一種快速組織培養(yǎng)石斛種苗的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于種植【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種快速組織培養(yǎng)石斛種苗方法，所述的栽培方法包括：步驟1：共生真菌的分離及培養(yǎng)；步驟2：石斛組培苗的培養(yǎng)；步驟3：組培苗與共生菌共同培養(yǎng)；步驟4：菌根化組培苗的煉苗培養(yǎng)。本發(fā)明所述的方法能快速獲得石斛種苗且成活率達(dá)98％。
【專利說明】一種快速組織培養(yǎng)石斛種苗的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于種植【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種快速組織培養(yǎng)石斛種苗方法。
【背景技術(shù)】
[0002]石斛為我國傳統(tǒng)名貴中藥材，我國歷版藥典均有記載。中藥石斛的原植物為蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium Sw.)多年生草本植物。石斛具有滋陰清熱、生津益胃、潤肺止咳等功效，常用于熱病傷津、口干煩燥、病后虛熱等多種病癥?，F(xiàn)代藥理研究表明，石斛還具有抗腫瘤、抗衰老、增強(qiáng)人體免疫力及擴(kuò)張血管的作用。但由于人們長期無節(jié)制的采挖使自然資源枯竭，再加上鐵皮石斛本身的繁殖率極低，現(xiàn)鐵皮石斛成為國家重點(diǎn)保護(hù)的藥材品種之一。因此人工種植鐵皮石斛具有廣闊的前景，但缺乏優(yōu)質(zhì)種苗是鐵皮石斛種植業(yè)的瓶頸之一。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0003]本發(fā)明的目的在于開發(fā)出一種快速組織培養(yǎng)石斛種苗的方法，成活率達(dá)98%。
[0004]本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0005]一種快速組織培養(yǎng)石斛種苗方法，其特征包括以下步驟:
[0006]一種快速組織培養(yǎng)石斛種苗的方法，包括如下步驟:
[0007]步驟1:共生真菌的分離及培養(yǎng)
[0008]A.共生真菌的分離與純化
[0009]采取野生石斛的生活根，0.1 %升汞溶液浸泡2-5分鐘，無菌水沖洗3-5次；切為0.05-0.3cm2的組織段接種到共生真菌培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:20-30°C，黑暗培養(yǎng)；當(dāng)切口邊緣長出真菌菌絲時(shí)，采用菌絲頂端純化法逐步純化獲得純菌株；
[0010]所述共生真菌培養(yǎng)基為:葡萄糖或蔗糖10-40g / L、燕麥粉IO-1OOg / L、松蘿汁l-150g / L、氯霉素或青霉素0.001-lg / L、磷酸二氫鉀0.01-1Og / L、硫酸鎂0.01-1Og /L、酵母浸膏1-1Og / L、瓊脂l-30g / L，pH值為4-9，滅菌條件為:121°C、20分鐘；
[0011]B.共生真菌的發(fā)酵培養(yǎng)
[0012]將菌根真菌的斜面試管菌種活化后，轉(zhuǎn)接于共生真菌培養(yǎng)基中，于20_30°C恒溫培養(yǎng)1-30天，在菌落邊緣取菌塊接入液體共生真菌培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；接入量按重量計(jì)為1_10%，振蕩轉(zhuǎn)速20-300轉(zhuǎn)/分鐘，20-30°C暗培養(yǎng)1-60天；
[0013]步驟2:石斛組培苗的培養(yǎng)
[0014]A.原球莖和叢生芽的誘導(dǎo)
[0015]取野生石斛當(dāng)年生的嫩芽，用0.1 %升汞溶液滅菌2-10分鐘，無菌水沖洗3-5次后，剪取0.5-3厘米帶節(jié)的莖段，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)溫度10-30°C條件下，培養(yǎng)3-30天；光照度1000~2500Lx，光照12小時(shí)/天；
[0016]所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS、6-芐基嘌呤0.1-1Omg / L、萘乙酸0.1-1Omg / L、蔗糖10-40g / L、松蘿汁 20-200g / L、瓊脂 l_30g / L，pH4_9 ;[0017]B.壯苗生根培養(yǎng)
[0018]將叢生芽轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基I上培養(yǎng)5-50天，培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度為1000Lx~3000Lx，光照周期為光照/黑暗=14h / 10h，溫度20-30°C;株高達(dá)2cm以上時(shí)轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基2培養(yǎng)10-50天，培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度為2000Lx~3000Lx，光照周期為光照/黑暗=14h /IOh，溫度 20-30 0C ；
[0019]所述培養(yǎng)基I 為:1 / 2MS、蔗糖 10-40g / L、松蘿汁 20_200g / L、香蕉 10_40g /L、瓊脂 l-30g / L，pH4-9 ；
[0020]所述培養(yǎng)基2 為:1 / 2MS、蔗糖 10-40g / L、松蘿汁 20_200g / L、香蕉 10_40g /L、活性炭 0.1-1Og / L、瓊脂 l-30g / L，pH4_9 ；
[0021]步驟3:組培苗與共生菌共同培養(yǎng)
