yán)重，是水稻上的“三大重要病害”之一。因?yàn)榘兹~枯發(fā)病后病灶位于水稻維管束中，所以白葉枯的防治還是比較困難。近期的研究結(jié)果表明，在水稻中轉(zhuǎn)化微生物源基因后，該轉(zhuǎn)基因水稻植株能夠表現(xiàn)出對相關(guān)病害的抗性，證明了水稻能夠在外來抗原性物質(zhì)激發(fā)下產(chǎn)生相關(guān)抗病性。
[0004]隨著近年農(nóng)業(yè)高附加值的生產(chǎn)需求以及市場對有機(jī)食品的旺盛需求,市場亟需能夠有效防止農(nóng)作物病害又無農(nóng)藥殘留的農(nóng)防產(chǎn)品。因此開發(fā)具有免疫活性的生物活性蛋白，對于保障糧食生產(chǎn)以及改善民生質(zhì)量是一種無可取代的方式。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]因此，本發(fā)明的目的是提供一種能夠誘導(dǎo)水稻防衛(wèi)反應(yīng)的細(xì)菌源免疫活性物質(zhì)的基因及其蛋白。
[0006]用于實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下:
[0007]—方面，本發(fā)明提供了一種植物免疫活性物質(zhì)的編碼基因，所述編碼基因具有如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列?；蛘?所述編碼基因具有如SEQID N0.2所示的核苷酸序列。
[0008]優(yōu)選地，所述編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所示。
[0009]本發(fā)明提供的上述編碼基因可以來源于燕麥?zhǔn)人峋鶤cidovorax avenae (已于2013年12月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所)，菌種保藏號CGMCCN0.8661;進(jìn)一步鑒定為燕麥?zhǔn)人峋?Acidovorax avenae subsp.Avenae (Aaa))的基因組DNA，是本發(fā)明提供的新型水稻免疫活性物質(zhì)的基因。特別地，本文將核苷酸序列如SEQIDN0.1的編碼基因命名為“fliC”。
[0010]另一方面，本發(fā)明提供了一種用于誘導(dǎo)水稻防衛(wèi)反應(yīng)的蛋白，所述蛋白具有如SEQID N0.7所示的氨基酸序列； [0011]優(yōu)選地，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.7所示。[0012]本發(fā)明提供的上述蛋白可以由具有如SEQ ID N0.1所示核苷酸序列的編碼基因編碼得到。根據(jù)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】，氨基酸序列如SEQ ID顯.7所示的蛋白具有511^的分子量，本文將其命名為蛋白“FliC”。
[0013]又一方面，本發(fā)明提供上述蛋白的制備方法，所述制備方法包括以下步驟:
[0014](I)獲取其編碼基因；
[0015](2)使用步驟(1)得到的編碼基因構(gòu)建蛋白表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌；
[0016](3)誘導(dǎo)步驟(2)得到的經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌表達(dá)所述蛋白。
[0017]優(yōu)選地,所述步驟(1)包括:
[0018]以燕麥?zhǔn)人峋鶤cidovorax avenae (CGMCC N0.8661)的基因組DNA為模板,米用PCR方法擴(kuò)增所述蛋白的編碼基因。
[0019]其中，可以以上游引物SEQ ID N0.5、下游引物SEQ ID N0.6直接從燕麥?zhǔn)人峋鶤cidovorax avenae CGMCC N0.8661的基因組DNA擴(kuò)增得到如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，其為蛋白FliC的編碼基因。
[0020]或者，根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，可以以上游引物SEQ ID N0.3、下游引物SEQID N0.4從燕麥?zhǔn)人峋鶤cidovorax avenae CGMCC N0.8661 (Aaa)的基因組DNA擴(kuò)增得到如SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列，其包含SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。將這一核苷酸序列與載體PMD-18T構(gòu)建重組質(zhì)粒作為模板，再以上游引物SEQ ID N0.5、下游引物SEQID N0.6擴(kuò)增該重組質(zhì)粒，得到如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
