一種銅綠假單胞菌株的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物農(nóng)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及拮抗菌-銅綠假單胞菌（Pseudomonas?aeruginosa）SU8，已于2013年5月7日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC?NO：M2013178。該菌株SU8發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物與井岡霉素復(fù)配后對防治水稻紋枯病菌具有增效作用；且該提取物對水稻細(xì)菌性條斑病菌和柑橘潰瘍病菌具有抑制作用。
【專利說明】一種銅綠假單胞菌株的應(yīng)用
[0001]本申請是申請?zhí)枮?01310250195.0、申請日為2013年6月21日，發(fā)明名稱為一種銅綠假單胞菌株的分案申請。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬于生物農(nóng)藥【技術(shù)領(lǐng)域】,特別涉及拮抗菌-銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa) SU8,同時還涉及該菌株的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003]在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，常使用化學(xué)農(nóng)藥防治作物病害的發(fā)生。盡管化學(xué)農(nóng)藥對作物病害有理想的防治效果，但由化學(xué)農(nóng)藥帶來的負(fù)面問題日益突出，譬如:污染環(huán)境、破壞天敵，長期使用也易誘發(fā)病原菌產(chǎn)生抗藥性。其次，過量的施用化學(xué)農(nóng)藥不僅增加了用藥成本，也會導(dǎo)致農(nóng)藥殘留。依靠現(xiàn)代生物防治技術(shù)，采用拮抗菌防治作物病害的發(fā)生起著非常重要的作用，特別是利用拮抗菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)防治作物病害，具有安全、高效、低毒、無污染、周期短、易于研究、便于生產(chǎn)、無殘留等優(yōu)點。
[0004]早期的研究結(jié)果表明:假單胞菌作為一種拮抗菌具有較大的開發(fā)潛力。銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)又是假單胞菌的一種,可產(chǎn)生吩嗪_1_羧酸、藤黃綠膿菌素、2，4_ 二乙酰藤黃酚等多種活性物質(zhì)，對水稻紋枯病、稻瘟病、煙草黑脛病、油菜菌核病、雜交竹梢枯病等多種植物病原菌具有抑制作用。由于該菌可產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)，不同菌株產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)不一樣，同一菌株也可產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì),而且這些抑菌物質(zhì)對植物病原真菌具有抑制作用，但其提取物與井網(wǎng)霉素的復(fù)配物對植物病原真菌抑制作用鮮見研究，而且對植物病原細(xì)菌的研究較少，僅見其代謝產(chǎn)物綠膿菌素對細(xì)菌具有抑制作用，其他代謝產(chǎn)物對植物病原細(xì)菌的研究也未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是:針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) SU8。
[0006]本發(fā)明所述的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) SU8,已于2013年5月7日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(地址:中國武漢.武漢大學(xué))，保藏編號為CCTCC NO:M2013178。
[0007]本發(fā)明菌株SU8的特性:
[0008]1.形態(tài)特征
[0009]在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上，在溫度28_30°C連續(xù)培養(yǎng)30h，通過電顯微鏡掃描觀察，菌株SU8 呈長桿狀，菌體長短均勻，一般長度在1-1.5 μ m范圍內(nèi)，有時成對或短鏈狀排列，見圖1。革蘭氏染色后的菌體呈紅色，指示該菌株為革蘭氏陰性菌。
[0010]2.在各種培養(yǎng)基上生長(溫度28_30°C，培養(yǎng)30h)的特征
[0011]馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基:菌落呈山脈狀、濕潤、表面粗糙邊緣光滑、呈淡黃色無金屬光澤、長時間培養(yǎng)產(chǎn)生墨綠色積淀物、紫外燈下有熒光。可溶性色素有。
[0012]牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:菌落呈圓形、濕潤、表面粗糙有小點狀突起、早期呈黃綠色、后期呈紅褐色、紫外燈下無熒光?？扇苄陨赜小?br> [0013]高氏一號培養(yǎng)基:菌落呈圓形、濕潤、表面與邊緣均光滑、無色透明狀?？扇苄陨?zé)o。