[0022]取共生菌液體菌種I~30%接種于共生培養(yǎng)基中，在20-30°C下暗培養(yǎng)3-9天后，再將組培苗接入共培養(yǎng)10-50天；
[0023]共培養(yǎng)條件:光照強(qiáng)度為1000-3000LX，光照周期為:光照/黑暗=14h / 10h，溫度 20-30 0C ；
[0024]共生培養(yǎng)基為:1 / 2MS培養(yǎng)基、馬鈴薯100-300g / L、蔗糖20_40g / L、松蘿汁20-200g / L、肌醇 20-200mg / L、瓊脂 l_30g / L, ρΗ4.0-9.0 ；
[0025]步驟4:菌根化組培苗的煉苗培養(yǎng)
[0026]Α.自然光照下在瓶中煉苗5-10天；
[0027]B.將菌根化成功的組培苗從玻璃瓶中取出，在0.1 %的高錳酸鉀溶液中浸泡3-9分鐘后晾干栽種到塑料盆中，溫度15-35°C、濕度40-80%和遮陽率為50-70%的條件下培養(yǎng)，煉苗期3-12個(gè)月；栽培基質(zhì)為經(jīng)121°C高壓滅菌2h的新鮮苔蘚，待苔蘚涼至常溫后用來種植。
[0028]所述步驟I進(jìn)一步為:
[0029]A.共生真菌的分離與純化
[0030]采取野生石斛的生活根，在流水下沖洗5-10分鐘，并用毛刷去除表面附著物，然后放置于吸水紙上，用72 %酒精沖洗一下，無菌水沖洗3-5次后，0.1 %升汞溶液浸泡2-5分鐘，無菌水沖洗4次；把細(xì)跟切為0.05-0.3cm2的組織段接種到共生真菌培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:20-30°C，黑暗培養(yǎng)；當(dāng)切口邊緣長出真菌菌絲時(shí)，采用菌絲頂端純化法逐步純化獲得純菌株；
[0031]所述共生真菌培養(yǎng)基為:葡萄糖或蔗糖10_40g / L、燕麥粉IO-1OOg / L、松蘿汁l-150g / L、氯霉素或青霉素0.001-lg / L、磷酸二氫鉀0.01-1Og / L、硫酸鎂0.01-1Og /L、酵母浸膏1-1Og / L、瓊脂l-30g / L，pH值為4-9，滅菌條件為:121°C、20分鐘；
[0032]B.共生真菌的發(fā)酵培養(yǎng)
[0033]將菌根真菌的斜面試管菌種活化后，轉(zhuǎn)接于共生真菌培養(yǎng)基中，于20_30°C恒溫培養(yǎng)1-30天，在菌落邊緣取小菌塊接入液體共生真菌培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；接入量按重量計(jì)為1-10% ;振蕩轉(zhuǎn)速20-300轉(zhuǎn)/分鐘，20-30°C暗培養(yǎng)1-60天。
[0034]所述步驟2的A進(jìn)一步為:
[0035]A.原球莖和叢生芽的誘導(dǎo):取野生石斛當(dāng)年生具3-5個(gè)節(jié)的嫩芽，去除葉片后，在流水下沖洗5-10分鐘，在超凈工作臺(tái)上用70%的酒精浸泡1-3分鐘，再用0.1 %升汞溶液滅菌2-10分鐘，無菌水沖洗5次后，用無菌吸水紙吸干，剪取0.5-3厘米帶節(jié)的莖段，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)溫度10-30°C條件下，培養(yǎng)3-30天；光照度1000~2500Lx，光照12小時(shí)/天；
[0036]所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS、6-芐基嘌呤0.1-1Omg / L、萘乙酸0.1-1Omg / L、蔗糖10-40g / L、松蘿汁 20-200g / L、瓊脂 l_30g / L，pH4_9。
[0037]所述步驟2的B進(jìn)一步為:
[0038]B.壯苗生根培養(yǎng):將利用莖段誘導(dǎo)的叢生芽增殖多代后，可將叢生芽切割成單個(gè)芽轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基I上培養(yǎng)5-50天，培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度為lOOOLx~3000Lx，光照周期為光照/黑暗=14h / 10h，溫度20-30°C ;株高可達(dá)2cm以上時(shí)轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基2培養(yǎng)10-50天，培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度為2000Lx~3000Lx，光照周期為光照/黑暗=14h / 10h，溫度20-30 °C ；
[0039]所述培養(yǎng)基I 為:1 / 2Ms、蔗糖 10-40g / L、松蘿汁 20_200g / L、香蕉 10_40g /L、瓊脂 l-30g / L，pH4-9 ；
[0040]所述培養(yǎng)基2 為:1 / 2MS、蔗糖 10-40g / L、松蘿汁 20_200g / L、香蕉 10_40g /L、活性炭 0.1-1Og / L、瓊脂 l-30g / L，pH4_9 ；
[0041]所述步驟4進(jìn)一 步為:
[0042]選擇每年3-5月份為出瓶移栽的季節(jié)，或者提供類似3-5月份自然條件的生長環(huán)境進(jìn)行出瓶移栽；
[0043]A.自然光照下在瓶中煉苗5-10天；
[0044]B.將菌根化成功的組培苗從玻璃瓶中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，在0.1%的高錳酸鉀溶液中浸泡3-9分鐘后晾干栽種到塑料盆中，在溫度15-35°C、濕度40-80%和遮陽率為50-70%的條件下培養(yǎng)，第二天開始葉面噴灑清水，每天2次，每半個(gè)月追施營養(yǎng)液一次，煉苗期3-12個(gè)月；以噴霧處理維持空氣濕度及含水量，營養(yǎng)液的成分是含有磷酸二氫鉀和硝酸銨的水溶液，栽培基質(zhì)為經(jīng)121°C高壓滅菌2h的新鮮苔蘚，待苔蘚涼至常溫后用來種植；在石斛生長的過程中可以根據(jù)需要補(bǔ)施液體菌根真菌。
[0045]實(shí)施例
[0046]實(shí)施例1