[0021]再或者，可以以上游引物SEQ ID N0.3、下游引物SEQ ID N0.4從燕麥?zhǔn)人峋鶤cidovorax avenae CGMCC N0.8661 (Aaa)的基因組DNA擴(kuò)增得到如 SEQ ID N0.2 所示的核苷酸序列，將其直接用于步驟(2)構(gòu)建蛋白表達(dá)載體。
[0022]優(yōu)選地,所述步驟(2)包括:
[0023]使用限制性內(nèi)切酶BamH I和Hind III分別雙酶切步驟(1)得到的編碼基因與載體pET-28a，之后以T4連接酶連接得到的片段，從而構(gòu)建重組蛋白表達(dá)質(zhì)粒，然后將其轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌菌株中。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，大腸桿菌菌株為BL21 (DE3)。
[0024]優(yōu)選地,所述步驟(3 )包括:
[0025]以0.5mM的IPTG，誘導(dǎo)培養(yǎng)步驟(2)得到的經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21，得到51kD的蛋白；優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件為10°c，轉(zhuǎn)速150rpm。
[0026]再一方面，實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的蛋白能夠引起植物、特別是水稻的免疫反應(yīng)。因此，本發(fā)明還提供所述編碼基因或蛋白在制備植物免疫制劑中的用途。優(yōu)選地，所述免疫制劑為水稻免疫制劑。
[0027]具體而言，獲取本發(fā)明特定基因及蛋白的方法包括以下步驟:
[0028](I)獲取燕麥?zhǔn)人峋?Acidovorax avenae CGMCC N0.8661 (Aaa)序列為 SEQ IDN0.1的鞭毛蛋白基因；
[0029](2)以步驟(1)獲取的基因構(gòu)建免疫活性蛋白表達(dá)載體。
[0030]優(yōu)選地，上述方法還包括以下步驟:
[0031](3)將步驟(2)構(gòu)建的免疫活性蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。
[0032]在上述方法中，優(yōu)選地，步驟(1)包括以下步驟:[0033]以燕麥?zhǔn)人峋鶤cidovorax avenae CGMCC N0.8661 (Aaa)基因組 DNA 為模板,米用PCR方法擴(kuò)增核苷酸序列為SEQ ID N0.2的基因序列構(gòu)建至T載體pMD_18T中，得到的重組質(zhì)粒命名為pMD-18T-fliC ;其中，上游引物的核苷酸序列為SEQ ID NO:3，下游引物的核苷酸序列為SEQ ID N0.4 ；
[0034]將SEQ ID N0.2的基因序列與基因組序列已完全測序的燕麥?zhǔn)人峋粊喎N內(nèi)菌株Acidovorax avenae subsp.avenae ATCC19860進(jìn)行基因的比對分析,確定核昔酸序列為SEQ ID N0.1 的基因。
[0035]之后，在步驟(2)中，以pMD-18T_fliC為模板，上游引物的核苷酸序列為SEQ IDN0.5，下游引物的核苷酸序列為SEQ ID N0.6，PCR擴(kuò)增SEQ ID N0.1的基因序列，將其克隆到原核表達(dá)載體pET-28a中，得到的重組表達(dá)載體命名為pET-28a-fliC。
[0036]然后，在步驟(3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)步驟(2)轉(zhuǎn)化得到的大腸桿菌，得到蛋白序列為SEQ ID N0.7、大小約為5IKD的蛋白。
[0037]本發(fā)明利用燕麥?zhǔn)人峋鶤cidovorax avenae CGMCC N0.8661與同一亞種內(nèi)菌株燕麥?zhǔn)人峋?Acidovorax avenae subsp.avenae ATCC19860 鞭毛蛋白(GenBank 中，其 mRNA 序列 Locus:YP_004236748, CDS 序列為 1，479bp, Gene ID: 10309252，全基因序列Locus:NC_015138,基因注釋為 “flagellin domain-containing protein”)基因具有較高同源性這一特點(diǎn)，設(shè)計(jì)簡并引物，克隆得到大的基因片段，并經(jīng)比對確定了一種新型水稻免疫活性物質(zhì)的基因，命名為fliC，又進(jìn)而得到其編碼的蛋白即燕麥?zhǔn)人峋谋廾鞍譌liC。實(shí)驗(yàn)證明，將該燕麥?zhǔn)人峋谋廾鞍自吮磉_(dá)并純化濃縮后，處理水稻葉片，檢測到水稻上產(chǎn)生了 H2O2，這表明蛋白激發(fā)了水稻內(nèi)在的免疫反應(yīng)。
[0038]植物的免疫反應(yīng) 對阻止病原物的入侵有一定的作用。FliC具有突出的生物學(xué)功能特性，能夠誘導(dǎo)水稻產(chǎn)生過敏反應(yīng)(hypersensitive response, HR),即引起水稻的免疫反應(yīng)。這一特性為開發(fā)一種新型的水稻免疫活性物質(zhì)和廣譜性植物免疫誘導(dǎo)制劑提供了基礎(chǔ)，并且通過確定燕麥?zhǔn)人峋廾鞍椎幕钚怨δ苡?，可以制成一種植物免疫制劑，用于增強(qiáng)植物的抗病性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0039]以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中:
