一種解決麻瘋樹轉(zhuǎn)化不定芽條難以生根的無菌嫁接方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于作物遺傳工程領(lǐng)域。具體涉及一種解決麻瘋樹轉(zhuǎn)化不定芽條難以生根的無菌嫁接方法。本發(fā)明采用無菌微嫁接方法，將經(jīng)篩選得到的麻瘋樹陽性再生轉(zhuǎn)化芽條作為接穗，嫁接到作為砧木的帶有部分胚根原基的下胚軸上，嫁接后的接穗和砧木愈合程度良好。應(yīng)用本發(fā)明可以很好地解決麻瘋樹轉(zhuǎn)化再生不定芽條難以生根的問題，對獲得更多的麻瘋樹轉(zhuǎn)化苗并提高其質(zhì)量具有重要的作用。
【專利說明】一種解決麻瘋樹轉(zhuǎn)化不定芽條難以生根的無菌嫁接方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)和作物遺傳育種領(lǐng)域，具體地，涉及一種解決麻瘋樹轉(zhuǎn)化不定芽條難以生根的無菌嫁接方法。
【背景技術(shù)】
[0002]植物遺傳轉(zhuǎn)化是一種重要和先進(jìn)的育種技術(shù)。麻瘋樹由于其種子中含油量較高(40-60%)，可以開發(fā)為“生物柴油”，因而成為一種非常具有應(yīng)用前景的能源植物，但其分布區(qū)域較窄，種子結(jié)實率較低，種子油的質(zhì)量也還有待于進(jìn)一步改良，為了擴(kuò)大麻瘋樹的種植區(qū)域，培育出了高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的麻瘋樹新品種，可以利用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)達(dá)到這些目的。目前，植物遺傳轉(zhuǎn)化的技術(shù)已經(jīng)基本成熟，而最為通常的轉(zhuǎn)化是應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將外源基因?qū)氲绞荏w植物的細(xì)胞并整合到染色體基因組中以實現(xiàn)外源基因穩(wěn)定的遺傳。由于在遺傳轉(zhuǎn)化過程中同時還需要應(yīng)用培養(yǎng)基培養(yǎng)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生成為芽體，而農(nóng)桿菌在完成轉(zhuǎn)化后不能夠從轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中被清除掉，因此需要在完成轉(zhuǎn)化后的植物培養(yǎng)基中添加抗生素以抑制農(nóng)桿菌的增殖，避免轉(zhuǎn)化的細(xì)胞由于農(nóng)桿菌的過旺增殖而腐爛死亡。然而，抗生素除了能夠抑制農(nóng)桿菌的增殖外，在麻瘋樹的組織培養(yǎng)系統(tǒng)中，抗生素的添加還嚴(yán)重地抑制了麻瘋樹芽條的生根，導(dǎo)致麻瘋樹外植體在遺傳轉(zhuǎn)化處理后很難得到能夠栽培成活的完整植株。麻瘋樹芽條在含有抗生素的培養(yǎng)基中難以生根成了麻瘋樹遺傳轉(zhuǎn)化工作效率很低的一個重要原因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中麻瘋樹轉(zhuǎn)化不定芽條生根難、以及現(xiàn)有無菌嫁接技術(shù)不成熟的缺陷，提供了一種解決麻瘋樹轉(zhuǎn)化不定芽條難生根的無菌嫁接方法。
[0004]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)上述目的:
一種解決麻瘋樹轉(zhuǎn)化不定芽條難生根的無菌嫁接方法，包括如下步驟:
s1.將經(jīng)過轉(zhuǎn)基因操作和抗性篩選的芽體或由芽體伸長而成的芽條從外植體上切下，作為接穗；
s2.應(yīng)用無菌萌發(fā)的麻瘋樹幼苗，切除下胚軸頂端及以上部分，利用帶有部分胚根原基的下胚軸作為砧木；
s3.在無菌條件下，將SI獲得的接穗嫁接到S2獲得的砧木上；