[0047]步驟1:共生真菌的分離及培養(yǎng)
[0048]A.共生真菌的分離與純化
[0049]采取野生石斛的生活根，在流水下沖洗5-10分鐘，并用毛刷去除表面附著物，然后放置于吸水紙上，用72%酒精沖洗一下，無菌水沖洗3-5次后，0.1%升汞溶液浸泡2分鐘，無菌水沖洗4次；把細(xì)跟切為0.05cm2的組織段接種到共生真菌培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:20°C，黑暗培養(yǎng)；當(dāng)切口邊緣長出真菌菌絲時(shí)，采用菌絲頂端純化法逐步純化獲得純菌株；
[0050]所述共生真菌培養(yǎng)基為:葡萄糖IOg / L、燕麥粉IOg / L、松蘿汁Ig / L、氯霉素0.0Olg / L、磷酸二氫鉀0.01g / L、硫酸鎂0.01g / L、酵母浸膏Ig / L、瓊脂Ig / L，pH值為4，滅菌條件為:121°C、20分鐘；
[0051]B.共生真菌的發(fā)酵培養(yǎng)
[0052]將菌根真菌的斜面試管菌種活化后，轉(zhuǎn)接于共生真菌培養(yǎng)基中，于20°C恒溫培養(yǎng)I天，在菌落邊緣取小菌塊接入液體共生真菌培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；接入量按重量計(jì)為1% ;振蕩轉(zhuǎn)速20轉(zhuǎn)/分鐘，20°C暗培養(yǎng)I天。
[0053]步驟2.石斛組培苗的培養(yǎng)
[0054]A.原球莖和叢生芽的誘導(dǎo):取野生石斛當(dāng)年生具3-5個(gè)節(jié)的嫩芽，去除葉片后，在流水下沖洗5-10分鐘，在超凈工作臺(tái)上用70%的酒精浸泡I分鐘，再用0.1 %升汞溶液滅菌2分鐘，無菌水沖洗5次后，用無菌吸水紙吸干，剪取0.5厘米帶節(jié)的莖段，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)溫度10°C條件下，培養(yǎng)3天；光照度1000~2500Lx，光照12小時(shí)/天；
[0055]所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS、6-芐基嘌呤0.1mg / L、萘乙酸0.1mg / L、蔗糖IOg / L、松蘿汁20g / L、瓊脂Ig / L，pH4 ；
[0056]B.壯苗生根培養(yǎng):將利用莖段誘導(dǎo)的叢生芽增殖多代后，可將叢生芽切割成單個(gè)芽轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基I上培養(yǎng)5天，培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度為lOOOLx~3000LX，光照周期為光照/黑暗=14h / 10h，溫度20-30°C;株高可達(dá)2cm以上時(shí)轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基2培養(yǎng)10天，培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度為2000Lx~3000Lx，光照周期為光照/黑暗=14h / 10h，溫度20°C ；[0057]所述培養(yǎng)基I為:1 / 2MS、蔗糖IOg / L、松蘿汁20g / L、香蕉IOg / L、瓊脂Ig /L，pH4 ；
[0058]所述培養(yǎng)基2為:1 / 2MS、蔗糖IOg / L、松蘿汁20g / L、香蕉IOg / L、活性炭0.1g / L、瓊脂 Ig / L, pH4 ；
[0059]3.組培苗與共生菌共同培養(yǎng)
[0060]取共生菌液體菌種I %接種于共生培養(yǎng)基中，在20°C下暗培養(yǎng)3天后，再將組培苗接入共培養(yǎng)10天；
[0061]共培養(yǎng)條件:光照強(qiáng)度為1000-3000LX，光照周期為:光照/黑暗=14h / 10h，溫度 20 0C ；
[0062]共生培養(yǎng)基為:1 / 2MS培養(yǎng)基、馬鈴薯100g / L、蔗糖20g / L、松蘿汁20g / L、肌醇 20mg / L、瓊脂 Ig / L，pH4 ；
[0063]4.菌根化組培苗的煉苗培養(yǎng)
[0064]每年3-5月份為出瓶移栽的季節(jié)；
[0065]A.自然光照下在瓶中煉苗5天；
[0066]B.將菌根化成功的組培苗從玻璃瓶中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，在0.1%的高錳酸鉀溶液中浸泡3分鐘后晾干栽種到塑料盆中，在溫度15°C、濕度40%和遮陽率為50%的條件下培養(yǎng)，第二天開始葉面噴灑清水，每天2次，每半個(gè)月追施營養(yǎng)液一次，煉苗期3個(gè)月；以噴霧處理維持空氣濕度及含水量，營養(yǎng)液的成分是含有磷酸二氫鉀和硝酸銨的水溶液，栽培基質(zhì)為經(jīng)121°C高壓滅菌2h的新鮮苔蘚，待苔蘚涼至常溫后用來種植；在石斛生長的過程中可以根據(jù)需要補(bǔ)施液體菌根真菌。
[0067]實(shí)施例2
[0068]步驟1:共生真菌的分離及培養(yǎng)
[0069]A.共生真菌的分離與純化
[0070]采取野生石斛的生活根，在流水下沖洗5-10分鐘，并用毛刷去除表面附著物，然后放置于吸水紙上，用72%酒精沖洗一下，無菌水沖洗3-5次后，0.1%升汞溶液浸泡5分鐘，無菌水沖洗4次；把細(xì)跟切為0.3cm2的組織段接種到共生真菌培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:30°C，黑暗培養(yǎng)；當(dāng)切口邊緣長出真菌菌絲時(shí)，采用菌絲頂端純化法逐步純化獲得純菌株;
[0071]所述共生真菌培養(yǎng)基為:蔗糖IOg / L、燕麥粉100g / L、松蘿汁150g / L、青霉素Ig / L、磷酸二氫鉀IOg / L、硫酸鎂IOg / L、酵母浸膏IOg / L、瓊脂30g / L，pH值為9，滅菌條件為:121°C、20分鐘；