[0040]圖1顯示利用保守序列擴(kuò)增包含fliC全長基因的SEQ ID N0.2序列的克隆。其中圖1A是SEQ ID N0.2的克隆圖譜；圖1B是PCR擴(kuò)增SEQ ID N0.2的電泳結(jié)果圖，其中M為 marker(lkb ladder)(天根 code:MD113)。
[0041]圖2顯示fliC全長SEQ ID N0.1表達(dá)載體的構(gòu)建。其中，圖2A是pET_28a-fIiC表達(dá)載體的克隆圖譜；圖2B是PCR擴(kuò)增f IiC全長序列的電泳結(jié)果圖，其中M為marker (lkbladder);圖2C是表達(dá)載體pET_28a-fliC雙酶切驗(yàn)證電泳結(jié)果圖，其中M為marker (lkbladder)。
[0042]圖3顯示FliC蛋白的原核表達(dá)情況。圖3A是FliC蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果圖，M 為蛋白 marker (94KD)(天根 code:MP102);圖 3B 是 FliC 蛋白的 Western blot 驗(yàn)證，M 為蛋白 marker (245KD)(天根 code:MP206)。
[0043]圖4顯示FliC蛋白處理水稻葉片情況。PBS是溶解FliC蛋白的緩沖液?！揪唧w實(shí)施方式】
[0044]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
[0045]以下各實(shí)施例中，所使用的各種試驗(yàn)材料、試劑、載體等，均可通過商業(yè)途徑獲得；所涉及的各種試驗(yàn)操作方法，包括RNA的提取、cDNA的制備、克隆或表達(dá)載體的構(gòu)建、酶切、連接、菌株轉(zhuǎn)化、篩選等等，均為本領(lǐng)域內(nèi)常規(guī)的試驗(yàn)手段。
[0046]實(shí)施例1
[0047]利用同源比對的方法設(shè)計(jì)簡并引物擴(kuò)增燕麥?zhǔn)人峋廾颉?br> [0048]1、克隆燕麥?zhǔn)人峋?Acidovorax avenae CGMCC N0.8661 (Aaa)鞭毛蛋白基因
[0049]根據(jù)燕麥?zhǔn)人峋鷣喎N之間鞭毛蛋白基因的同源性，我們根據(jù)基因組全部測序的燕麥?zhǔn)人峋渌麃喎NAcidovorax avenae subsp.avenae ATCC19860設(shè)計(jì)擴(kuò)增Aaa鞭毛蛋白基因(fliC)全長的引物，以Aaa全基因組DNA為模板，用高保真酶擴(kuò)增PCR。然后將擴(kuò)增片段連接到載體pMD-18T(TaKaRa code:D101A)上(連接反應(yīng)參照pMD18_T vector試劑盒說明書)，得到的重組質(zhì)粒命名為pMD-18T-fliC。測序得到了大小為2，328bp的基因片段，為SEQ ID N0.2。重組質(zhì)粒構(gòu)建過程見圖1。
[0050]引物序列:
[0051]上游引物(SEQID N0.3):5’-GCTGGGAACAAACATTACTGCC-3’ ；
[0052]下游引物(SEQID N0.4):5’-GGTTCTGCACCTGCACGTTG-3’。
[0053]2、構(gòu)建FLIC表達(dá)載體
[0054]利用特異性引物擴(kuò)增fliC基因，以pMD-18T-fliC為模板，引物分別加上限制性酶切位點(diǎn)，序列如下:
[0055]上游引物SEQ ID N0.5:
[0056]5’-CGGGATCCATGGCATCCACCATCAACAC-3’ ；
[0057]下游引物SEQ ID N0.6:
[0058]5’-CCAAGCTTTCAACGCAGCAGGGACAACA-3’ 。
[0059]測序得到了大小為1，479bp的基因片段，為SEQ ID N0.1。
[0060]分別用特定限制性酶BamH I (TaKaRa code:D1010A)和 Hind III (TaKaRacode:D1060A)酶切該基因片段和表達(dá)載體pET_28a，然后用T4連接酶(TaKaRacode:D2050)連接，構(gòu)建成蛋白表達(dá)載體，命名為pET_28a_fliC (連接反應(yīng)參照T4DNA連接酶說明書)。將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，篩選、驗(yàn)證序列信息正確的陽性克隆，即為fliC表達(dá)載體。構(gòu)建過程見圖2。
[0061]3、FLIC蛋白表達(dá)