s4.將嫁接有接穗的砧木轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)；
s5.培養(yǎng)結(jié)束后，取出嫁接苗進(jìn)行洗根和煉苗，然后即可進(jìn)行常規(guī)的栽培管理；
所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括:0mg/l抗生素、Omg/1硝普鈉、0.3mg/l吲哚丁酸、2 mg/1谷氨酰
胺、1/2 MS培養(yǎng)基成分。
[0005]在解決植物轉(zhuǎn)化不定芽條生根難的技術(shù)問題中，無菌嫁接技術(shù)開始顯示強(qiáng)大的作用。如專利號為201210368585.3的發(fā)明專利“一種解決大豆轉(zhuǎn)化不定芽條難以生根的無菌嫁接方法”公開了一種適用于大豆的無菌嫁接方法。理論上，無菌嫁接方法可適用于多種不同植物的生根培養(yǎng)，但是不同植物生長發(fā)育的特點不同，決定了其能采用的無菌嫁接技術(shù)的具體步驟和細(xì)節(jié)可能存在差異。本發(fā)明的發(fā)明人在最初的探索過程中，也試著采用專利號為201210368585.3公開的技術(shù)方案進(jìn)行麻瘋樹的無菌嫁接，效果很差。最后，發(fā)明人通過不斷的研究發(fā)現(xiàn):麻瘋樹無菌嫁接技術(shù)的關(guān)鍵點在于接穗和砧木的愈合、以及嫁接苗的生長。發(fā)明人通過不斷地對比，最終得出了一種最優(yōu)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基可以促進(jìn)接穗和砧木良好的愈合，而且使嫁接苗健康生長，使培育的嫁接苗在株高、芽長、根數(shù)、根長都呈現(xiàn)明顯的增加。
[0006]砧木來源對嫁接苗的生長效果有顯著的影響，為了獲得優(yōu)秀的砧木材料，優(yōu)選地，步驟S2所述無菌萌發(fā)的麻瘋樹幼苗的苗齡為5天。
[0007]本發(fā)明所述無菌嫁接的方式為插接法，接穗的優(yōu)選制備方法為:將經(jīng)過轉(zhuǎn)基因操作和抗性篩選的芽體或由芽體伸長而成的芽條從外植體上切下，將芽體或芽條的切口處部分莖的表皮刮除，使其形態(tài)學(xué)下端形成楔形切面。
[0008]砧木的優(yōu)選制備方法為::從幼苗子葉以下5毫米的位置切斷，取帶有部分胚根原基的下胚軸作為嫁接用的砧木材料，砧木的長度約為1.5厘米。
[0009]無菌嫁接的優(yōu)選方法為:用解剖刀在砧木形態(tài)學(xué)上端橫切面的中部豎著向下切
0.5厘米，把接穗小心插入砧木切口中完成嫁接。
[0010]在無菌嫁接過程中，要避免接穗與作為砧木的下胚軸根系接觸，以免接穗上殘留的農(nóng)桿菌傳染到根系，在沒有抗生素的培養(yǎng)基上過旺增殖，影響嫁接苗的生長。
[0011]S2所述無菌萌發(fā)的麻瘋樹幼苗是用無激素MS培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的。
[0012]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明采用無菌微嫁接方法，將經(jīng)篩選得到的麻瘋樹陽性再生轉(zhuǎn)化芽條作為接穗，嫁接到作為砧木的帶有部分胚根原基的下胚軸上，嫁接后的接穗和砧木愈合程度良好。應(yīng)用本發(fā)明可以很好地解決麻瘋樹轉(zhuǎn)化再生不定芽條難以生根的問題，對獲得更多的麻瘋樹轉(zhuǎn)化苗并提高其質(zhì)量具有重要的作用。
[0013]本發(fā)明通過不斷的研究發(fā)現(xiàn):麻瘋樹無菌嫁接技術(shù)的關(guān)鍵點在于接穗和砧木的愈合、以及嫁接苗的生長。發(fā)明人通過不斷地對比，最終得出了一種最優(yōu)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基可以促進(jìn)接穗和砧木良好的愈合，而且使嫁接苗健康生長，使培育的嫁接苗在株高、芽長、根數(shù)、根長都呈現(xiàn)明顯的增加。
[0014]說明書附圖