[0072]B.共生真菌的發(fā)酵培養(yǎng)
[0073]將菌根真菌的斜面試管菌種活化后，轉(zhuǎn)接于共生真菌培養(yǎng)基中，于30°C恒溫培養(yǎng)30天，在菌落邊緣取小菌塊接入液體共生真菌培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；接入量按重量計(jì)為10% ;振蕩轉(zhuǎn)速300轉(zhuǎn)/分鐘，30°C暗培養(yǎng)60天。
[0074]步驟2.石斛組培苗的培養(yǎng)
[0075]A.原球莖和叢生芽的誘導(dǎo):取野生石斛當(dāng)年生具3-5個(gè)節(jié)的嫩芽，去除葉片后，在流水下沖洗5-10分鐘，在超凈工作臺(tái)上用70%的酒精浸泡3分鐘，再用0.1 %升汞溶液滅菌10分鐘，無菌水沖洗5次后，用無菌吸水紙吸干，剪取0.5-3厘米帶節(jié)的莖段，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)溫度30°C條件下，培養(yǎng)30天；光照度1000~2500Lx，光照12小時(shí)/天;
[0076]所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS、6-芐基嘌呤IOmg / L、萘乙酸IOmg / L、蔗糖40g / L、松蘿汁 200g / L、瓊脂 30g / L，pH9 ；
[0077]B.壯苗生根培養(yǎng):將利用莖段誘導(dǎo)的叢生芽增殖多代后，可將叢生芽切割成單個(gè)芽轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基I上培養(yǎng)50天，培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度為lOOOLx~3000LX，光照周期為光照/黑暗=14h / 10h，溫度30°C ;株高可達(dá)2cm以上時(shí)轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基2培養(yǎng)50天，培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度為2000Lx~3000Lx，光照周期為光照/黑暗=14h / 10h，溫度30°C ；
[0078]所述培養(yǎng)基I為:1 / 2MS、蔗糖40g / L、松蘿汁200g / L、香蕉40g / L、瓊脂30g / L, pH9 ；
[0079]所述培養(yǎng)基2為:1 / 2MS、蔗糖40g / L、松蘿汁200g / L、香蕉40g / L、活性炭IOg / L、瓊脂 30g / L，pH9 ；
[0080]3.組培苗與共生菌共同培養(yǎng)
[0081]取共生菌液體菌種30%接種于共生培養(yǎng)基中，在30°C下暗培養(yǎng)9天后，再將組培苗接入共培養(yǎng)50天；
[0082]共培養(yǎng)條件:光照強(qiáng)度為1000-3000LX，光照周期為:光照/黑暗=14h / 10h，溫度 30 0C ；
[0083]共生培養(yǎng)基為:1 / 2MS培養(yǎng)基、馬鈴薯300g / L、蔗糖40g / L、松蘿汁200g /L、肌醇 200mg / L、瓊脂 30g / L，pH9 ；
[0084]4.菌根化組培苗的煉苗培養(yǎng)
[0085]提供類似3-5月份自然條件的生長環(huán)境進(jìn)行出瓶移栽；
[0086]A.自然光照下在瓶中煉苗10天；
[0087]B.將菌根化成功的組培苗從玻璃瓶中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，在0.1%的高錳酸鉀溶液中浸泡9分鐘后晾干栽種到塑料盆中，在溫度35°C、濕度80%和遮陽率為70%的條件下培養(yǎng)，第二天開始葉面噴灑清水，每天2次，每半個(gè)月追施營養(yǎng)液一次，煉苗期12個(gè)月；以噴霧處理維持空氣濕度及含水量，營養(yǎng)液的成分是含有磷酸二氫鉀和硝酸銨的水溶液，栽培基質(zhì)為經(jīng)121°C高壓滅菌2h的新鮮苔蘚，待苔蘚涼至常溫后用來種植；在石斛生長的過程中可以根據(jù)需要補(bǔ)施液體菌根真菌。
[0088]實(shí)施例3
[0089]步驟1:共生真菌的分離及培養(yǎng)
[0090]A.共生真菌的分離與純化
[0091]采取野生石斛的生活根，在流水下沖洗5-10分鐘，并用毛刷去除表面附著物，然后放置于吸水紙上，用72%酒精沖洗一下，無菌水沖洗3-5次后，0.1%升汞溶液浸泡3分鐘，無菌水沖洗4次；把細(xì)跟切為0.05-0.3cm2的組織段接種到共生真菌培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:25°C，黑暗培養(yǎng)；當(dāng)切口邊緣長出真菌菌絲時(shí)，采用菌絲頂端純化法逐步純化獲得純菌株；
[0092]所述共生真菌培養(yǎng)基為:蔗糖20g / L、燕麥粉20g / L、松蘿汁IOg / L、氯霉素
0.01g / L、磷酸二氫鉀Ig / L、硫酸鎂Ig / L、酵母浸膏2g / L、瓊脂5g / L，pH值為5，滅菌條件為:121°C、20分鐘；
[0093]B.共生真菌的發(fā)酵培養(yǎng)
[0094]將菌根真菌的斜面試管菌種活化后，轉(zhuǎn)接于共生真菌培養(yǎng)基中，于25°C恒溫培養(yǎng)10天，在菌落邊緣取小菌塊接入液體共生真菌培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；接入量按重量計(jì)為2% ;振蕩轉(zhuǎn)速50轉(zhuǎn)/分鐘，25°C暗培養(yǎng)10天。
[0095]步驟2.石斛組培苗的培養(yǎng)
