受水稻白葉枯病菌與細(xì)菌性條斑病菌誘導(dǎo)的啟動子及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種受水稻白葉枯病菌與細(xì)菌性條斑病菌誘導(dǎo)的啟動子及應(yīng)用。本發(fā)明所提供的啟動子是下述a）-c）中任一的DNA片段：a）序列表中序列1所示DNA片段；b）與a）限定的核苷酸序列具有90%以上同源性，且具有啟動子功能的DNA片段；c）在嚴(yán)格條件下與a）或b）限定的核苷酸序列雜交，且具有啟動子功能的DNA片段。實驗證明，將本發(fā)明啟動子驅(qū)動Gus基因的植物表達(dá)載體導(dǎo)入水稻中，獲得轉(zhuǎn)基因水稻；接種水稻白葉枯病菌或水稻細(xì)菌性條斑病菌，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻葉片的Gus可受水稻白葉枯病菌或水稻細(xì)菌性條斑病菌誘導(dǎo)表達(dá)。本發(fā)明所提供的啟動子對于培育食用安全的轉(zhuǎn)基因植物抗病新品種具有重要的意義。
【專利說明】受水稻白葉枯病菌與細(xì)菌性條斑病菌誘導(dǎo)的啟動子及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種受水稻白葉枯病菌與細(xì)菌性條斑病菌誘導(dǎo)的啟動子及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]植物在生長過程中經(jīng)常各種病蟲害的危害。因此通過基因工程手段獲得抗病種質(zhì)將極大的促進(jìn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及消除病害的防治時施用農(nóng)藥帶來的環(huán)境污染。
[0003]基因的表達(dá)與啟動子密切相關(guān)，自1983年第一株轉(zhuǎn)基因植物問世以來，啟動子一直是基因工程的研究熱點，選擇合適并有效表達(dá)的啟動子將為基因工程的研究奠定堅實的基礎(chǔ)。誘導(dǎo)型表達(dá)啟動子可以使外源基因?qū)δ承┬盘柈a(chǎn)生響應(yīng)，只在特殊的信號刺激下表達(dá)。這些啟動子的最大優(yōu)點是:它克服了組成型啟動子啟動的外源基因在受體植物中非特異性的持續(xù)、高效表達(dá)所的浪費。
[0004]TALEs (transcription activator - like effectors)是在植物病原體黃單胞菌(Xanthomonas)中發(fā)現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子,TALEs的發(fā)現(xiàn)和結(jié)合DNA的特點為開發(fā)更簡易的新型基因組定點修飾技術(shù)提供了新途徑。植物病原體黃單胞菌將TALEs蛋白通過III型分泌系統(tǒng)注入植物細(xì)胞，TALEs細(xì)菌蛋白與轉(zhuǎn)錄因子行為相似，穿過核膜進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與特定的UPT (Up-regulated by TALE)盒結(jié)合，調(diào)控植物基因組中與疾病和抵抗力相關(guān)基因的表達(dá)。目前，在植物 病原菌中發(fā)現(xiàn)的該類蛋白已達(dá)到10余種。TALEs具有特殊的結(jié)構(gòu)特征，包括N端分泌信號、中央的DNA結(jié)合域、I個核定位信號和C端的激活域。通過對目前發(fā)現(xiàn)的所有TALEs蛋白分析發(fā)現(xiàn)，TALEs蛋白中DNA結(jié)合域有I個共同的特點，不同的TALEs蛋白的DNA結(jié)合域是由數(shù)目不同的(12~30)、高度保守的重復(fù)單元組成，每個重復(fù)單元含有33~35個氨基酸。這些重復(fù)單元的氨基酸組成相當(dāng)保守，除了第12和13位氨基酸可變外，其它氨基酸都是相同的，這兩個可變氨基酸被稱為重復(fù)序列可變的雙氨基酸殘基(repeatvariable d1-residues,RVD)。TALEs識別DNA的機(jī)制在于每個重復(fù)序列的2個RVD可以特異識別DNA的4個堿基中的I個，目前發(fā)現(xiàn)的RVD共有26種.統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，HD (氨基酸名稱)主要特異識別C堿基，NI主要識別A堿基，NK主要識別G堿基，NG主要識別T喊基等。
[0005]水稻是最重要的糧食作物之一，屬于黃單胞菌屬的水稻白葉枯病與細(xì)菌性條斑病是嚴(yán)重影響水稻生產(chǎn)的病害，受兩種病害誘導(dǎo)表達(dá)的啟動子的出現(xiàn)將助于抗病品種的培育。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種受水稻白葉枯病菌與細(xì)菌性條斑病菌誘導(dǎo)的啟動子及應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明所提供的啟動子，是下述a) -c)中任一的DNA片段:
[0008]a)序列表中序列I的第7-359位核苷酸所示DNA片段；
[0009]b)與a)限定的核苷酸序列具有90%以上同源性，且具有啟動子功能的DNA片段；[0010]c)在嚴(yán)格條件下與a)或b)限定的核苷酸序列雜交，且具有啟動子功能的DNA片段。