圖1.站'木和接糖不意圖；A:麻瘋樹種子明發(fā)培養(yǎng)5天后獲取的站'木,從左到右依次是帶有完整胚根的站木、帶有部分胚根原基的站木、完全不帶胚根的站木(bar=l cm)；B:麻瘋樹種子萌發(fā)培養(yǎng)5天后獲取的接穗(bar=0.5 cm) ；C:麻瘋樹種子萌發(fā)培養(yǎng)15天后獲取的接穗(bar=0.5 cm)。 [0015]圖2.兩種類型接穗的麻瘋樹無菌嫁接苗生長效果圖'A:麻瘋樹種子無菌萌發(fā)培養(yǎng)5天后獲取的芽接穗和帶有胚根的砧木進(jìn)行微嫁接后獲得的嫁接苗，在未添加抗生素和SNP的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)O天的效果；B:麻瘋樹種子無菌萌發(fā)培養(yǎng)5天后獲取的芽接穗和帶有胚根的砧木進(jìn)行微嫁接后獲得的嫁接苗，在未添加抗生素和SNP的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)30天的效果；C:麻瘋樹種子無菌萌發(fā)培養(yǎng)5天后獲取帶有胚根的砧木和15天后獲取的芽條接穗進(jìn)行微嫁接后獲得的嫁接苗，在未添加抗生素和SNP的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)O天的效果；D:麻瘋樹種子無菌萌發(fā)培養(yǎng)5天后獲取帶有胚根的砧木和15天后獲取的芽條接穗進(jìn)行微嫁接后獲得的嫁接苗，在未添加抗生素和SNP的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)30天的效果(bar=l cm)。
[0016]圖3.麻瘋樹無菌嫁接苗生長發(fā)育過程圖；A:麻瘋樹種子萌發(fā)培養(yǎng)5天后獲取的接穗和帶有部分胚根原基砧木進(jìn)行微嫁接后獲得的嫁接苗，在添加0.3 mg/1 IBA的1/2 MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)O天的效果；B:麻瘋樹種子萌發(fā)培養(yǎng)5天后獲取的接穗和帶有部分胚根原基砧木進(jìn)行微嫁接后獲得的嫁接苗，在添加0.3 mg/1 IBA的1/2 MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)30天的效果(bar=l cm)。
[0017]圖4.麻瘋樹無菌嫁接苗在添加了谷氨酰胺的培養(yǎng)基上的生長效果圖；A:麻瘋樹種子無菌萌發(fā)培養(yǎng)5天后獲取的芽作為接穗，和帶有部分胚根原基的砧木進(jìn)行微嫁接所得的嫁接苗，將其接種至添加了 2 mg/1 Gln和0.3 mg/1 IBA的1/2 MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d的效果:麻瘋樹種子無菌萌發(fā)培養(yǎng)15天后獲取的芽條作為接穗，和帶有部分胚根原基的砧木進(jìn)行微嫁接所得的嫁接苗，將其接種至添加了 2 mg/1 Gln和0.3 mg/1 IBA的1/2 MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d的效果(bar=l cm)。
[0018]圖5.麻瘋樹轉(zhuǎn)化芽條嫁接苗生長效果圖；A:以麻瘋樹轉(zhuǎn)化芽條為接穗進(jìn)行微嫁接后獲取的嫁接苗，將其接種至添加了 2 mg/1 Gln和0.3 mg/1 IBA的1/2 MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)O天的效果；B:以麻瘋樹轉(zhuǎn)化芽條為接穗進(jìn)行微嫁接后獲取的嫁接苗，將其接種至添加了 2 mg/1 Gln和0.3 mg/1 IBA的1/2 MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)30天的效果(bar=l cm)。
[0019]圖6.麻瘋樹無菌嫁接苗馴化移栽后生長效果圖'A:麻瘋樹無菌嫁接苗在培養(yǎng)基質(zhì)(沙礫:土壤=1:1)中培養(yǎng)20天后的效果；B:嫁接苗移栽到土壤中繼續(xù)生長的效果(bar=l cm)。