[0096]A.原球莖和叢生芽的誘導(dǎo):取野生石斛當(dāng)年生具3-5個(gè)節(jié)的嫩芽，去除葉片后，在流水下沖洗5-10分鐘，在超凈工作臺(tái)上用70%的酒精浸泡1.5分鐘，再用0.1 %升汞溶液滅菌4分鐘，無菌水沖洗5次后，用無菌吸水紙吸干，剪取0.5-3厘米帶節(jié)的莖段，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)溫度15°C條件下，培養(yǎng)10天；光照度1000~2500Lx，光照12小時(shí)/天;
[0097]所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS、6_芐基嘌呤Img / L、萘乙酸Img / L、蔗糖15g / L、松蘿汁 50g / L、瓊脂 5g / L，pH5 ；
[0098]B.壯苗生根培養(yǎng):將利用莖段誘導(dǎo)的叢生芽增殖多代后，可將叢生芽切割成單個(gè)芽轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基I上培養(yǎng)10天，培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度為1000Lx~3000LX，光照周期為光照/黑暗=14h / 10h，溫度25°C ;株高可達(dá)2cm以上時(shí)轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基2培養(yǎng)15天，培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度為2000Lx~3000Lx，光照周期為光照/黑暗=14h / 10h，溫度25°C ；
[0099]所述培養(yǎng)基I為:1 / 2MS、蔗糖15g / L、松蘿汁50g / L、香蕉15g / L、瓊脂5g /L, pH5 ；
[0100]所述培養(yǎng)基2為:1 / 2MS、蔗糖15g / L、松蘿汁50g / L、香蕉15g / L、活性炭Ig / L、瓊脂 5g / L, pH5 ；
[0101]3.組培苗與共生菌共同培養(yǎng)
[0102]取共生菌液體菌種5%接種于共生培養(yǎng)基中，在25°C下暗培養(yǎng)4天后，再將組培苗接入共培養(yǎng)15天；
[0103]共培養(yǎng)條件:光照強(qiáng)度為1000-3000LX，光照周期為:光照/黑暗=14h / 10h，溫度 20-30 0C ；
[0104] 共生培養(yǎng)基為:1 / 2MS培養(yǎng)基、馬鈴薯150g / L、蔗糖25g / L、松蘿汁50g / L、肌醇 IOOmg / L、瓊脂 5g / L，ρΗ4.5 ；
[0105]4.菌根化組培苗的煉苗培養(yǎng)
[0106]每年3-5月份為出瓶移栽的季節(jié)；
[0107]Α.自然光照下在瓶中煉苗6天；
[0108]B.將菌根化成功的組培苗從玻璃瓶中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，在0.1%的高錳酸鉀溶液中浸泡5分鐘后晾干栽種到塑料盆中，在溫度205°C、濕度45%和遮陽率為55%的條件下培養(yǎng)，第二天開始葉面噴灑清水，每天2次，每半個(gè)月追施營養(yǎng)液一次，煉苗期4個(gè)月；以噴霧處理維持空氣濕度及含水量，營養(yǎng)液的成分是含有磷酸二氫鉀和硝酸銨的水溶液，栽培基質(zhì)為經(jīng)121°C高壓滅菌2h的新鮮苔蘚，待苔蘚涼至常溫后用來種植；在石斛生長的過程中可以根據(jù)需要補(bǔ)施液體菌根真菌。 [0109]實(shí)施例4
[0110]步驟1:共生真菌的分離及培養(yǎng)
[0111]A.共生真菌的分離與純化
[0112]采取野生石斛的生活根，在流水下沖洗5-10分鐘，并用毛刷去除表面附著物，然后放置于吸水紙上，用72%酒精沖洗一下，無菌水沖洗3-5次后，0.1%升汞溶液浸泡4分鐘，無菌水沖洗4次；把細(xì)跟切為0.05-0.3cm2的組織段接種到共生真菌培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:28°C，黑暗培養(yǎng)；當(dāng)切口邊緣長出真菌菌絲時(shí)，采用菌絲頂端純化法逐步純化獲得純菌株；
[0113]所述共生真菌培養(yǎng)基為:蔗糖30g / L、燕麥粉70g / L、松蘿汁50g / L、青霉素0.05g / L、磷酸二氫鉀3g / L、硫酸鎂0.05g / L、酵母浸膏3g / L、瓊脂15g / L，pH值為6，滅菌條件為:121°C、20分鐘；
[0114]B.共生真菌的發(fā)酵培養(yǎng)
[0115]將菌根真菌的斜面試管菌種活化后，轉(zhuǎn)接于共生真菌培養(yǎng)基中，于28°C恒溫培養(yǎng)20天，在菌落邊緣取小菌塊接入液體共生真菌培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；接入量按重量計(jì)為8% ;振蕩轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分鐘，28°C暗培養(yǎng)20天。
[0116]步驟2.石斛組培苗的培養(yǎng)
[0117]A.原球莖和叢生芽的誘導(dǎo):取野生石斛當(dāng)年生具3-5個(gè)節(jié)的嫩芽，去除葉片后，在流水下沖洗5-10分鐘，在超凈工作臺(tái)上用70%的酒精浸泡2分鐘，再用0.1 %升汞溶液滅菌4分鐘，無菌水沖洗5次后，用無菌吸水紙吸干，剪取0.5-3厘米帶節(jié)的莖段，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)溫度20°C條件下，培養(yǎng)20天；光照度1000~2500Lx，光照12小時(shí)/天；
[0118]所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS、6-芐基嘌呤5mg / L、萘乙酸3mg / L、蔗糖30g / L、松蘿汁 100g / L、瓊脂 50g / L，pH6 ；