[0011]上述嚴(yán)格條件可為在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2XSSC，
0.1%SDS 和 I X SSC, 0.1%SDS 各洗膜一次。
[0012]含有所述DNA分子(啟動子)的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0013]在本發(fā)明中，所述重組載體為用所述DNA分子(啟動子)替換掉PCAMBIA1301載體中自身啟動子后得到的重組質(zhì)粒(ptale promoter::Gus載體)。
[0014]更加具體的，所 述重組載體為用所述DNA分子(啟動子)替換掉PCAMBIA1301載體的Kpn I和Noc I之間的小片段后所形成的重組質(zhì)粒
[0015]所述表達(dá)盒由具有啟動子功能的所述DNA分子，由所述DNA分子啟動表達(dá)的目的基因，以及轉(zhuǎn)錄終止序列組成；所述DNA分子以功能性方式與所述目的基因連接，且所述目的基因與所述轉(zhuǎn)錄終止序列連接。
[0016]在本發(fā)明的一個實施例中，所述表達(dá)盒中的所述目的基因具體為Gus基因(來源于所述PCAMBIA1301載體)；所述表達(dá)盒中的所述轉(zhuǎn)錄終止序列具體為NOS轉(zhuǎn)錄終止子(來源于所述 PCAMBIA1301)。
[0017]所述DNA分子(啟動子)在啟動目的基因表達(dá)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0018]在所述應(yīng)用中，所述表達(dá)具體為受水稻白葉枯病菌或/和水稻細(xì)菌性條斑病菌誘導(dǎo)表達(dá)。
[0019]在所述應(yīng)用中,所述表達(dá)可為植物體內(nèi)表達(dá)；如在植物葉片表達(dá)。
[0020]進(jìn)一步，在本發(fā)明中，所述誘導(dǎo)具體為:將轉(zhuǎn)入所述DNA分子(啟動子)和所述目的基因的植株或器官(如葉片)置于濃度為109CFU/mL的水稻白葉枯病菌的菌懸液或濃度為109CFU/mL的水稻細(xì)菌性條斑病菌的菌懸液中進(jìn)行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)的時間可為2天，溫度可為28°C，光周期可為L16:D8 (16h光，8h暗)。
[0021]所述DNA分子(啟動子)在如下任一種的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍:
[0022]( I)提高植物抗病性；
[0023](2)培育抗病性提高的轉(zhuǎn)基因植物。
[0024]在(2)所述應(yīng)用中，所述培育抗病性提高的轉(zhuǎn)基因植物，為:將含有所述DNA分子(啟動子)的表達(dá)盒導(dǎo)入目的植物中，得到所述轉(zhuǎn)基因植物；所述表達(dá)盒由具有啟動子功能的所述DNA分子，由所述DNA分子啟動表達(dá)的抗病基因，以及轉(zhuǎn)錄終止序列組成；所述DNA分子以功能性方式與所述抗病基因連接，且所述抗病基因與所述轉(zhuǎn)錄終止序列連接。
[0025]在所述應(yīng)用中，所述病為由黃單胞菌屬菌株引起的病；所述黃單胞菌屬菌株具體為水稻白葉枯病菌或/和水稻細(xì)菌性條斑病菌。
[0026]在本發(fā)明中，以上所有的所述水稻白葉枯病菌均為水稻白葉枯病菌PX099 ;以上所有的所述水稻細(xì)菌性條斑病菌均為水稻細(xì)菌性條斑病菌RS105。
[0027]在所述應(yīng)用中，所述目的基因可為Gus基因，所述抗病基因為Xa27基因(序列2)。所述植物可為雙子葉植物或單子葉植物；在本發(fā)明的一個實施例中，所述植物具體為水稻，如水稻品種臺北309。
[0028]實驗證明，將本發(fā)明啟動子驅(qū)動Gus基因的植物表達(dá)載體導(dǎo)入水稻中，獲得轉(zhuǎn)基因水稻；接種水稻白葉枯病菌或水稻細(xì)菌性條斑病菌，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻葉片的Gus可受水稻白葉枯病菌或水稻細(xì)菌性條斑病菌誘導(dǎo)表達(dá)。本發(fā)明所提供的啟動子對于培育抗病性更強(qiáng)的植物新品種具有重要的意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1Tale promoter啟動子結(jié)構(gòu)示意圖。其中，KpnI, NcoI, BamHI為限制性內(nèi)切酶；Xoc開頭為水稻細(xì)菌性條斑病菌的Tale識別序列；其他為水稻白葉枯病菌的Tale識別序列。
[0030]圖2為部分轉(zhuǎn)基因水稻的分子檢測結(jié)果。其中，A為潮霉素基因hpt的PCR分子鑒定結(jié)果；B為目標(biāo)基因Tale promoter的鑒定結(jié)果；A和B中，泳道1_12為Ttl代轉(zhuǎn)ptalepromoter::Gus 水稻，泳道 Tale::GUS 為陽性對照(重組載體 ptale promoter::Gus),泳道TP309CK為陰性對照(未轉(zhuǎn)基因的水稻品種臺北309)，泳道Marker為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)為DL2000，從大到小的條帶的大小分別為 2000bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp0