[0014]King氏培養(yǎng)基:菌落呈山脈狀、濕潤、表面粗糙有小點狀突起、邊緣光滑、有銅綠色金屬光澤，紫外燈下有熒光?？扇苄陨赜?。
[0015]3.生理化特征
[0016]能利用D-木糖、D-葡萄糖、甘露糖、赤蘚糖、阿糖醇、松三糖、甘油、檸檬酸鹽、甲基紅，可使明膠液化、脂肪分解、硝酸鹽還原、氧化酶陽性、膿青素陽性、接觸酶陽性、過氧化氫酶陽性、鳥氨酸脫羧酶陽性，但不能利用乳糖、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、肌醇、半乳糖、D果糖、蔗糖、棉籽糖、石蕊牛乳、糊精、麥芽糖、山梨酸糖、水楊苷、七葉靈、不產(chǎn)生硫化氫、氨氣、吲哚等，屬于好氧菌，能在41°C下生長但不能再4°C下生長。
[0017]參照文獻(xiàn)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》，結(jié)合本菌株SU8在各種培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀和生理生化特征，顯示該菌株符合銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)的相關(guān)鑒定特征。將菌株SU816S rDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，序列經(jīng)BLAST比對顯示，與銅綠假單胞菌菌株P(guān).aeruginosa SRDchr3 (EU714901)序列的同源性達(dá)到99%。通過系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建,顯示本菌株SU8與銅綠假單胞模式菌株 P.aeruginosa ATCC10145聚在同一系統(tǒng)進(jìn)化分支(見圖2)，同源性達(dá)到99%。結(jié)合本菌株SU8序列分析、形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理化特征，與《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》判斷該菌株屬于銅綠假單胞菌屬(P.aeruginosa),并命名為銅綠假單胞菌(P.aeruginosa) SU8。
[0018]將本發(fā)明菌株SU8按8-12%接種量接入牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，磁力攪拌子轉(zhuǎn)速為100-120r/min，置28-30°C振蕩培養(yǎng)箱中連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)72-96h，可獲得發(fā)酵液。最佳發(fā)酵條件為:接種量10%，轉(zhuǎn)速115r/min，溫度為29°C，時間85h。
[0019]本發(fā)明菌株SU8的發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯萃取并經(jīng)濃縮后，得到乙酸乙酯提取物，該提取物與井R霉素復(fù)配后，對水稻紋枯病菌具有增效作用，并對水稻細(xì)菌性條斑病菌和柑橘潰瘍病菌等植物病原細(xì)菌具有抑制作用，為進(jìn)一步研制新農(nóng)藥提供了理論依據(jù)，為控制植物病害提供理論基礎(chǔ)。
[0020]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點為:
[0021]1、發(fā)酵工藝簡單、快捷、操作方法方便。
[0022]2、本發(fā)明分離獲得的提取物與井R霉素的復(fù)配物對防治水稻紋枯病菌具有增效作用。
[0023]3、本發(fā)明分離獲得提取物對水稻細(xì)菌性條斑病菌和柑橘潰瘍病菌具有抑制作用，擴(kuò)大了抑菌譜。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1是本發(fā)明菌株SU8的電鏡掃描圖。
[0025]圖2是本發(fā)明菌株SU8的系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0026]圖3是本發(fā)明菌株的乙酸乙酯提取物對水稻細(xì)菌性條斑病菌抑制作用圖。其中:I表示乙酸乙酯提取物，2表示乙酸乙酯溶劑。
[0027]圖4是本發(fā)明菌株發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物對柑橘潰瘍病菌抑制作用圖。其中:I表示乙酸乙酯提取物，2表示乙酸乙酯溶劑。
【具體實施方式】
[0028]下面結(jié)合具體試驗和實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步說明，本發(fā)明試驗和實施例中涉及的百分比均為質(zhì)量百分比。
[0029]以下實施例中用到的水稻紋枯病菌(Rhizoctonia solani)、水稻細(xì)菌性條斑病菌(Xanthomonoasoryzaepv.0ryzicola)、相橘潰瘍病菌(Xanthomonas Campestrispv.citri )由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)實驗室提供。
[0030]實施例1本發(fā)明菌株的制備