[0119]B.壯苗生根培養(yǎng):將利用莖段誘導(dǎo)的叢生芽增殖多代后，可將叢生芽切割成單個(gè)芽轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基I上培養(yǎng)20天，培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度為lOOOLx~3000LX，光照周期為光照/黑暗=14h / 10h，溫度28°C ;株高可達(dá)2cm以上時(shí)轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基2培養(yǎng)40天，培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度為2000Lx~3000Lx，光照周期為光照/黑暗=14h / 10h，溫度28°C ；
[0120]所述培養(yǎng)基I為:1 / 2MS、蔗糖30g / L、松蘿汁150g / L、香蕉20g / L、瓊脂20g / L, pH6:
[0121]所述培養(yǎng)基2為:1 / 2MS、蔗糖30g / L、松蘿汁150g / L、香蕉30g / L、活性炭7g / L、瓊脂 3g / L，pH7 ；
[0122]3.組培苗與共生菌共同培養(yǎng)
[0123]取共生菌液體菌種I~30%接種于共生培養(yǎng)基中，在25°C下暗培養(yǎng)8天后，再將組培苗接入共培養(yǎng)40天；
[0124]共培養(yǎng)條件:光照強(qiáng)度為1000-3000LX，光照周期為:光照/黑暗=14h / 10h，溫度 28 0C ；
[0125]共生培養(yǎng)基為:1 / 2MS培養(yǎng)基、馬鈴薯200g / L、蔗糖30g / L、松蘿汁50g / L、肌醇 80mg / L、瓊脂 15g / L，pH7 ；
[0126]4.菌根化組培苗的煉苗培養(yǎng)
[0127]提供類似3-5月份自然條件的生長環(huán)境進(jìn)行出瓶移栽；
[0128]A.自然光照下在瓶中煉苗8天；
[0129]B.將菌根化成功的組培苗從玻璃瓶中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，在0.1%的高錳酸鉀溶液中浸泡7分鐘后晾干栽種到塑料盆中，在溫度25°C、濕度60%和遮陽率為65%的條件下培養(yǎng)，第二天開始葉面噴灑清水，每天2次，每半個(gè)月追施營養(yǎng)液一次，煉苗期5個(gè)月；以噴霧處理維持空氣濕度及含水量，營養(yǎng)液的成分是含有磷酸二氫鉀和硝酸銨的水溶液，栽培基質(zhì)為經(jīng)121°C高壓滅菌2h的新鮮苔蘚，待苔蘚涼至常溫后用來種植；在石斛生長的過程中可以根據(jù)需要補(bǔ)施 液體菌根真菌。
[0130]實(shí)施例5
[0131]步驟1:共生真菌的分離及培養(yǎng)
[0132]A.共生真菌的分離與純化
[0133]采取野生石斛的生活根，在流水下沖洗5-10分鐘，并用毛刷去除表面附著物，然后放置于吸水紙上，用72 %酒精沖洗一下，無菌水沖洗3-5次后，0.1 %升汞溶液浸泡4.5分鐘，無菌水沖洗4次；把細(xì)跟切為0.05-0.3cm2的組織段接種到共生真菌培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:23°C，黑暗培養(yǎng)；當(dāng)切口邊緣長出真菌菌絲時(shí)，采用菌絲頂端純化法逐步純化獲得純菌株；
[0134]所述共生真菌培養(yǎng)基為:蔗糖15g / L、燕麥粉90g / L、松蘿汁130g / L、氯霉素
0.1g / L、磷酸二氫鉀9g / L、硫酸鎂Ig / L、酵母浸膏8g / L、瓊脂2g / L, pH值8,滅菌條件為:121°C、20分鐘；
[0135]B.共生真菌的發(fā)酵培養(yǎng)
[0136]將菌根真菌的斜面試管菌種活化后，轉(zhuǎn)接于共生真菌培養(yǎng)基中，于27°C恒溫培養(yǎng)25天，在菌落邊緣取小菌塊接入液體共生真菌培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；接入量按重量計(jì)為9% ;振蕩轉(zhuǎn)速250轉(zhuǎn)/分鐘，29°C暗培養(yǎng)50天。
[0137]步驟2.石斛組培苗的培養(yǎng)
[0138]A.原球莖和叢生芽的誘導(dǎo):取野生石斛當(dāng)年生具3-5個(gè)節(jié)的嫩芽，去除葉片后，在流水下沖洗5-10分鐘，在超凈工作臺(tái)上用70%的酒精浸泡2.5分鐘，再用0.1 %升汞溶液滅菌9分鐘，無菌水沖洗5次后，用無菌吸水紙吸干，剪取0.5-3厘米帶節(jié)的莖段，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)溫度25°C條件下，培養(yǎng)25天；光照度1000~2500Lx，光照12小時(shí)/天;
[0139]所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS、6-芐基嘌呤0.5mg / L、萘乙酸0.5mg / L、蔗糖35g / L、松蘿汁 150g / L、瓊脂 25g / L，pH8 ；
[0140]B.壯苗生根培養(yǎng):將利用莖段誘導(dǎo)的叢生芽增殖多代后，可將叢生芽切割成單個(gè)芽轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基I上培養(yǎng)30天，培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度為lOOOLx~3000LX，光照周期為光照/黑暗=14h / 10h，溫度29°C ;株高可達(dá)2cm以上時(shí)轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基2培養(yǎng)45天，培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度為2000Lx~3000Lx，光照周期為光照/黑暗=14h / 10h，溫度28°C ；
[0141]所述培養(yǎng)基I為:1 / 2MS、蔗糖35g / L、松蘿汁150g / L、香蕉35g / L、瓊脂20g / L, pH8 ；