[0031]圖3為部分轉(zhuǎn)基因水稻Gus染色結(jié)果。其中，Line2、Line3和Line7為經(jīng)實施例3步驟二鑒定陽性的3個Ttl代轉(zhuǎn)ptale promoter::Gus。H2O為水對照,Xoo P6為水稻白葉枯病菌PX099，Xoc RS105為水稻細(xì)菌性條斑病菌RS105。
【具體實施方式】
[0032]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0033]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0034]水稻白葉枯病菌PX099:記載在“夏志輝，趙顯峰，范海闊，金良，高利芬，羅越華，翟文學(xué).分子標(biāo)記輔助選擇Xa23基因改良雜交稻親本的白葉枯病抗性，分子植物育種，2010, 8 (4): 652-656 ”一文中，公眾可從海南大學(xué)和中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。
[0035]水稻細(xì)菌性條斑病菌RS105:記載在“陳現(xiàn)朝，黃立鈺，周永力.分水稻類受體激酶基因OsBAKIL調(diào)控細(xì)胞壞死機(jī)制，作物學(xué)報，2013，39 (11): 1992-1999”一文中，公眾可從海南大學(xué)和中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所。
[0036]pCAMBIA1301載體:購于上海捷蘭生物技術(shù)有限公司，貨號CPC054。
[0037]水稻品種臺北309:記載在“曹孟良.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立；湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1999，25 (5):349-356" 一文中，公眾可從海南大學(xué)和中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。
[0038]農(nóng)桿菌LBA4404:寶生物工程(大連)有限公司:產(chǎn)品號:D9115。
[0039]下述實施例中所涉及的培養(yǎng)基配方如下:
[0040]基本培養(yǎng)基配方
【權(quán)利要求】
1.DNA分子，是下述a)-C)中任一的DNA片段: a)序列表中序列I的第7-359位核苷酸所示DNA片段； b)與a)限定的核苷酸序列具有90%以上同源性，且具有啟動子功能的DNA片段； c)在嚴(yán)格條件下與a)或b)限定的核苷酸序列雜交，且具有啟動子功能的DNA片段。
2.含有權(quán)利要求1所述DNA分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組載體，其特征在于:所述重組載體為用權(quán)利要求1所述DNA分子替換掉pCAMBIA1301載體中自身啟動子后得到的重組質(zhì)粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的表達(dá)盒，其特征在于:所述表達(dá)盒由具有啟動子功能的所述DNA分子，由所述DNA分子啟動表達(dá)的目的基因，以及轉(zhuǎn)錄終止序列組成；所述DNA分子以功能性方式與所述目的基因連接，且所述目的基因與所述轉(zhuǎn)錄終止序列連接。
5.權(quán)利要求1所述DNA分子啟動目的基因表達(dá)中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于:所述表達(dá)為受水稻白葉枯病菌或/和水稻細(xì)菌性條斑病菌誘導(dǎo)表達(dá)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的應(yīng)用，其特征在于:所述表達(dá)為植物體內(nèi)表達(dá)。
8.權(quán)利要求1所述DNA分子在如下任一種的應(yīng)用: (1)提高植物抗病性； (2)培育抗病性提高的 轉(zhuǎn)基因植物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于:所述病為由黃單胞菌屬菌株引起的?。? 所述黃單胞菌屬菌株具體為水稻白葉枯病菌或/和水稻細(xì)菌性條斑病菌。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9中任一所述的應(yīng)用，其特征在于:所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。
【文檔編號】A01H5/00GK103740723SQ201410017746
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月15日
【發(fā)明者】夏志輝, 趙天龍, 景曉輝, 翟文學(xué), 李明容, 黃惜, 何朝族 申請人:海南大學(xué), 中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所