[0031]采用稀釋分離法從瀏陽市的稻鴨共養(yǎng)田中篩選拮抗菌。準(zhǔn)確稱取IOg鴨糞放入90mL帶玻璃珠的無菌水中，振蕩30min，靜置IOmin后取懸浮液，按梯度濃度法稀釋至IX 10_7倍，然后將稀釋液涂布在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，得到單個菌落。將獲得的單個菌落用無菌水制成懸浮液并做成濾紙片，存放在距中央水稻紋枯病菌菌餅(5_)兩側(cè)對稱2cm處的馬鈴 薯瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，指示菌菌落長滿平板后，挑取有抑菌圈的細(xì)菌菌落，反復(fù)純化，獲得單一菌落，即為本發(fā)明的銅綠假單胞菌SU8。
[0032]實例2本發(fā)明菌株的活化和發(fā)酵
[0033]采用接種環(huán)將本發(fā)明菌株SU8接入牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基(牛肉膏3_6g、蛋白胨 8-10g、氯化鈉 4-5g、葡萄糖 15-20g，水 1000mL, pH 為 7.2-7.3)，28°C下培養(yǎng) 24h。再按10%接種量接入牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，磁力攪拌子轉(zhuǎn)速為1000r/min，置28-30°C振蕩培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)84h，獲得發(fā)酵液。
[0034]實例3抑菌物質(zhì)的提取
[0035]取發(fā)酵液和乙酸乙酯以1:2的比例充分混勻浸潰萃取48h，將萃取液置入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在溫度40°C,轉(zhuǎn)速110r/min旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至膏狀,獲得抑菌物質(zhì)。
[0036]實例4拮抗活性檢測
[0037]拮抗真菌的測定方法:將柑橘潰瘍病菌接種于PDA固體培養(yǎng)基中央，28°C下培養(yǎng)24h后在新長成的菌絲兩側(cè)打孔(Φ=5πιπι)，將待測活性物質(zhì)(實施例3中提及的抑菌提取物)注入一孔內(nèi)，另一側(cè)孔內(nèi)注入相應(yīng)的溶劑，每孔50 μ L，并以相應(yīng)的溶劑作空白對照，28°C培養(yǎng)24-48h，觀察抑菌狀況及抑菌圈大小，每個處理3次重復(fù)。
[0038]拮抗細(xì)菌的測定方法:采用平皿打孔法，將水稻細(xì)菌性條斑病菌懸浮液(I X 108cfu/mL) 60 μ L均勻涂布于NA平板，然后打孔(Φ =5mm),將待測活性物質(zhì)(實施例3中提及的抑菌提取物)注入一孔內(nèi)，另一側(cè)孔內(nèi)注入相應(yīng)的溶劑，每孔50 μ L，并以相應(yīng)的溶劑作對照，28°C培養(yǎng)24-48h，觀察抑菌狀況及抑菌圈大小，每個處理3次重復(fù)。
[0039]結(jié)果表明:該乙酸乙酯提取物對水稻細(xì)菌性條斑病菌和柑橘潰瘍病菌具有抑制活性，而對照溶劑無抑制活性，見圖3及圖4。
[0040]實例5乙酸乙酯提取物與井R霉素復(fù)配物對水稻紋枯病菌的毒力測定
[0041]經(jīng)預(yù)試確定各藥劑有效濃度范圍，每個藥劑按有效成分含量分別設(shè)5個劑量處理，設(shè)相應(yīng)的溶劑為對照(水:乙酸乙酯:丙酮)。參照《農(nóng)藥室內(nèi)生物測定試驗準(zhǔn)則殺菌劑》進(jìn)行，采用菌絲生長速率法測定藥劑對靶標(biāo)病菌的毒力。培養(yǎng)72h用十字交叉法測量菌落直徑，計算各處理菌絲生長抑制率，得出EC50和毒力回歸方程等參數(shù)，同時根據(jù)Wadley法計算兩藥劑不同配比聯(lián)合增效比值(SR)，SR〈0.5為拮抗作用，0.5≤SR≤1.5為協(xié)同作用，SR>1.5為增效作用。
[0042]試驗結(jié)果表明:對照對水稻紋枯病菌無影響，而復(fù)配物對水稻紋枯病菌的室內(nèi)毒力測定結(jié)果為乙酸乙酯提取物和井岡霉素的EC5tl分別為4120.17 μ g/mL和404.81 μ g/mL,乙酸乙酯提取物的毒力僅為井R霉素0.1倍，說明乙酸乙酯提取物的毒力低于井R霉素；將乙酸乙酯提取物與井網(wǎng)霉素經(jīng)復(fù)配后在1-10和10-1范圍內(nèi)具有協(xié)同和增效作用，其中乙酸乙酯提取物和井R霉素按9:1增效最明顯，其他配比1:9、1:1、4:1也有增效作用，而1:4配比則有協(xié)同作用，見下表1。
[0043]表1乙酸乙酯提取物、井岡霉素及其復(fù)配物對水稻紋枯病菌的毒力測定
[0044]
【權(quán)利要求】
1.一種保藏號為 CCTCC N0.M2013178 的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)SU8菌株在抑制柑橘潰瘍病菌 中的應(yīng)用。
【文檔編號】A01P1/00GK103704274SQ201410019910
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年6月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月21日
【發(fā)明者】廖曉蘭, 張亞, 蘇品, 黃璜, 劉雙清 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)