[0142]所述培養(yǎng)基2為:1 / 2MS、蔗糖30g / L、松蘿汁180g / L、香蕉30g / L、活性炭8g / L、瓊脂 25g / L，pH8 ；
[0143]3.組培苗與共生菌共同培養(yǎng)
[0144]取共生菌液體菌種25%接種于共生培養(yǎng)基中，在29°C下暗培養(yǎng)7天后，再將組培苗接入共培養(yǎng)45天；
[0145]共培養(yǎng)條 件:光照強(qiáng)度為1000-3000LX，光照周期為:光照/黑暗=14h / 10h，溫度 23 0C ；
[0146]共生培養(yǎng)基為:1 / 2MS培養(yǎng)基、馬鈴薯150g / L、蔗糖30g / L、松蘿汁100g /L、肌醇 250mg / L、瓊脂 18g / L，pH9 ；
[0147]4.菌根化組培苗的煉苗培養(yǎng)
[0148]提供類似3-5月份自然條件的生長環(huán)境進(jìn)行出瓶移栽；
[0149]A.自然光照下在瓶中煉苗8天；
[0150]B.將菌根化成功的組培苗從玻璃瓶中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，在0.1%的高錳酸鉀溶液中浸泡8分鐘后晾干栽種到塑料盆中，在溫度25°C、濕度70%和遮陽率為65%的條件下培養(yǎng)，第二天開始葉面噴灑清水，每天2次，每半個(gè)月追施營養(yǎng)液一次，煉苗期10個(gè)月；以噴霧處理維持空氣濕度及含水量，營養(yǎng)液的成分是含有磷酸二氫鉀和硝酸銨的水溶液，栽培基質(zhì)為經(jīng)121°C高壓滅菌2h的新鮮苔蘚，待苔蘚涼至常溫后用來種植；在石斛生長的過程中可以根據(jù)需要補(bǔ)施液體菌根真菌。
[0151]試驗(yàn)例
[0152]取實(shí)施例1~5的所得石斛種苗各1000株按ZL200810233727.9所述方法種植，計(jì)算成活率，如下表1:
[0153]
【權(quán)利要求】
1.一種快速組織培養(yǎng)石斛種苗的方法，包括如下步驟: 步驟1:共生真菌的分離及培養(yǎng) A.共生真菌的分離與純化 采取野生石斛的生活根，0.1 %升汞溶液浸泡2-5分鐘，無菌水沖洗3-5次；切為`0.05-0.3cm2的組織段接種到共生真菌培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:20-30°C，黑暗培養(yǎng)；當(dāng)切口邊緣長出真菌菌絲時(shí)，采用菌絲頂端純化法逐步純化獲得純菌株； 所述共生真菌培養(yǎng)基為:葡萄糖或蔗糖10-40g / L、燕麥粉10-100g/L、松蘿汁1-15(^/1、氯霉素或青霉素0.001-18 / L、磷酸二氫鉀0.01-1Og / L、硫酸鎂0.01-1Og /L、酵母浸膏l(xiāng)-10g/L、瓊脂l-30g / L，pH4-9，滅菌條件為:121°C、20分鐘； B.共生真菌的發(fā)酵培養(yǎng) 將菌根真菌的斜 面試管菌種活化后，轉(zhuǎn)接于共生真菌培養(yǎng)基中，于20-30°C恒溫培養(yǎng)1-30天，在菌落邊緣取菌塊接入液體共生真菌培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；接入量按重量計(jì)為1-10%，振蕩轉(zhuǎn)速20-300轉(zhuǎn)/分鐘，20-30°C暗培養(yǎng)1-60天； 步驟2:石斛組培苗的培養(yǎng) A.原球莖和叢生芽的誘導(dǎo) 取野生石斛當(dāng)年生的嫩芽，用0.1 %升汞溶液滅菌2-10分鐘，無菌水沖洗3-5次后，剪取0.5-3厘米帶節(jié)的莖段，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)溫度10-30°C條件下，培養(yǎng)3-30天；光照度1000~2500Lx，光照12小時(shí)/天； 所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS、6-芐基嘌呤0.1-1Omg / L、萘乙酸0.1-lOmg / L、蔗糖10-40g / L、松蘿汁 20-200g / L、瓊脂 l_30g / L，pH4_9 ; B.壯苗生根培養(yǎng) 將叢生芽轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基I上培養(yǎng)5-50天，培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度為1000Lx~3000Lx，光照周期為光照/黑暗=14h / 10h，溫度20-30°C;株高達(dá)2cm以上時(shí)轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基2培養(yǎng)10-50天，培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度為2000Lx~3000Lx，光照周期為光照/黑暗=14h / IOh,溫度 20-30°C ； 所述培養(yǎng)基I為:1 / 2MS、蔗糖10-40g / L、松蘿汁20-200g / L、香蕉10_40g / L、瓊脂 l-30g / L，pH4-9 ； 所述培養(yǎng)基2為:1 / 2MS、蔗糖10-40g / L、松蘿汁20-200g / L、香蕉10_40g / L、活性炭 0.1-1Og / L、瓊脂 l-30g/L, pH4-9 ； 步驟3:組培苗與共生菌共同培養(yǎng) 取共生菌液體菌種I~30%接種于共生培養(yǎng)基中，在20-30°C下暗培養(yǎng)3-9天后，再將組培苗接入共培養(yǎng)10-50天； 共培養(yǎng)條件:光照強(qiáng)度為1000-3000LX，光照周期為:光照/黑暗=14h / 10h，溫度20-30 °C ； 共生培養(yǎng)基為:I / 2MS培養(yǎng)基、馬鈴薯100-300g/L、蔗糖20_40g / L、松蘿汁20-200g / L、肌醇 20-200mg / L、瓊脂 l_30g / L, pH4_9 ； 步驟4:菌根化組培苗的煉苗培養(yǎng) A.