[0062]將重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a_f Iic轉(zhuǎn)至表達(dá)菌株BL21 (DE3)中，經(jīng)終濃度為0.5mM的IPTG在10°C，轉(zhuǎn)速為150rpm的條件下，誘導(dǎo)培養(yǎng)24h，得到了大小約為51kD的融合蛋白，可溶性檢測發(fā)現(xiàn)蛋白在上清中有表達(dá)。蛋白電泳和Western Blot具體過程:將純化的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE蛋白 電泳，通過半干式轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，加入5%的脫脂牛奶作為包被液封閉非特異性位點(diǎn)，在室溫下平穩(wěn)搖動(dòng)2h，加入小鼠單克隆抗體一抗Ant1-His (1:1000)，在4°C下過夜，棄一抗加辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠二抗IgG-HRP (1:5000)(北京天根生化科技有限公司)，在室溫下平穩(wěn)搖動(dòng)2h，棄二抗，加入Super ECL Plus超敏發(fā)光顯色液，通過化學(xué)發(fā)光成像儀觀察結(jié)果。結(jié)果見圖3。[0063]實(shí)施例2[0064]原核表達(dá)純化的蛋白處理水稻，檢測防衛(wèi)反應(yīng)的發(fā)生[0065]用溶于PBS的濃度約為0.3mg/ml的純化FliC注射2周大小的水稻葉片。24h后，剪取處理部位的葉片，用DAB (3，3’ - 二氨基聯(lián)苯胺)染色處理，再用酒精脫色，之后在顯微鏡下拍照。從圖4中可以看出，檢測到水稻上產(chǎn)生了 H2O2，這表明蛋白能誘導(dǎo)水稻產(chǎn)生過敏性反應(yīng)激發(fā)了水稻內(nèi)在的免疫反應(yīng)。
【權(quán)利要求】
1.一種植物免疫活性物質(zhì)的編碼基因，其特征在于，所述編碼基因具有如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的編碼基因，其特征在于，所述編碼基因具有如SEQID N0.2所示的核苷酸序列； 優(yōu)選地，所述編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所示。
3.一種用于誘導(dǎo)水稻防衛(wèi)反應(yīng)的蛋白，其特征在于，所述蛋白具有如SEQ ID N0.7所示的氨基酸序列； 優(yōu)選地，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.7所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的蛋白的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟: (1)獲取根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的編碼基因； (2)使用步驟(1)得到的編碼基因構(gòu)建蛋白表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌； (3)誘導(dǎo)步驟(2)得到的經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌表達(dá)所述蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)包括: 以燕麥?zhǔn)人峋鶤cidovorax avenae CGMCC N0.8661的基因組DNA為模板,米用PCR方法擴(kuò)增根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的編碼基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)包括: 使用限制性內(nèi)切酶BamH I和Hind III分別雙酶切步驟(1)得到的編碼基因與載體pET-28a，之后以T4連接酶連接得到的片段，從而構(gòu)建重組蛋白表達(dá)質(zhì)粒，然后將其轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿囷囷株中。
7.根據(jù)權(quán)利要求4至6中任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)包括: 以0.5mM的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)步驟(2)得到的經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21，得到51kD的蛋白； 優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件為10°C，轉(zhuǎn)速150rpm。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的編碼基因或者根據(jù)權(quán)利要求3所述蛋白在制備植物免疫制劑中的用途。
【文檔編號】A01P1/00GK103789323SQ201410010747
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月9日
【發(fā)明者】陳華民, 劉瑩, 田芳, 于清, 何晨陽 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所