【具體實施方式】
[0020]下面結(jié)合說明書附圖和具體實施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。除非特別說明，實施例中采用的試劑和方法為本領(lǐng)域常規(guī)使用的試劑和方法。
[0021]實施例1:抗生素對麻瘋樹嫁接苗生長效果的影響
本次研究通過在培養(yǎng)基中添加抗生素，來探討抗生素對麻瘋樹嫁接苗生長發(fā)育情況的影響。本試驗將嫁接苗接種到不添加抗生素、添加200 mg/1羧芐青霉素或者添加200 mg/I頭孢霉素的MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)O天和30天后分別觀察記錄嫁接苗生長情況，結(jié)果如表1所示。
[0022]表1抗生素對嫁接苗生長效果的影響
【權(quán)利要求】
1.一種解決麻瘋樹轉(zhuǎn)化不定芽條難以生根的無菌嫁接方法，其特征在于包括如下步驟: 51.將經(jīng)過轉(zhuǎn)基因操作和抗性篩選的芽體或由芽體伸長而成的芽條從外植體上切下，作為接穗； 52.應(yīng)用無菌萌發(fā)的麻瘋樹幼苗，切除下胚軸頂端及以上部分，利用帶有部分胚根原基的下胚軸作為砧木； 53.在無菌條件下，將SI獲得的接穗嫁接到S2獲得的砧木上； 54.將嫁接有接穗的砧木轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)； 55.培養(yǎng)結(jié)束后，取出嫁接苗進(jìn)行洗根和煉苗，然后即可進(jìn)行常規(guī)的栽培管理； 所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括:Omg/l抗生素、Omg/1硝普鈉、0.3mg/l吲哚丁酸、2 mg/1谷氨酰胺、1/2 MS培養(yǎng)基成分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的解決麻瘋樹轉(zhuǎn)化不定芽條難以生根的無菌嫁接方法，其特征在于，S2所述無菌萌發(fā)的麻瘋樹幼苗的苗齡為5天。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的解決麻瘋樹轉(zhuǎn)化不定芽條難以生根的無菌嫁接方法，其特征在于，Si所述接穗的制備為:將經(jīng)過轉(zhuǎn)基因操作和抗性篩選的芽體或由芽體伸長而成的芽條從外植體上切下， 將芽體或芽條的切口處部分莖的表皮刮除，使其形態(tài)學(xué)下端形成楔形切面。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的解決麻瘋樹轉(zhuǎn)化不定芽條難以生根的無菌嫁接方法，其特征在于，S2所述砧木的制備過程為:從幼苗子葉以下5毫米的位置切斷，取帶有部分胚根原基的下胚軸作為嫁接用的砧木材料，砧木的長度為1.5厘米。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的解決麻瘋樹轉(zhuǎn)化不定芽條難以生根的無菌嫁接方法，其特征在于，S4所述嫁接步驟為:用解剖刀在砧木形態(tài)學(xué)上端橫切面的中部豎著向下切0.5厘米，把接穗小心插入砧木切口中完成嫁接。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的解決麻瘋樹轉(zhuǎn)化不定芽條難以生根的無菌嫁接方法，其特征在于，S2所述無菌萌發(fā)的麻瘋樹幼苗是用無激素MS培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的。
【文檔編號】A01G1/06GK103749160SQ201410015733
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月14日
【發(fā)明者】楊躍生, 劉穎, 劉振蘭, 莊楚雄, 李靜, 惠文凱, 陳曉陽 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)