自然光照下在瓶中煉苗5-10天； B.將菌根化成功的組培苗從玻璃瓶中取出，在0.1 %的高錳酸鉀溶液中浸泡3-9分鐘后晾干栽種到塑料盆中，在溫度15-35°C、濕度40-80%和遮陽率為50-70%的條件下培養(yǎng)，煉苗期3-12個(gè)月；栽培基質(zhì)為經(jīng)121°C高壓滅菌2h的新鮮苔蘚，待苔蘚涼至常溫后用來種植。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的栽培方法，其特征所述步驟I為: A.共生真菌的分離與純化 采取野生石斛的生活根，在流水下沖洗5-10分鐘，并用毛刷去除表面附著物，然后放置于吸水紙上，用72%酒精沖洗 一下，無菌水沖洗3-5次后，0.1 %升汞溶液浸泡2-5分鐘，無菌水沖洗4次；把細(xì)跟切為0.05-0.3cm2的組織段接種到共生真菌培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:20-30°C，黑暗培養(yǎng)；當(dāng)切口邊緣長出真菌菌絲時(shí)，采用菌絲頂端純化法逐步純化獲得純菌株； 所述共生真菌培養(yǎng)基為:葡萄糖或蔗糖10-40g / L、燕麥粉IO-1OOg / L、松蘿汁l-150g/L、氯霉素或青霉素0.001-lg / L、磷酸二氫鉀0.01-10g/L、硫酸鎂0.01-10g/L、酵母浸膏1-1Og / L、瓊脂l-30g / L，pH4-9，滅菌條件為:121°C、20分鐘； B.共生真菌的發(fā)酵培養(yǎng) 將菌根真菌的斜面試管菌種活化后，轉(zhuǎn)接于共生真菌培養(yǎng)基中，于20-30°C恒溫培養(yǎng)1-30天，在菌落邊緣取小菌塊接入液體共生真菌培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；接入量按重量計(jì)為1-10% ;振蕩轉(zhuǎn)速20-300轉(zhuǎn)/分鐘，20-30°C暗培養(yǎng)1-60天。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的栽培方法，其特征所述步驟2的A為: A.原球莖和叢生芽的誘導(dǎo):取野生石斛當(dāng)年生具3-5個(gè)節(jié)的嫩芽，去除葉片后，在流水下沖洗5-10分鐘，在超掙工作臺(tái)上用70%的酒精浸泡1-3分鐘，再用0.1 %升汞溶液滅菌2-10分鐘，無菌水沖洗5次后，用無菌吸水紙吸干，剪取0.5-3厘米帶節(jié)的莖段，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)溫度10-30°C條件下，培養(yǎng)3-30天；光照度1000~2500Lx，光照12小時(shí)/天； 所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS、6-芐基嘌呤0.l-10mg/L、萘乙酸0.1-1Omg / L、蔗糖10_40g /L、松蘿汁 20-200g / L、瓊脂 l-30g / L，pH4_9。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的栽培方法，其特征所述步驟2的B為: B.壯苗生根培養(yǎng):將利用莖段誘導(dǎo)的叢生芽增殖多代后，可將叢生芽切割成單個(gè)芽轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基I上培養(yǎng)5-50天，培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度為lOOOLx~3000Lx，光照周期為光照/黑暗=14h / 10h，溫度20-30°C ;株高可達(dá)2cm以上時(shí)轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基2培養(yǎng)10-50天，培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度為2000Lx~3000Lx，光照周期為光照/黑暗=14h / 10h，溫度20-30 °C ； 所述培養(yǎng)基I為:1 / 2MS、蔗糖10-40g / L、松蘿汁20-200g / L、香蕉10_40g / L、瓊脂 l-30g/L, pH4-9 ； 所述培養(yǎng)基2為:1 / 2MS、蔗糖10-40g / L、松蘿汁20-200g/L、香蕉10-40g / L、活性炭 0.1-1Og / L、瓊脂 l-30g / L，pH4-9。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的栽培方法，其特征所述步驟4為: 選擇每年3-5月份為出瓶移栽的季節(jié)，或者提供類似3-5月份自然條件的生長環(huán)境進(jìn)行出瓶移栽； A.自然光照下在瓶中煉苗5-10天；B.將菌根化成功的組培苗從玻璃瓶中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，在0.1%的高錳酸鉀溶液中浸泡3-9分鐘后晾干栽種到塑料盆中，在溫度15-35 V、濕度40-80 %和遮陽率為50-70%的條件下培養(yǎng)，第二天開始葉面噴灑清水，每天2次，每半個(gè)月追施營養(yǎng)液一次，煉苗期3-12個(gè)月；以噴霧處理維持空氣濕度及含水量，營養(yǎng)液的成分是含有磷酸二氫鉀和硝酸銨的水溶液，栽培基質(zhì)為經(jīng)121°C高壓滅菌2h的新鮮苔蘚，待苔蘚涼至常溫后用來種植；在石斛生長的過程中可以根 據(jù)需要補(bǔ)施液體菌根真菌。
【文檔編號】A01H4/00GK103918552SQ201410024672
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年1月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月16日
【發(fā)明者】郭景龍, 潘啟仁, 吳小生, 劉焱晶, 陳春, 彭中勝, 王澤雨 申請人:貴州清控置業(yè)有限公司